The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.

1. 조직 해부 및 고정 <ol><li> 조직의 해부 <ol><li> 외과 적 절제 종양 생검 검체 또는 조직에서 조직 조각을 해부. 참고 :이 연구에 사용 된 조직이 일상적으로 포르말린에 고정하지만 신선한 조직에도 적합하다. 우리 일상 조직 학적 염색 및 항 - 소마토스타틴 면역은 (미도시) 이후 소마토스타틴 종양을 포함하는 해부학 적 병리학 자에 의해 확인되고보고 영역을 선택 하였다. </li><li> 약 1.0 mm 3 이하 더 큰 조직 조각을 사용합니다. </li></ol></li><li> Cacodylate 버퍼 준비 <ol><li> 나트륨 cacodylate 21.4 g을 첨가하여 스톡 완충 용액 (1 M)을 준비한다 (자재 목록 참조) 및 90 ml의 증류수 후 100 ㎖의 최종 부피로 용액을 토핑 3.0 ml의 % 1 염화칼슘 용액. 솔루션을 저어 결정 시약이 완전히 용해되도록 밤새 정치를 둡니다. </li><l난&gt; 표시등 스트립 pH를 확인 후, 물 170 ml의 원액 20 ㎖를 첨가하여 솔루션을 작업 버퍼를 준비합니다. 3 % HCl 4 방울 - (3)을 첨가하여 7.4로 pH를 조정한다. 0.1 M. 최종 몰 농도로 200 ml의 최종 부피로 용액을 최고 </li></ol></li><li> 정착액 준비 및 사용 <ol><li> 나트륨 cacodylate 원액 (1 M) 20 ㎖에 50 % 글루 타르 알데히드 용액 한 10 ㎖의 앰플을 추가합니다. 190 ml의 증류수와 최고. pH를 확인하고 1 추가하여 7.4로 조정 - 3 % 염산 (HCL) 필요한 경우 4 방울을. </li><li> 200 ml의 최종 부피를 증류수와 상단. </li><li> 유리 샘플 튜브에서 4 ℃로 24 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4에서 2.5 % 글루 타르 알데히드를 함유하는 고정액으로 조직을 담근다. 일주 후 사용되지 않는 정착액을 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 조직 처리 및 포함 <ol><li> 오스뮴 테트xide 염색 <ol><li> 정착이 완료되면, 그 다음 20 분 동안 cacodylate 나트륨 완충액 (0.1 M)의 조직 몰입을 또 다른 20 분 동안 반복한다. </li><li> 최종 부피를 나트륨 cacodylate 버퍼 스톡 용액 (1 M)의 2.0 mL의 증류수 10.0 ml의 5 % OSO 4 원액 8.0 ㎖에 첨가하여 용액을 작업 2 % 수성 산화 오스뮴 (OSO 4)를 준비 20.0 ml의. </li><li> 버퍼는 그 다음 실온에서 4 시간 동안 pH 7.4의 4에 OSO 2 %의 조직 몰입 제거한다. 경사와 오소 네 솔루션을 준비 할 때주의! 항상 흄 후드에서 적절한 개인 보호 장비와 작업을 착용주의하십시오. </li></ol></li><li> 우라 닐 아세테이트 염색 <ol><li> 조직 osmication가 완료된 후 OSO 4 용액을 제거하고 10 분 동안 2 %의 아세트산 나트륨의 조직 몰입. 2 % 아세트산 나트륨 후 1 시간에 대해 2 % 우라 닐 아세테이트에서 몰입 삭제실온. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 등급 알코올을 통해 조직을 탈수. 10 분간 실온에서 20 분마다 100 %의 에탄올이 변화를 10 분, 95 % 에탄올을 10 분, 50 % 에탄올, 70 % 에탄올을 사용한다. </li><li> 30 분마다 100 % 아세톤이 변경을 수행합니다. </li></ol></li><li> 수지 함침 및 경화 <ol><li> 일회용 폴리에틸렌 컵에 저점도 에폭시 수지를 혼합한다. 비닐 사이클로 헥센 이산화탄소 (ERL 4221) 에폭시 모노머 10.0 g, 폴리 프로필렌 글리콜 디 글리시 딜 에테르 6g (DER 732) 및 노네 숙신산 무수물 (NSA)의 26.0 g을 추가합니다. 2 분 동안 나무 막대기를 사용하여 손으로 잘 저어. </li><li> 2- 디메틸 아미노 에탄올 (DMAE) 에폭시 가속기의 다섯 방울을 추가하고 2 분 동안 다시 저어. 완전히 DMAE 가속기를 추가하기 전에 ERL, DER 및 NSA 구성 요소를 혼합주의하십시오. </li><li> 수지 1 : 1과 100 % 아세톤으로 교체하여 조직의 수지 함침을 시작3 시간 동안 아세톤 1 수지 밤새 마지막으로 100 % 수지 : 아세톤 1 시간 후, (6)으로 대체. </li><li> 8mm의 micromoulds에 신선한 수지에 조직을 전송합니다. 70 O를 C 하룻밤에 치료. 수지는 강하고 경화 후 취성하지해야합니다. </li></ol></li></ol> 3. Ultramicrotomy <ol><li> 칼, 절단 매개 변수 및 섹션 두께 <ol><li> 을 Ultramicrotome에 semithin 다이아몬드 나이프를 놓고 500 nm의 두께로 조직에서 섹션을 잘라. </li><li> 나이프 에지 뒤에 물을 욕조에 섹션을 플로트. 유리 슬라이드에 섹션을 들고 C. O를 약 110 핫 플레이트를 사용하여 10 ~ 20 초 동안 그들을 건조 </li><li> 20 초 동안 나트륨에 톡 시드 용액으로 섹션을 에칭 한 후 100 % 에탄올 다음 증류수로 씻어 내십시오. 열판에 20 초 동안 1 %의 붕사 블루 2 % 메틸렌와 얼룩, 5 초 동안 핫 플레이트에 5 초 동안 수돗물을 실행하고 건조 씻어. 그리고 스테인레스n은 20 초 동안 열판에 다음 건조 5 초 동안 핫 플레이트에 1.5 %의 기본 푹신와. </li><li> 밝은 장광 현미경으로 검사하고, 종양 세포 및 ROI (region of interest)를 확인하여 단면에 존재한다. </li><li> 초박형 다이아몬드 나이프에 semithin 다이아몬드 칼을 변경하고 칼 제조업체에서 권장하는 올바른 칼 각도 및 절단 속도를 설정합니다. </li><li> 90 나노 미터 두께로 얇은 부분을 잘라. 수조에 떠있는 부분의 골드 착색을 준수하십시오. </li><li> 스트레치 섹션의 수 밀리미터 내의 여과지 1cm 2 조각에서 클로로포름 증기를 흔들어 섹션 평탄화. 수면에 접촉 클로로포름 적신 종이를 가지고 않도록주의. </li></ol></li><li> 얇은 섹션 그리드 실장 <ol><li> 섹션 adhesiv에 침지 된 300 메쉬 얇은 바 니켈 TEM 격자를 사용하여 물 표면에서 얇은 섹션을 들어 올려전자 솔루션입니다. 그리드의 무딘면에 섹션을 찾습니다. 그리드는 일측 및 타측에 연마 또는 광택면에 무딘 또는 무광택 표면을 갖는다. 더지지 필름이 필요하지 않습니다. 참고 :이 집게에 부착 그리드를 방지하기 위해 안티 - 자기 집게 이러한 그리드를 처리 할 필요가있다. </li><li> 아세톤 2.0 mL를 바이알 ㎖로 5에서 명확한 접착 테이프 20cm 배치하여 부 접착제를 준비한다. 