저자는 기술 지원 소피아 튀김 감사합니다. 보조금 no.1659/08, 971 / 08, 1503년부터 1508년까지 및 10분의 491, 아니 보조금 보건 및 과학의 사역에 대한 이스라엘 과학 재단 : MBS는 자신의 연구 지원을 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다. 3-4114과 3-6540, 후반 알렉산더 Smidoda의 부동산을 통해 이스라엘 암 협회와 바이오 의약품의 우수성 부여에 대한 Taubenblatt 패밀리 재단.

1. T-세포의 형질 <ol><li> Nucleofector 솔루션 키트의 &quot;보충&quot;솔루션을 혼합하여 활성화 Amaxa Nucleofector 솔루션을 준비합니다. 활성화 된 솔루션은 3 개월까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 문화 매체 인 Jurkat T 세포를 증가 【10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 2 RPMI에서 mM의 L-글루타민]. 최적의 세포는 1-2주 해동 후 사용한다. 로그 성장 세포 배양을 사용하여 높은 형질 전환 효율과 세포의 생존을 위해 매우 중요합니다. 또는 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 기본 T 세포와 함께 사용할 수 있습니다, 앞에서 8을 설명했다. 그것은 기본 T 세포의 활성화 과정의 기간 더 긴 인 Jurkat T 세포 (~ 30 분)보다 것을 강조되어야한다, 현미경 단계 배양 시스템은 CO 2, 전역 습도와 온도를 유지하는 데 사용해야 장착 활성화 프로세스입니다. </li><li> 5 수집15 ML 튜브에 형질 전환 당 × 10 6 로그 상 T 세포. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리하는 동안 6 잘 플레이트를 준비합니다. 37 5 ML 문화 매체 및 사전 부화 각 형질에 대해 잘 하나를 채울 ° C. </li><li> 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상층 액을 버린다. 1 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리하는 동안 형질 솔루션을 준비합니다. 96 - 웰 플레이트 잘 하나, 찬란 태그 단백질을 코딩 관심 플라스미드의 5 μg의 DNA와 1 단계에서 제조 된 활성화 100 μl의 Amaxa Nucleofector 솔루션을 섞는다. 최적의 DNA 농도는 형질 솔루션을 희석 방지하기 위해 1 ㎍ / ㎖보다 커야합니다. </li><li> 부드러운 피펫으로 잘 섞는다. </li><li> 세포 원심 분리 한 후,주의 깊게 상층 액을 제거 D되지 동안펠렛을 isturbing. </li><li> DNA / 형질 전환 솔루션 두번을 피펫. </li><li> 펠렛의 DNA / 형질 전환 솔루션을 추가합니다. </li><li> Amaxa 큐벳에 세포를 전송합니다. </li><li> Amaxa Nucleofector 장치에 큐벳을 삽입합니다. </li><li> electroporation을위한 H-10 Amaxa의 형질 설정 (인 Jurkat) 또는 T-23 (기본 T 세포)를 사용합니다. </li><li> 인큐베이터에서 6 잘 플레이트를 제거합니다. </li><li> electroporation에 따라주의 깊게 파스퇴르 피펫을 사용하여 6 잘 플레이트에 세포 현탁액에 뜨는을 전송합니다. 세포 파편으로 구성된 펠렛이 형성 될 수 있습니다. 펠렛을 전송하지 마십시오. </li><li> 37 24 시간 동안 세포를 품어 ° C. </li><li> 새로운 우물에 각 우물에서 세포 현탁액의 2.5 ML을 전송합니다. 각 well에 2.5 ML 따뜻한 문화 매체 (2 단계에서 설명)를 추가합니다. </li><li> 72 시간 후 400 7 분 × g, 실온에서 대한 멸균 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다. 뜨는을 취소하고이를 위스콘신 교체사용되는 플라스미드에 적합한 포유류 세포 선택 항생제 (, 우리는 각각 1.3 밀리그램 / ML 및 / 또는 0.2 밀리그램 / ML의 농도 G418 및 / 또는 그로 마이신을 사용하는 데 사용되는 항생제에 적합한 농도를 적용) 보충 번째 배지. 신선한 잘있는 문화 세포 현탁액. 또한, 세포는 일시적으로 형질 전환 및 형질 전환 후 48 시간을 이미지 할 수 있습니다. 일시적으로 형질 전환 된 세포를 준비하려면 20 단계로 일반적으로 계속 8 단계에서 동시에 두 개의 플라스미드와 세포를 공동 형질하고 23 단계로 없습니다. 이 시나리오에서, 세포가 즉시 사용되어야합니다, 일반적으로 자신의 형광 강도는 이기종 반드시 높지 않다. </li><li> 적절한 선택 항생제가 첨가 배지로 세포를 성장. 