이 작품은 NIH 연구 기금 K01AR053210, R01AR061484 및 국립 건선 재단의 교부금에 의해 투자되었다.

1. 참고 자료 효모 두 하이브리드 시스템은 단백질 - 단백질 상호 작용 16, 17 발견하는 데 사용하는 강력한 유전자 기법입니다. 이러한 lexA 기반 시스템, SOS 채용 시스템, 박테리아 또는 포유류의 세포 기반의 2 - 하이브리드 등 2 하이브리드 시스템의 여러 가지 사용 가능한 상업 있으며, 본 논문은 특히 가장 일반적으로 사용되는 GAL4 기반의 수정에 초점을 맞춘 효모 2 - 하이브리드 시스템입니다. 간단히, 방법은 DNA - 바인딩과 transcriptional 활성화에 대한 책임 분리 도메인으로 구성되어 효모 GAL4 단백질의 속성에 따라 달라집니다. 먹이의 단백질은 GAL4 활성 도메인 (AD)에 fusions로 표현하는 동안 미끼 단백질은 GAL4 DNA 결합 도메인 (DNA - BD)에 융합으로 표시됩니다. 미끼와 먹이의 융합 단백질 간의 상호 작용은 효모 g에 통합된 기자의 유전자를 포함하는 GAL4 결합 사이트 transcriptional 정품 인증으로 연결enome. Y2H의 원리는 그림 그림이다. 1과 실험 절차는 그림에 요약됩니다. 2. 2. 필요한 자료 및 솔루션 <ol><li> YPD 성장 매체 (대부분의 Saccharomyces cerevisiae의 변종의 성장을위한 최적의 비율로 펩톤의 조화, 효모 추출물, 그리고 덱스 트로 오스). </li><li> 최소 SD베이스는 (최소 합성 정의 (SD)베이스 효모 질소 기지, 암모늄 황산, 그리고 탄소 소스, 덱스 트로 오스를 포함합니다. 중퇴 (DO) 보충이 지정된 부족한 합성, 정의된 미디어를 만들기 위해 최소 SD베이스에 추가할 수 있습니다 영양분). </li><li> 레우 / - TRP 중퇴 (DO) 보충 (류신과 트립토판을 제외한 모든 필수 아미노산을 포함) </li><li> -His/-Leu/-Trp/-Ura 중퇴 (DO) 보충 (류신, 트립토판, 히스티딘, 그리고 유라실를 제외한 모든 필수 아미노산을 포함) </li><li> Luria 국물 (LB) (Tryptone 10g / L, 효모 추출물 5g / L, NaCl 5g / L) </li><li> 엑스- 걸 (5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - 인돌릴 - β - D - galactopyranoside) 솔루션 : N에서 20 MG / ML 주식 솔루션, N - Dimethylformamide로 준비 </li><li> 10X TE (100 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), autoclaved) </li><li> Sonicated 헤링이나 연어 정자 DNA, 삶은 (10 MG / ML) </li><li> 10X LiAc (1 M의 리튬 아세테이트, autoclaved) </li><li> 50% PEG - 3350 솔루션 필터 - 살균 </li><li> 3 - 아미노 1, 2, 4 - Triazole (3AT) </li><li> Kanamycin </li><li> 암피실린 </li><li> ELECTROMAX DH5α 세포 </li><li> Z 버퍼 : 16.1 g Na2HPO4 7H2O (또는 8.52 g 무수), 5.5 g NaH2PO4 H2O (또는 4.8 ganhydrous), 0.75 g KCl, 1 L autoclaved, 증류수에 용해하고 조정 0.246 g MgSO4 7H2O (0.12 g 무수), 산도 7.0. </li></ol> 3. 미끼 세대 (pDBLeu - PGRN) 신호 펩티드 (aa21 - 588)를 부족 cDNA 조각 인코딩 PGRN는 directionally, pDBLeu 벡터의 샐 I - 내가하​​는 사이트 (ProQuest 두 하이브리드 시스템, Invitrogen)에 복제되었습니다GAL4 DNA 바인딩 도메인과 같은 번역을 읽는 프레임 pDBLeu - PGRN를 생성하는 유지. <ol><li> 에서 프레임 융합을 허용하도록 제한 사이트 (3&#39;end에서 샐 5&#39;end에서 내가 아닌 나)를 포함하기위한 oligonucleotide primers를 사용하여 PCR하여 위에서 설명한 PGRN의 cDNA 조각을 증폭. </li><li> 젤 PCR 제품을 정화, 제한과 소화가 샐 내가 아니라 나도 endonucleases 동일한 제한 endonucleases 더블 제한 소화하여 DB 벡터 pDBLeu를 준비합니다. </li><li> 선형 pDBLeu 벡터에 제한 PGRN 조각을 Ligate 및 LB에 대한 선택과 DH5α로 변환 + kanamycin을 25 μg / ML에. </li><li> DNA 시퀀싱에 의해 구조의 수정을 확인합니다. </li></ol> 4. 플라스미드 미끼의 소규모 변환 <ol><li> 30 하룻밤 흔들, Mav203 (Invitrogen)의 식민지로 YPD 5 ML의 예방 ° C. </li><li> YPD 50 ML의 야간 문화를 희석. 추가 성장itional 2~4시간. </li><li> RT에서 5 분 3,000 rpm으로 펠렛은 세포. autoclaved, 증류수 40 ML의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 다시 펠렛 세포. 내가 RT 10 분에 품어 솔루션 2 ML에서 Resuspend. 솔루션 I : 0.5 ML 10xLiAc, 0.5 ML 10xTE 4 ML H 2 O </li><li> pDBLeu - PGRN로부터 2-3 μl (0.25μg/μl) 및 변성, 가지각색 연어 정자 DNA (10μg/μl) 10 μl : 튜브에 DNA를 분배. 100μl 효모 세포를 추가, 잘 섞는다. </li><li> 700μl 솔루션 II를 추가, 잘 섞는다. 30 ° C 30 분 알을 품다. 솔루션 II : 0.2 ML 10xLiAc, 0.2 ML 10xTE, 1.6 ML 50% PEG3350. </li><li> 42 열충격 ° 15 분 C. </li><li> 2 분을위한 펠릿. 