우리는 도움이 토론의 알토 연구소의 회원 감사드립니다. 우리는 또한 기술적 인 전문 지식과 조언을 UT 남서 의료 센터, 특히 박사 크리스 Gilpin, 톰 Januszewski, 그리고 로리 뮬러에서 분자 및 세포 이미징 시설 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 중요한 읽기에 대한 박사 Xionan 동 감사드립니다. 이 작품은 NMA에 NIH 보조금 AI083359에서 지원

1. 포유류의 세포 배양 <ol><li> 일반 쥐 신장 (NRK)는 (모든 시약에 대해 표 1를 참조하거나 셀 요리를 살고 부착 photoetched 유리 gridded coverslips에 자궁 경부암 (헬러), 또는 기타 적절한 포유류의 세포 라인 37 배양 아르 ° C, 5 % CO 2, 불후의 장치 DMEM + 10% FBS에)이 프로토콜에 사용하고 1% 펜 / 패 혈성. 주의 사항은 양식 포유류의 세포와 함께 작업 할 때 무균 환경을 유지하기 위해주의해야한다. </li><li> 실험 시간 선 (0~5시간 대 1~2일의 포스트 분사)에 따라 세포의 confluency는 ~ 50 %로 조정하거나 각각 25 % ~해야한다. </li></ol> 2. Microinjection <ol><li> ~ 50 μl의 최종 볼륨에, 세포 문화의 복종 할 의무에 따라, 버퍼의 선택 원하는 단백질, DNA, 또는 작은 분자를 준비합니다. 이러한 텍사스 레드, 캐스케이드 블루 등의 불활성 형광 염료microinjected 셀을 표시하기 위해 포함되어 있습니다, 사출 염료 및 형광 프로브의 선택은 겹치지 여기와 방출 파장이 있어야합니다. microinjection에 필요한 관심 분자의 농도는 경험적으로 결정되어야하고, 형광등 추적 염료는 일반적으로 0.5-1.0 MG / ML에서 사용됩니다. 일반적으로, rhodamine 또는 다른 형광는 covalently 감지하지만 다른 방법은 감도에 따라 사용할 수 있습니다, 상용 키트를 사용하여 귀하의 관심 분자에 부착된다. 자세한 내용은 아래 중요 고려 사항을 참조하십시오. </li><li> 0.22 μm 원심 필터를 통해 injectant (~ 50 μl)를 필터링 할 수 있습니다. 원심 필터는 진공 및 / 또는 죽은 볼륨을 연결 한 주사기 여과 선호하고 있습니다. </li><li> microinjection의 바늘을 생성하려면, 붕규산 유리 피펫은 불타는 브라운 Micropipette 풀러 다음 제조업체의 지침을 사용하여 뽑아 있습니다. 또한, microinjection바늘은 femtotip의 microinjection의 바늘하게 Eppendorf 등의 업체에서 구입하실 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 Eppendorf 20 Femtotips를 사용하여 microinjection의 바늘의 unmolested 끝으로 injectant 4 μl를 피펫. 더 거품이 당겨 microinjection의 바늘 내에 존재하지 있는지 확인합니다. 역 현미경에 부착 된 Eppendorf FemptoJet Injectman의 micromanipulator 암에 microinjection의 바늘을로드합니다. microinjection 절차의 좋은 검토, 독자는 시각화 실험 제 8의 이전 저널로 이동합니다. </li><li> 역 Zeiss 현미경의 요리 홀더에 gridded coverslip 및 배양 세포와 라이브 셀 요리를 놓습니다. photoetched 그리드 내에서 성장하는 세포를 찾아 격자의 영숫자 식별자를 참고, 다 다음 단계에 사용됩니다. 다음 단계는 coverslip의 가장자리에서 샘플 전송을 제한하므로 이상적으로, coverslip의 중심에 셀을 찾습니다. </li><li> 수동으로 낮은 주입 coverslip 위에 자리로 팔, 그리고 끝이 부드럽게 교양 세포와이 시점 이후 바늘의 움직임을 방지하기 위해 언론 &#39;제한의 표면을 만지는 때까지 micromanipulator 조이스틱 및 컨트롤, 낮은 사출 바늘을 사용하기 때문에 허약 한을 깨는 붕규산 유리를 꺼냈다. 셀 microinjection의 모든 다른 측면 Eppendorf FemtoJet InjectMan 사용자 설명서에 따라 수행됩니다. microinjection 기술은 최근에 박테리아가 9 개인 분비 독성 단백질을 이해하는 데 사용되었습니다. </li><li> 선택한 그리드 내의 모든 다른 셀을 Microinject. 