세포를 분리하고 필요에 따라 항생제 첨가 배지와 함께 그들을 보충합니다. </li><li> 이주 후 FACS의 사용 (독감 성공적으로 형질을 확인로 orescence - 활성화 된 셀 정렬은) 다음 : </li><li> 10 6 형질 전환 세포 10 6 모의 형질 세포 (대조군), 그리고 안정적으로 찬란 태그 단백질을 표현하는 것으로 알려져있다 10 6 세포를 수집합니다. 세포가 하나 이상의 형광 단백질 (27 단계 참조) 형질 전환되는 경우에, 긍정적 인 컨트롤 등 여러 단독 태그 세포 라인을 사용합니다. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 500 μL FACS 버퍼 (PBS W / O 칼슘 2 +와 마그네슘 2 + 5 % FCS, 0.05 % 나트륨 아 지드)에있는 세포를 resuspend. </li><li> 세포의 형광을 확인 분석 FACS를 사용합니다. 부정과 긍정적 인 컨트롤의로 형질 전환 된 세포의 형광을 비교합니다. </li><li> 형질 전환 된 세포를 사용하여 추가, 찬란 태그 단백질의 단계를 반복 3-26과 세포를 형질합니다. </li><li> 형광의 높은 수준을 표시하는 셀이 사용되어야한다. 의 최적, 최소 50 %문화의 세포가 높은 형광해야한다. 세포의 형광 FACS를 통해 세포 분류에 의해 증가 될 수있다. </li></ol> 모든 추가 태그 단백질은 서로 다른 형광 물질에 융합되어야하며, 다른 선택의 항생제 인코딩 플라스미드에 인코딩. 하나 이상의 플라스미드로 형질 전환 된 세포를 선택하는 매체는 모든 적절한 항생제로 보충해야한다. 2. T 세포 확산 분석 준비 <ol><li> 실험실 테크 II 독일어 커버 글라스 시스템 4 챔버 슬라이드를 사용합니다. 실수로 준비 또는 사용 중 피펫 팁 예를 들어 챔버의 내부 표면, 스크래치하지 않도록합니다. </li><li> 50-ML 슬라이드 준비 솔루션을 준비 : 12 M (37 %), 염산 4.6 mL를 취하여, 38.5 ML 100 % 에탄올 6.9 ML 이중 증류수를 추가합니다. </li><li> 500 μL 슬라이드 준비 솔루션 슬라이드의 각 챔버를 채우십시오. </li><li> 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 챔버 흡입의, 완전히 건조. </li><li> ° C까지 완전히 건조 45 1 시간 동안 폭로 슬라이드를 품어. </li><li> 이중 증류수에 0.1 % 폴리-L-라이신 (시그마 - 알드리치)을 희석하여 0.01 % 폴리-L-라이신 솔루션을 준비합니다. </li><li> 각 챔버에 500 μl를 적용합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어. </li><li> 그들을 완전히 건조 챔버를 대기음. </li><li> ° C까지 완전히 건조 45 3 시간 동안 품어. </li><li> 코팅 된 슬라이드는 실온에서 몇 달 동안 건조 저장할 수 있습니다. </li><li> 활성화 항체 솔루션을 준비합니다. HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) 또는 UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 챔버 당 400 ㎕의 PBS에서 10 ㎍ / ㎖ 하나 : 항 CD3 항체를 사용합니다. 이 솔루션은 곧 슬라이드 준비하기 전에 준비를해야합니다. </li><li> 활성화 항체 용액 400 μL 각 챔버를 채우십시오. </li><li> 4에서 하룻밤, 바람직하게는 37 ° C 또는에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 ° C. </li><li> 활성화 항체 졸 제거ution 즉시 300 μL PBS로 두 번 실을 씻는다. 이 시점에서, 실이 버퍼로 가득 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ℃에서 PBS - 채워진 슬라이드를 저장 우리는 1 주 안에 준비된 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. T 세포 활성화 및 이미징 <ol><li> [1.25 ML의 HEPES (1 M) 10 ㎖ FCS, 38.75 ML RPMI 페놀 레드없이] 이미지 버퍼를 준비합니다. 이미지 버퍼는 4 ° C 후 여과에 저장할 수 있습니다. </li><li> 자이스 혈구 LSM 510 메타 현미경을 활성화합니다. 