뜨는 폐기하십시오. 200 μl autoclaved, 증류수의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 시리얼 dilutions와 SD - 레우 플레이트에 현탁액 플레이트. 2-3 일동안은 30 ° C에서 접시를 품어. </li></ol> 5. 미끼 검증 음침한를 수행하기 전에일 두 하이브리드 자동 활성화를위한 스크린 테스트 pDBLeu - PGRN 및 HIS3 리포터 유전자의 기초 표현 수준을 결정합니다. 이 테스트는 baits이 전사를 활성화 여부와 자기 정품 인증이 억제제에 의해 무력화 될 수 있는지 여부를 결정합니다. 3 - 아미노 1, 2, 4 - triazole (3 - AT)는 HIS3 - 유전자 제품의 경쟁력 저해제이며 히스티딘 - 결함 미디어에 성장에 필요한 HIS3 표현의 최소 수준을 적정하다하는 데 사용할 수 있습니다. <ol><li> 효모 Mav203 변형, 플레이트 SD - 레우 플레이트에 변화에 pDBLeu - PGRN를 변환, 그리고 30 48-72 H에 대한 품어 ° C. </li><li> 에 autoclaved 이쑤시개를 사용하여 각 변환의 패치 식민지 SD - 레우 - 그의 10 mm의 농도 3 - AT를 포함하는 접시, 25 MM, 50 MM, 75 MM, 100 MM. - AT 3 3 - AT의 존재에 성장할 수있을 것입니다 HIS3 효소와 자기 활성화를 전시에만 baits의 경쟁력 억제제이다. </li><li> 접시 containi의 성장을 미끼 종자3 - AT NG 100 MM은 두 하이브리드 화면에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 사용할 수 baits 들어, 세포 성장을 억제 농도 - 3 최저을 사용합니다. 대부분의 경우 3 - AT의 25 MM은 심사에 사용됩니다. </li></ol> 6. cDNA 라이브러리 심사 플라스미드 pDBLeu - PGRN는 위에서 설명한대로 소규모의 변환을 사용하여 MaV203에 소개됩니다. MaV203 (pDBLeu - PGRN)에 pPC86 라이브러리 (Invitrogen)를 소개하려면 절차는 일반적으로 플라스미드 도서관의 DNA 0.5 μg과 함께 ~ 4 X 10 4 식민지에게 제공 아래에서 설명. 따라서, 2.5 X 10 6 효모 transformants는 ~ 30.0 μg pPC86 - cDNA 라이브러리 플라스미드 DNA, 25 변환, 청명 10 cm 접시 (AT SD - 레우 - TRP, 그 우라 3)를 필요합니다. <ol><li> 접시 (아래의 절차 50)에 10 cm SD - 레우 - TRP, 그 우라의 3의 해당 번호를 준비합니다. 또한 transformants의 개수를 계산하는 데 최소 4 10 cm SD - 레우 - TRP 번호판을 준비합니다. </li><li> 로 라이브러리를 변환절차에 따라 pDBLeu - PGRN를 포함 MaV203은 아래 설명했다. <ol><li> ~ 100μl autoclaved, 증류수에 MaV203 여러 격리 식민지 (pDBLeu - PGRN)을 일시 중지하고 10 cm SD - 레우 플레이트에 그들을 확산. 두 번째 SD - 레우 플레이트에 대해 절차를 반복합니다. 30 18-24 H에 대한 두 번호판을 품어 ° C. </li><li> 긁어 완전히 10 ML autoclaved, 증류수에있는 세포를 일시 중지합니다. ~ 0.1의 OD 600을주기 위해 플라스크에 액체 YPD 매체의 500 ML에 세포 현탁액의 충분한 볼륨을 추가합니다. </li><li> OD가 접종 후 ~ 0.1 있는지 확인합니다. </li><li> OD 600 ~ 0.4 ° ​​C에 도달하기 전까지는 30 흔들어. </li><li> 신선한 준비 : <ol type="a"><li> 11 ML 10X TE, 11 ML 10X LiAc, 그리고 88 ML autoclaved 물을 결합하여 110 ML 1X TE / LiAc. </li><li> 1.6 ML 10X TE, 1.6 ML 10X LiAc, 그리고 12.8 ML 50% PEG - 3350를 결합하여 16 ML PEG / LiAc. </li></ol></li><li> 상온에서 5 분 3,000g에서 펠렛은 세포. </li><li> T를 삭제그는 supernatants 부드럽게 실내 온도 100 ML autoclaved, 증류수에 아래 pipetting 및하여 펠렛을 resuspend. </li><li> 상온에서 5 분 3천그램에서 원심 분리기. </li><li> centrifuged 세포의 표면에 뜨는을 취소하고 50 ML 1X TE / LiAc 솔루션 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 상온에서 5 분 3천그램에서 원심 분리기. </li><li> supernatants를 제거하고 2.5 ML 1X TE / LiAc 솔루션의 최종 볼륨의 펠렛을 resuspend. </li><li> 25 변환을 수행합니다. 2.5 ML 세포 변성 125 μl (10μg/μl), 가지각색 연어 정자 DNA, 30 μg cDNA 라이브러리를 결합합니다. 최대 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 15 ML PEG / LiAc 솔루션을 추가하고 부드럽게 섞는다. 25로 나누어지는 각 700 μl의 1.5 ML microcentrifuge 튜브를 autoclaved. </li><li> 30 ° C의 물을 욕조에 30 분 알을 품다. </li><li> 42 ° C의 물을 욕조에서 15 분 열충격. </li><li> 상온에서 1 분 6천g에서 원심 분리기. 조심스럽게 슈퍼를 제거natant. 