세포가 ~ 50% confluency에서 성장으로, 하나는 600 μm이 그리드 당 ~ 80 셀 (예를 들어이 그림. 3A) 기대할 수 있습니다. 따라서, 형광 및 전자 현미경 검사시 ~ 30-40 실험 및 제어 세포의 N가있을 것입니다. </li><li> 원하는에 대한 포유류의 세포 배양 배양기에 다시 라이브 셀 요리를 놓으십시오시간은 실험 설정에 의해 결정. 또한, 하나는 이전에 고정이 관심의 특정 subcellular 구조의 모양을 기다리고 microinjection에서 시간 경과 현미경 분석에 직접 진행할 수 있습니다. </li></ol> 3. 형광 현미경 <ol><li> 원하는 경우, microinjected 세포의 라이브 셀 시간이 경과 형광 측정을 수행, 그 이후, 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4)에 2.5 %의 글 루타 알데히드와 미디어를 교체하고 실온에서 10 분에 품다. 라이브 셀 측정이 필요하지 않는 경우 그러나, 세포의 성장 미디어를 버리고 10 분 동안 실온에서 1xPBS 5 ML 3.7 %의 포름 알데히드로 세포를 해결할 수 있습니다. 정착액을 취소하고 5 ML의 1xPBS로 교체, 3.2 단계로 진행합니다. 참고 : 형광 현미경이 완료 때까지 글 루타 알데히드를 추가하지 중요합니다. </li><li> 형광 현미경의 photoetched gridded coverslip으로 라이브 셀 요리를 장소 (공 촛점이 생 필요하지 않습니다S 단계)과 세포의 배열 (그림 4A)를 문서화하는 5-10 시야하고 적절한 격자의 형광 이미지를 수집합니다. 불활성 분사 염료 (그림 4B)의 여기 및 방출 파장을 사용하여 microinjected 된 해당 셀을 식별합니다. 이 전자 현미경을 포함한 후속 단계에 microinjected 세포의 식별을 용이하게하기 위해 다른 배율 (예 : 10X와 65x)에서 이미지를 얻는 것이 중요합니다. </li><li> 공 촛점 형광 현미경을 사용하여 단계 위의 2.5에서 확인 된 격자 내에서 microinjected 세포의 Z-스택을 수집합니다. 높은 배율 (100x)는 전자 현미경에 표시됩니다 subcellular 구조와 형광 이미지를 상관 관계하기 위해 필요합니다. </li><li> coverslips는 상업적으로 이용 가능한 coverslip 제거 유체와 함께 라이브 셀 요리의 바닥에서 제거, 5 ML을 포함하는 처녀 세포 배양 접시에 세포 측을 배치됩니다1xPBS. 아래의 설명과 같이 coverslip 그런 다음 전자 현미경에 처리됩니다. </li></ol> 4. 전송 전자 현미경 <ol><li> 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4) 2 ML 2.5 %의 글 루타 알데히드와 1xPBS 버퍼를 교체하고 10 분 동안 실온에서 알을 품다. 더 이상 부화가 필요하지하면서, subcellular 구조의 유지에 도움이됩니다. 참고 : 혼자 포름 알데히드는 EM 분석을위한 충분한 정착액하지 않습니다. </li><li> cacodylate 버퍼 든 세 세차에 이어 30 분에 0.1 M cacodylate의 버퍼 2 ML 1 % 오스뮴의 tetroxide의 추가와 정착액 및 얼룩 세포를 제거하고 마지막으로 ddH 2 O.있는 모든 버퍼를 교체 </li><li> 표준 EM 프로토콜 후, 에탄올의 등급 (70 % ~ 100 %) 시리즈의 샘플을 탈수. Epon 수지가 채워진 튜브의 상단에 Epon 수지 및 장소 coverslip 세포 쪽을 준비합니다. 60에서 24 시간을위한 중합을 허용 ° C. photoetched gridded coverslip 셀 측 수행을 배치하여Epon 수지로 wn은 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포 모두 (예 그림. 3B) 중합 동안 Epon 수지로 전송됩니다. </li><li> 신속하게 액체 질소 및 / 또는 끓는 물에 immersing하여 Epon 수지의 coverslips를 제거합니다. 관심 격자를 (: 그리드 찰싹 찰싹 소리가 미러 이미지로 전송됩니다 주) 찾을 수 쌍안 해부 범위에서 수지의 표면을 검사합니다. 