37 현미경 가열이 장착 프레임을 따뜻하게 ° C. &quot;전문가 모드&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;취득&quot;탭을 클릭하고 다음 탭을 엽니 레이저, 현미경, 구성, 검사, 시간 시리즈. </li><li> 필요한 레이저를 활성화합니다. MCFP 및 mYFP의 자극에 대한 다음 &quot;의&quot;5 분 &quot;대기&quot;로 아르곤 / 2 레이저가 설정합니다. </li><li> 당신은 같은 형광체를 사용하기 전에이 라이브 세포 이미징 분석을 수행 한 경우, 결과 LSM 파일을 열고, 나는 &quot;재사용&quot;을 클릭사기꾼, 9 단계에서 계속합니다. 그렇지 않으면 6 단계에서 계속합니다. </li><li> 사용 된 형광 단백질의 여기 및 방출에 대한 적절한 필터를 사용하여 채널을 정의합니다. </li><li> &quot;스캔 제어&quot;창에서, Z 스택 옵션을 선택합니다. </li><li> 0.5 μm의, 현재 조각 : 3; 슬라이스 번호 : 간격 5 다음 검색 매개 변수를 입력합니다. </li><li> 현미경 근처에 37 Accublock 디지털 건조한 목욕 (Labnet) ° C를 준비합니다. </li><li> 37 ° C.에 이미지 버퍼를 따뜻하게 </li><li> 따뜻한 이미지 버퍼 600 μL로 대체, PBS를 흡입하여 저장된 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 37 슬라이드를 품어 ° C. 13 단계까지 적어도 15 분 동안 인큐베이터에서 슬라이드를 유지합니다. </li><li> 5를 수집 × 10 5 형질 전환 된 T 세포를. </li><li> 400 × g에서 2 분간 세포를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 1 ML 따뜻한 이미지 버퍼에있는 세포를 resuspend하고, 1.5 ML 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> t를 놓고Accublock 디지털 건조한 목욕에 동부 표준시 관. </li><li> 인큐베이터에서 따뜻하게 슬라이드를 가지고, 예열 현미경 장착 프레임에 마운트합니다. </li><li> &quot;VIS&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 세포 현탁액을 혼합하고 1-2 μl를 제거합니다. </li><li> 슬라이드의 하단에 위의 이미지 버퍼에 피펫의 팁을 삽입합니다. 슬라이드가 긁히지 않도록. </li><li> 목표의 구멍에 씨앗 세포를. </li><li> 그들이 내려 가면 즉시 시각적으로 형광 세포를 추적을 시작합니다. 두 채널에서 높은 형광을 표시하는 셀을 선택합니다. </li><li> 셀이 슬라이드의 표면에 도달하기 전에, LSM 모드를 활성화합니다. </li><li> 단 하나의 여기 레이저를 전환합니다. 당신은 DIC 채널을 가지고있는 레이저를 선택합니다. </li><li> 1로 줌을 설정합니다. &quot;빠른 XY&quot;아이콘을 클릭합니다. &quot;정지&quot;아이콘을 클릭합니다. 자르기 도구를 사용하여 셀을 중심으로 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. </li><li> 3 줌을 설정합니다. &quot;빠른 XY&quot;아이콘을 클릭 한 다음 수동으로 최적의 셀을 볼 포커스를 설정합니다. &quot;정지&quot;ICO을 클릭N. </li><li> 모든 필요한 여기 레이저를 전환합니다. </li><li> &quot;StartT&quot;아이콘을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 이미지 확산 과정 (일반적으로 5 분)의 전체 셀을. 완료되면, &quot;정지&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 파일을 저장합니다. </li><li> 추가 세포를 획득하려면 &quot;VIS&quot;아이콘을 클릭합니다. 아직 슬라이드의 바닥에 접촉하지 않은 세포가있는 경우, 23 단계에서 계속합니다. 이미 확산 과정을 시작했습니다 이미징 세포를 피할 수 있습니다. 그렇지 않으면 32 단계로 진행합니다. </li><li> 관찰 슬라이드 영역이 세포의 대부분이없는 경우, 셀 (20 단계부터 계속합니다)의 또 다른 나누어지는을 추가합니다. 그렇지 않으면 33 단계로 진행합니다. </li><li> 추가 세포를 얻으려면 목적의 구멍 위의 영역이 세포의 결여되도록 슬라이드를 이동합니다. </li><li> 세포 (및 20 단계에서 계속) 다른 나누어지는을 추가합니다. </li><li> 원하는 모든 이미지를 수행 한 후, 저장된 LSM 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;갤러리&quot;, &quot;시간 + Z&quot;와 &quot;부분&quot;을 클릭합니다. </li><li> relevan을 선택t 시간 범위와 Z 스택. </li><li> 새 파일을 저장합니다. </li><li> 모든 이미지 파일에 대한 단계 35-38를 수행합니다. </li></ol> 4. 