부드럽게하고 위아래로 pipetting하여 400 μl autoclaved, 증류수 각 펠렛을 resuspend. </li></ol></li><li> 플레이트 단일 10 - cm SD - 레우 - TRP, 그 우라 세 AT (3AT 농도 : 25 ㎜)에 각 변형에서 200 μl 변환 혼합 확산 막대를 사용하는 접시, 그럼 25 1.5 ML microcentrifuge 튜브 50 접시를 만들 수 autoclaved (SD - 레우 - TRP, 그 우라의 3 AT). </li><li> 30 50~10일 ° C.에 대한 품어 접시 </li><li> SD - 레우 - TRP 플레이트에 도금되며, 반응의 변환 효율, 한 반응 (1:400과 1:4000 1시 40분)의 시리얼 dilutions을 측정합니다. 30 삼일 ° C, 콜로니의 수를 계산하고 계산 transformants의 총 번호 잠복기 후에. </li></ol> 7. X - 여자 분석 <ol><li> YPD 판에 식민지를 전송, 30 품어 ° C 하룻밤. </li><li> 장소는 YPD 접시에 Nitrocellulose 막을 반올림, 멤브레인 및 YPD 플레이트 사이에 거품이 없습니다 있는지 확인하십시오. 1-2 후에 분, mAKE 있는지 모든 식민지는 세포막 (nitrocellulose 종이)로 전송됩니다. </li><li> 알루미늄 호일 종이로 만든 보트를 타고 막 식민지 측면을 넣으십시오. </li><li> 액체 질소로 막을 올려, 몇 분 동안 액체 질소로 이십초, 그리고 잠수함을 기다립니다. </li><li> 해동에 멤브레인을 꺼내. </li><li> 한편 다음과 같은 시약을 혼합 : 1.5ml Z 버퍼 20μl X - 여자 (20 MG / ML) </li><li> Z 버퍼 / 배양 접시에 X - 여자, 그 위에 자리 워트 먼지 종이를 버려라. </li><li> 워트 먼지 종이 위에 nitrocellulose 종이를 조심스럽게 넣습니다. </li><li> 파란색 식민지가 나타날 때까지 37 °에서 품어. </li></ol> 8. Retransformation 분석 더 이상 잘못된 반응을 제거하고 추가를 용이하게 할 수 라이브러리 심사으로부터 격리 먹이 융합 단백질 (AD - Y)는 리포트 유전자를 유도하는 미끼 융합 단백질 (DB - X)와 상호 작용을 유지해야하며, 사냥감의 클론과 미끼의 retransformation는 누룩으로 구축itional 분석. <ol><li> 잠재적으로 상호 작용하는 단백질을 포함하는 효모 종자로부터 플라스미드 DNA를 분리. </li><li> E. 대장균에 유전자를 변형 DH5α 세포, LB 플레이트에 변형을 100 μg / ML 암피실린 플레이트 선택 pPC86 - cDNA 라이브러리를 분리하고, 37 하룻밤 부화 ° C. </li><li> LB로 100 μg / ML 암피실린의 국물을 넣어 접시에서 여러 식민지를 선택하십시오. </li><li> 나는 샐 아니라 I. 더블 제한 분석 DNA miniprep을 준비하고 검토 </li><li> MaV203에 플라스미드 먹이와 미끼는 플라스미드 공동 변환, 판 변형 SC - 레우 - TRP의 접시에 혼합하고, 30 2~3일 ° C.에 대한 부화 </li><li> SC - 레우 - TRP 플레이트의 세 가지 다른 식민지를 선택, X - 여자 분석을 수행합니다. </li></ol> 9. 시퀀싱 및 생물 정보학 분석 순서 가능성이 진정한 긍정적인 클론으로부터 격리되었다 플라스미드 DNA는 어쩌구를 사용하여 GenBank 사람들에게이 시퀀스를 비교ST 프로그램, 알려진 유전자에 해당하는 그 두 하이브리드 클론을 식별합니다. 시퀀싱 데이터는 위에서 얻은 12 반응의 두 세포 표면 TNFR2 (; 가입 # NM_130426 TNFRSF1B/CD120b)라고했다. 또한, PGRN와 TNFR 사이의 상호 작용은 고체 상 구속력을 분석, 공동 immunoprecipitation, 표면 plasmon 공명 분석 및 유동세포계측법 분석 14 체외에서 등 다양한 단백질 - 단백질 상호 작용 assays를 사용하여 확인되었다. 10. 대표 결과 심사의 플로우 차트는 그림에 설명되어있다. 3. 일반적으로 50-100 긍정적인 클론 후보는이 단계에서 얻은 것입니다. 우리는 처음 PGRN 미끼로 상영 2,500,000 transformants 중 54 긍정적인 클론 후보를 고립. 긍정적인 클론 후보는 다음 X - 여자 분석을 수행하여 검증되었다. 일반적으로, 약 50 % 거짓 긍정적인 클론은 X - 분은 분석을 통해 제거됩니다. 우리는 솔직한 23 긍정적인 클론을 획득<html> PGRN 미끼 (그림 4)에 대해이 단계에서 ates. 먹이의 클론과 효모에 미끼 구조의 Retransformation 추가 여전히 기자의 유전자 가능성이 진정한 반응을 나타내는 활성화 잘못된 반응과 클론을 제거합니다. 일반적으로, 약 50 % 긍정적인 클론 후보가 삭제됩니다. 우리는 마침내 효모에 PGRN와 상호 작용 12 긍정적인 클론을 분리. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig1.jpg" /> 그림 1. 효모 두 하이브리드 시스템에게의 원리 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig2.jpg" /> 그림 2. 효모 두 하이브리드 시스템을 사용 단백질 바인딩 파트너를 식별 파이프라인 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig3.jpg" /> 그림 3. 심사 효모의 플로우 차트 두 하이브리드 도서관.rge.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 이미지의 전체 크기 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig4.jpg" /> 긍정적인 클론 후보자의 그림 4. 베타 - 갈락토 분석. 라이브러리 화면에서 얻은 긍정적인 클론은 YPD 플레이트로 전송하고 30 ° C 야간에 incubated 있었다, B는 YPD 접시에 모든 식민지는 nitrocellulose의 점막에 전송 및 베타 - 갈락토 분석이 수행되었다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