관심 만 그리드 Epon 수지 블록의 정점에 있습니다 있도록 아래 멸균 면도날이나 메스, 트림 Epon 블록을 사용합니다. </li><li> ultramicrotome 사용하여 원하는 두께 (단층 TEM에 대한 기존의 TEM 및 ~ 250 nm의 두께에 ~ 70 nm의 두께)에 다듬어 블록의 직렬 섹션을 습득. 표준 프로토콜에 따라 uranyl 아세트산과 리드 구연산과 대비 섹션을. </li></ol> 5. 상호 빛과 전자 현미경 <ol><li> 에 대한 관심의 세포를 재이미지를 사용하여 전자 현미경은 이전 단계에서 얻은. 관심되면 microinjected 세포가있는 한, 관심 있던 세포 내의 지역을 식별하는 고해상도 공 촛점 형광 이미지를 사용합니다. TEM을 사용하여 높은 해상도 이미지이 있습니다. 이러한 세포 주변과 형광 Z-스택 이미지 EM이 갈라에 해당하는 결정 핵 봉투와 같은 랜드 마크를 사용합니다. </li><li> 선택의 이미징 프로그램을 (예 : 이미지 J, 어도비 포토샵 등) 사용, 50 %로 형광 이미지의 불투명도를 줄이고 연결합니다되는 TEM 이미지에를 입혀 라. 규모를 조정 (비율을 제한하는 것을 잊지)과 TEM 이미지와 일치하는 공 촛점 이미지의 회전에 의해 이미지를 맞 춥니 다. 형광 이미지의 대비, 선명도 등을 정밀 조정 정렬에 도움이 될 수 있습니다. 참고 : 우리는 heterochromatin, 핵 봉투, 그리고 세포 주변이 도움이 할 수있는 훌륭한 랜드 마크를 나타낸다는 것을 발견했습니다두 이미지의 방향 인치 </li></ol> 6. 중요 고려 사항 <ol><li> 크게 주입 작은 분자를 찾는에 도움이 같은 Rhodamine 또는 Fluorescein 같은 형광 태그는 covalently 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 부착 할 수 있습니다. 추가 정보는 ectopically 전에 microinjection에 형광 subcellular 지방화 마커 단백질을 표현하여 얻은 수 있습니다. 따라서, fluorophores 및 불활성 microinjection 추적 염료의 선택이 중요합니다. </li><li> 가까운 coverslip의 중심에 준수하고 microinjection에 대한 셀을 선택하고 가장자리에 가까운 격자를 선택하지 마십시오. 이 관심의 세포 전자 현미경에 사용되는 Epon 수지로 전송하는 가장 큰 가능성을 제시합니다. </li><li> 세포의 Confluency 전S 중요한 완전히 합류 플레이트는 매우 어렵 전자 현미경에 microinjected 세포의 식별을 줄 것이라고 믿습니다. 오히려, 종자 세포들은 이러한 짧은 실험 당일 ~ 50% confluency에 도달하거나 이상의 날 (1-2 일) 실험에 ~ 25% confluency.하는 위치와 모양 세포의뿐만 아니라 방향에 랜드 마크와 같은 &#39;빈 공간 전자 현미경 이미지를 사용합니다. </li><li> 공 촛점 광학 슬라이스 두께는 실험의 요구에 조정해야하기 때문에 경험적으로 10 결정해야합니다. </li><li> fixatives의 포름 알데히드 및​​ 글 루타 알데히드는 가장 높은 등급의해야합니다. 포름 알데히드는 단백질과 작은 형광 분자 (예 : Rhodamine 또는 FITC 등) 모두의 형광 특성을 보존 아직 세포가 해결됩니다. 그러나, 구조가 높은 EM 해상도를 허용 보존되지 않습니다. 글 루타 알데히드는 analy EM에 대한 높은 수준의에 멤브레인과 subcellular 구조를 유지시스,하지만 크게 형광 방해합니다. 따라서 두 단계로 고정 모두 형광을위한 중요하고 EM 현미경. 최종 고정이 글 루타 알데히드 처리에 의해 수행 될 수 있으므로 포름 알데히드 고정 단계는 라이브 셀 측정을 수행 할 경우 생략 할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 이 절차는 직접 진핵 세포의 세포질에 관심있는 분자를 제공 및 멀티 나노 미터 해상도 mm에서 휴대폰 및 organeller 건축에서의 현지화 및 / 또는 효과를 모니터링 할 수있는 능력을 갖게. 실험 설정 및 절차의 개략도는 그림 2에 표시됩니다. 이 기술은 (그림 공 촛점 현미경 후 Epon 수지에 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포를 모두 양도 할 수있는 레이저 에칭 유리 gridded coverslip (그림 3A)에 성장 세포의 microinjection에 의존3B). 