영상 데이터 분석 <ol><li> Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)를 사용하여 LSM 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;능가&quot;을 클릭합니다. &quot;이미지 프로세싱&quot;메뉴를 클릭하고 &quot;시간과 Z 스왑&quot;를 선택합니다. 이 이미지의 정확한 자르기에 도움이 될 것입니다. </li><li> &quot;편집&quot;도구 모음을 클릭하고 드롭 메뉴에서 &quot;자르기 3D&quot;옵션을 선택합니다. 세포를 둘러싸고있는 영역 만 포함하도록 이미지를 자르. 우리는 셀을 중심으로 300 × 300 픽셀의 사각형을 자르기 좋습니다. 세포의 모양과 위치가 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있습니다. t 축을 관찰하면 세포가 모든 시간 지점에서 자른 영역 내에 있는지 확인합니다. </li><li> &quot;이미지 프로세싱&quot;메뉴를 클릭하고 이미지의 원래 시간적 분리를 복원하는 &quot;시간과 Z 스왑&quot;를 선택합니다. </li><li> 기본 도구 모음에서 &quot;Coloc&quot;버튼을 누르십시오. &quot;데 시간 빌드를 선택P. Coloc. &quot;Imaris는 각 시점에서 각 채널에 대한 강도 임계 값을 계산합니다. </li><li> &quot;채널 통계&quot;를 선택하여 colocalization을 분석의 결과를 볼 수 있습니다. &quot;내보내기&quot;를 클릭하여 데이터를 내 보냅니다. </li><li> 각 군데 셀에 대해 6 단계를 반복합니다. 우리는 적어도 50 세포가 이러한 방식으로 분석하는 것이 좋습니다. </li><li> 평균 피어슨의 colocalization을 계수 및 표준 오류 또는 편차를 계산합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+and+T+cell+development.">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li><li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity.">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li><li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+tumour+antigens:+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer.">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li><li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition.">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li><li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation.">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li><li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network.">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton.">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li><li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosines+113,+128,+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity.">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li><li>Wunderlich, L., Farag&#243;, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes.">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li><li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization.">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization.">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li><li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).</li></ol>