효모 두 하이브리드 심사는 단백질 상호 작용 16, 17 식별에 효과적인 도구로 증명되었습니다. 에, 같은 생화학 공동 정화 및 단백질 칩, 효모 두 하이브리드 시스템이 비교적 간단한 실험 순서를 코딩 매우 높은 숫자를 검사에 사용할 수있는 민감한 유전자 접근 방식이므로 단백질 바인딩 파트너를 식별하는 다른 접근과 비교 또한, 그것은 생체내 상호 작용의를 감지하고 복잡한 단백질 정...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> ProQuest 두 하이브리드 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 10,835 </td></tr><tr><td> YPD 성장 매체 </td><td> Clontech </td><td> 630,409 </td></tr><tr><td> YPD 한천 배지 </td><td> Clontech </td><td> 630,410 </td></tr><tr><td> 최소 SD 한천베이스 </td><td> Clontech </td><td> 630,412 </td></tr><tr><td> - 레우은 보충 DO </td><td> Clontech </td><td> 630,414 </td></tr><tr><td> -Leu/-Trp은 보충 DO </td><td> Clontech </td><td> 630,417 </td></tr><tr><td> -His/-Leu/-Trp/-Ura은 보충 DO </td><td> Clontech </td><td> 630,425 </td></tr><tr><td> 3 - 아미노 - 1 ,2,4 - Triazole (3AT) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A8056 </td></tr><tr><td> Luria 국물 (LB) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> X - 걸 </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-034 </td></tr><tr><td> Sonicated 연어 정자 DNA </td><td> Stratagene </td><td> 201,190 </td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> AMRESCO </td><td> 0339 </td></tr><tr><td> Kanamycin 황산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11815-024 </td></tr><tr><td> Subcloning 효율성 ™ DH5α ™ 관할 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> 18265-017 </td></tr><tr><td> Trizma ® 기지 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T6066 </td></tr><tr><td> 리튬 아세테이트 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L4158 </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> ED </td></tr><tr><td> Nitrocellulose 막 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 162-0115 </td></tr><tr><td> 10 cm 배양 접시 </td><td> ITI 과학 </td><td> CT - 903 </td></tr><tr><td> 인큐베이터 (30 ° C) </td><td> ATR (Ecotron) </td><td></td></tr></table>