전형적인 microinjection의 클레멘 타인 절차는 상관이 때, subcellular 지방화와 ultrastructural 분석을 모두 허용 형광 이미지와 전자 micrographs를 산출. photoetched 유리 gridded coverslip에 성장 세포는 밝은 필드 이미지가 취득하는 후 관심있는 분자 (그림 4A)로 microinjected 있습니다. 불활성 추적 염료가 아닌 microinjected 세포 (그림 4B)에서 microinjected 세포를 구별 할 통합됩니다. 공 촛점 Z-스택은 형광 또는 관심 microinjected 작은 분자 (그림 4C)에 첨부 된 다른 식별자를 사용하여 얻을 수 있습니다. 샘플은 글 루타 알데히드로 고정하고 전자 현미경에 처리됩니다. 전자 micrographs들은 해당하는 셀 (그림 4D)에 취득과 중첩되어 있습니다. 형광 신호를 품고 영역은 (그림의 4E 높은 배율에서 더 상세하게 검사 아르 </STRONG&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. microinjection의 클레멘 타인 절차의 타임 라인. 실험 설정에 따라 microinjection 및 형광 측정은 같은 날에 수행 할 수 있습니다. 전자 현미경의 샘플을 준비하는 것은 긴 incubations 단계에 가장 많은 시간이 소요 때문입니다 후 2-3 일 지속됩니다. TEM 분석 및 전자 현미경 이미지 형광 신호를 상호 연관은 하루에 수행 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2 microinjection의 클레멘 타인 절차의 일반 그림 1 단계 :.. 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 세포를 찾아 관심 분자를 microinject 2 단계 :.. 시야 이미지 및 microinjected 세포의 공 촛점 형광 Z-스택을 모두 캡처 3 단계 : 준비EM에 대한 coverslip 분석하고 Epon 수지에 삽입 할 수 있습니다. 전송 그리드 패턴을 사용하여 관심 등 그 세포를 차단을 다듬 꼭대기에 있습니다 4 단계 :. ultramicrotome과 시리얼 부분을 잘라 5 단계 :. EM 이미지로 형광 이미지를 상관 관계. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="그림 3"/> . 그림 3 그리드 패턴은 관심 세포의 식별을 용이하게 패널은 ~ 50% confluency로 성장 세포의 microinjection을 묘사,. 격자 식별자 AK을 확인합니다. 스케일 바는 100 μm이다. 패널 B는 관심의 그리드가 해부 현미경에서 확인 후 순차적으로 sectioned 될 polymerized Epon 수지 블록 위에 coverslip에서 전송 격자 패턴을 보여줍니다. 패널 C는 sectioning에 대비 양도 그리드 패턴을 보여줍니다 . 전송 그리드 찰싹 찰싹 소리가 수지 블록에 역에 있습니다, scal전자 바는 1200 μm이다. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="그림 4"/> .. 그림 4 microinjection의 상호의 빛과 전자 ​​현미경의 대표 결과 패널은 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 NRK 세포의 밝은 필드 현미경을 보여줍니다, 화살표는 패널 CD에서 클레멘 타인에 의해 시각화 두 셀을 나타냅니다 패널 B의 형광을 보여줍니다. 불활성 추적 염료 때문에,이 경우에는 캐스케이드 블루, microinjected 된 셀을 식별하는 데 사용됩니다. 패널 C는 밝은 분야의 오버레이와 Rhodamine-라벨 작은 분자의 형광 서명을 보여줍니다. 여기에 표시된 두 개의 세포는 A &amp; B. 패널 D는 시야, 형광 및 전자 현미경의 클레멘 타인을 나타내는 패널의 화살표로 표시되며,. 화살표 머리 형광 puncta이 패널 E의 높은 배율의 이미지로 나타냅니다 스케일 바는 fol과낮은 : 패널 A &amp; B, 100 μm, C &amp; D, 50 μm, E, 100 nm의.