우리는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.

여러 세포 프로세스의 규제 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성 및 종료에 따라 달라집니다. 현미경 영상은 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질의 실시간 추적을 할 수 있습니다. 태그 단백질의 colocalization을이 단백질 사이의 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 제안 할 수 있습니다, 그리고 면역 침전 등의 생화학 적 방법에 의해 얻어진 결과를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 적 ?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD3 (UCHT1 clone)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300432</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon FACS Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>345810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German coverglass system 4 chamber slides</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Bio Lab</td>
			<td>8410501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-306</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accublock digital dry bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>D1105A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S</td>
			<td>PeCon</td>
			<td>130-800-031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411860-9010-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence activated cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>FACSVantage SE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>7.0.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

전염성 질병에 대한 보호는 면역 시스템 1,2에 의해 중재된다. T 림프구는 여러 면역 세포 3,4의 활성화와 반응을 조절, 면역 시스템의 마스터 코디네이터입니다. T-세포의 활성화는 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 표시되는 특정 항원의 인식에 따라 달라집니다. T 세포 항원 수용체 (TCR)는 각 T 세포 클론에 특정한 항원 특이성 5를 결정합니다. 항원에 TCR의 바인딩은 TCR 복합 구성 요소의 인산화를 유도합니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해이 신호는 같은 TCR에 신호 단백질의 모집 등 다양한 중요한 응답을 시작, 막의 세포질과 핵 형질해야하며 APC 사이트 (면역 시냅스), 자신의 분자 활성화, 골격 재 배열, 세포 내 칼슘 농도의 상승, 유전자 발현 6,7의 변화. 에서 올바른활성화 신호의 itiation 및 종료 적절한 T 세포 반응을 위해 매우 중요합니다. 신호 단백질의 활동은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성과 종료에 따라 달라집니다, 이러한 단백질 인산화 단백질 복합체, 단백질의 ubiquitylation 다양한 휴대 사이트 8 단백질의 모집 형성으로 번역 수정을 게시 할 수 있습니다. T-세포 활성화 과정의 내부 동작을 이해하는 것은 면역 학적 연구와 임상 응용 프로그램 모두에 매우 중요합니다. 다양한 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었습니다, 그러나, 널리 사용되는 공동 immunoprecipitation의 방법으로 생화학 적 분석은, 따라서 세포의 역학에 대한 귀중한 통찰력의 관찰을 배제, 단백질의 위치가 식별 될 수 없습니다 메커니즘. 또한 이러한 대량 분석은 일반적으로 t의 다른 단계에있을 수있는 많은 다른 세포에서 단백질을 결합그는 세포 프로세스를 조사 하였다. 이 시간 해상도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 살아있는 세포의 실시간 영상의 사용은 따라서 공정 9,10의 역학에 빛을 흘리는, 단백질의 공간적 추적 및 시간적 신호 이벤트를 구별 할 수있는 능력을 모두 할 수 있습니다. 우리는 T 세포 활성화 중에 신호 복잡한 형성의 실시간 영상의 방법을 제시한다. 기본 T 세포 또는 인 Jurkat 같은 T - 세포 라인, 비 생리적 인 올리고머 11을 방지 단량체 형광 단백질에 융합 관심의 단백질에 대한 인코딩 플라스미드 형질 전환됩니다. 라이브 T 세포는 특정 활성화 항원에 대한 필요성을 극복하면서 T 세포의 활성화를 유도 CD3/TCR 복합체에 결합 T-세포 활성화 항체 8,9와 coverslip을 미리 코팅을 통해 삭제됩니다. 활성화 된 세포는 지속적으로 공 촛점 현미경의 사용으로 몇 군데 있습니다. 영상 데이터는 COL과 같은 정량적 인 결과를 산출하기 위해 분석신호 단백질의 ocalization 계수.

우리는 살아있는 T 세포 이미징 및 분석의 예를 제시한다. 영상 실험에 앞서, SLP76 결핍 T 세포 (J14)는 형광 단백질 (그림 1)의 발현을 결정하는 FACS의 사용으로 분석 하였다. 태그 신호 단백질 MCFP - NCK와 SLP76-mYFP로 형질 전환 된 T 세포는 활성화 슬라이드를 통해 입금 및 T 세포의 확산 (그림 2) 중 몇 군데 있었다. 수집 된 이미지 활성화 및 (그림 3) 확산을 통해 단...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation at JoVE.com

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation | Immunology and Infection | Video

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

13.6K 조회수.  Bar-Ilan University. 우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

비디오: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

연구

면역학 및 감염병학

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...