modified yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with the growth factor progranulin

또한 granulin epithelin 전구체 (GEP)로 알려진 Progranulin (PGRN)는, 593 - 아미노 산 autocrine 성장 요소입니다. PGRN 일찍 embryogenesis, 치유 1, 염증 2, 3 상처, 그리고 호스트 방위 사를 포함하여, physiologic 및 질병 프로세스의 다양한 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다. neurotrophic 요인 5, PGRN 단백질 원인 frontotemporal 치매 6, 7의 일부 손실 발생 PGRN 유전자의 돌연변이로 PGRN는 기능을 수행합니다. 최근 연구 연골 개발 및 열화 8-11의 중요한 조절기로 PGRN의 고립에 LED가있다. PGRN가 근 20 년 전에 발견하지만, 여러 생리 및 병리 학적 조건에 PGRN의 동작을 이용하여 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 노력을 현저하게 그 구속력 수용체 (들)을 식별하기 위해 무능력에 의해 방해되었을에 중요한 역할을 담당합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 modi을 개발얘기 들이었다 효모 두 하이브리드 (MY2H)은 가장 일반적으로 사용되는 GAL4 기반 2 - 하이브리드 시스템을 기반으로 접근. 종래의 효모 두 하이브리드 화면과 비교 MY2H 크게 화면 프로세스를 단축하고 거짓 긍정적인 클론의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이 있으며, 우리는 성공적으로 이온 채널 12, 세포외 기질 단백질 10, 13, 및 성장 인자 14 등 각종 baits의 바인딩 단백질을 분리하는이 시스템을 고용했습니다. 본 논문에서는, 우리는 최초로 알려진 PGRN - 관련 수용체 14, 15 TNFR2의 신분에 LED 예를 들어 PGRN를 사용하여 세부 사항이 MY2H 실험 절차를 설명합니다.

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Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.6K 조회수.  NYU Hospital for Joint Diseases. 우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.

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Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

This video demonstrates two methods for preparing and placing beads, which have been coated with growth factor, on explants of the developing cerebral cortex. These beads can be used to induce spatially restricted gene expression on developing neural tissue such as forebrain explants. Methods are given for using both Affi-Gel beads and heparin acryllic beads.

도설 Forebrain의 Explants에 대한 성장 인자 - 코팅 비드 배정

연구

생물학

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

랫 Splenocytes에서 T 세포 성장 인자 준비

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

캡처 복합 질량 분석 - 소설의 C 디 GMP 이펙터 단백질을 식별 할 수있는 강력한 도구

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...