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	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

관심의 충돌이 선포되지 않습니다.

여기에 제시된 방법은 진핵 세포 세포질에 정화 단백질, 핵산, 또는 작은 분자의 직접 전송을 할 수 있으며 형광 및 전자 현미경의 상관 관계를 통해 초 고해상도 분석을 갖게. 이 방법의 사용은 단순하지만 강력한이 많은 기존의 핵심 시설 및 / 또는 적절하게 구비 전자 현미경 실험실와 함께 집에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 사용자가 실시간으로 휘황 태그 분자의 역학을 모니터링 할 수 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Photoetched Coverslip와 라이브 셀 플레이트 </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGR​​D </td><td></td></tr><tr><td> 텍사스 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> 캐스케이드 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 라벨 키트 </td><td> 열 과학 </td><td> 53,002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 μm 원심 여과 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리 피펫 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> 모델 P-97 </td><td> 램프 테스트를 수행 한 후에는 프로그램을 # 4를 사용 </td></tr><tr><td> FemtoJet의 Microinjection 시스템 </td><td> Eppendorf </td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslip 제거 유체 </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai 전송 전자 현미경 </td><td> 페이 </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

진핵 세포는 복잡한에 의존 높은 규제하고, 적절한 세포 기능에 필요한 생화학 극성을 보존 기능 뚜렷한 막 바인딩 된 구획. 효소, 단백질, 그리고 cytoskeletal 부품이 생화학 분리를 적용하고 유지하는 방법을 이해하는 것은 파라마운트 중요성을 따라서입니다. 휘황 태그 분자의 사용 또는 교란 subcellular 구획은 풍부한 지식이 나왔고 및 셀룰러 규제에 대한 우리의 이해를 전진했다와 / 현지화입니다. 이러한 형광 및 공 촛점 현미경 등의 이미징 기술은 비교적 간단 휘황 태그 작은 분자의 위치를 ascertaining 수 있도록 매우 작은 구조 그러나 해상도는 1 제한됩니다. 한편, 전자 현미경은 매우 높은 해상도로 subcellular 형태의 세부 사항을 발표했다 있지만 정적 자연은 어려운 매우 동적 프로를 측정 할 수 있습니다정밀도 2,3와 cesses. 따라서, 동일한 샘플의 전자 현미경, 칭했다 상호 빛과 전자 ​​현미경 (클레멘 타인) 4,5과 빛 현미경의 조합은, 전자 현미경 6 높은 해상도로 ultrafast 형광 이미징의 듀얼 장점을 갖게. 이 강력한 기술은 세포 생물학 5,7의 여러 측면을 연구 구현되었습니다. 처음 소개 된 이래,이 절차는 높은 해상도의 subcellular 구조와 morphologies를 구별 할 수있는 능력을 향상 시켰습니다. 여기, 우리는 클레멘 타인 (그림 1) 다음 빠른 microinjection을 수행하기위한 간소화 된 방법을 제시한다. microinjection의 클레멘 타인 절차는 직접 진핵 세포 세포질에 작은 분자 및 / 또는 단백질의 특정 수량을 소개하고 (그림 2) 멀티 나노 미터 해상도 mm의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 기술은 microinjecting을 기반으로합니다세포는 모두 공 촛점 형광 및 전자 현미경과 라이브 셀 요리와 이미지의 하단에 부착 레이저 에칭 유리 gridded coverslips에 성장. 관심 세포의 현지화 (들) 쉽게 (그림 3) 시료의 고정에 사용되는 Epon 수지에 이르기까지 관심의 세포와 함께 양도 및 이전 전자 현미경 분석에 sectioning되는 격자 패턴에 의해 촉진된다. 형광 및 EM 이미지의 중첩은 사용자가 subcellular 지방화뿐만 아니라 관심 microinjected 분자 (그림 4)에 의해 유도 된 형태학 및 / 또는 ultrastructural 변경 사항을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 microinjected 샘플의 특성에 따라 몇 시간이 ≤에서 5 초를 이르는 시간이 가리키는 의무가 있습니다.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K 조회수.  University of Texas Southwestern Medical Center. 클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

비디오: Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

연구

생물학

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

동시 형광 및 초미구조 보존을 위한 새로운 프로토콜

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

저자 스포트라이트: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation(형광 단백질 보존을 통한 상관 광 및 전자 현미경의 발전)

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.