캡과 병을 흔들어는, 접착제 솔루션을 떠나는 테이프를 제거 후 10 분 동안 서 보자. </li></ol></li></ol> 4. Immunolabeling <ol><li> 항원 폭로 <ol><li> 증류수 신선한 나트륨 포화 메타과 요오드 산 에칭 용액 1 ㎖를 제조하고 즉시 사용. 깨끗한 labfilm 표면에 에칭 용액의 장소 방울. </li><li> 실온에서 30 분 동안 내려 메타과 요오드 산 나트륨 용액 방울이 부분으로 완전히 건조 그리드를 놓는다. 증류수 데서에 그리드로 이동세탁 60 초 동안 plets. </li></ol></li><li> 항체 배양 및 QD 프로브 라벨링 <ol><li> 깨끗한 파라 필름 표면에 배치 솔루션의 방울의 모든 배양 및 라벨링을 수행합니다. </li><li> 섹션에 잔류 알데히드를 차단하는 10 분간 PBS에서 0.05 M 글리신의 물방울에 그리드를 배치합니다. 간단히 그리드의 가장자리를 모래 바닥하여 알데히드 블록을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 PBS에 1 % 정상 염소 혈청 (NGS) 및 1 % BSAC (10 %)의 방울에 그리드를 배치합니다. 1000 μL의 최종 용적을 수득 NGS 및 10 ㎕의 PBS 중 890 ㎕의 BSAC에 100 ㎕를 첨가하여 차단 용액을 제조 하였다. </li><li> 10 분 동안 항체 희석제의 물방울에 배치하여 섹션을 조건입니다. </li><li> 항체 희석은 3.47 g / L의 농도를주는 1시 10분 희석 된 항 - 소마토스타틴 폴리 클로 날 항체를 사용하여 immunolabeling 배양을 수행한다. 참고 : 항체 배양이 객실 temperat에서 1 시간 동안 방울에 그리드를 배치하여 수행됩니다촉촉한 챔버에 URE. </li><li> 다음 2 × 5 분 동안 희석제에 섹션을 씻어 그리드의 가장자리를 모래 바닥으로 단계 4.2.5에서 항체 시약을 제거합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 1:10 희석 된 이차 항체 (바이오틴 화 된 염소 항 - 토끼 폴리 클로 날) 부화. 이차 항체 용액을 제거합니다. 2 × 5 분 희석제에 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 1:10으로 희석 된 스트렙 타비 딘 컨쥬 게이트 양자점 (585 ㎚)에서 부화. 배양 중에 노광을 줄이기 위해 알루미늄 호일로 커버. </li><li> 2 분 동안 신선한 증류수에 그리드를 씻으십시오. 그리드 건조의 가장자리를시킨다. </li></ol></li></ol> 5. 형광 빛 현미경 <ol><li> 광원 및 필터 큐브 <ol><li> 넓은 필드 형광 빛 현미경에 대한 365 nm의 발광 다이오드 (LED) 조명을 사용합니다. 다음과 같은 특성을 가진 필터 큐브를 삽입합니다 (예 G 365 nm의, BS FT (395) 및 EM LP 420 ㎚). 참고 :이 필터 큐브 w병의 모든 양자점의 발광 스펙트럼은 동일한 여기 파장에 따라 동시에 가시화 될 수 있도록 크기. </li></ol></li><li> 보기 및 이미지 섹션 <ol><li> 물 한 방울에 다운 유리 슬라이드에 면역 염색 그리드 섹션을 놓고 유리 커버 슬립 (두께 번호 1.5)으로 커버. 표지 패턴, 비 특​​정 라벨의 수준을 평가하기 위해 광학 현미경을 사용하는 음성 대조군이 라벨링 명확 확립. </li><li> 그리드 바 관련 투자 수익 (ROI)을 확인합니다. 파인더 그리드 대상 구조물의 좌표를 확립하는데 도움이 될 수있다. </li><li> &quot;FL 자동 컬러&quot;를 3,200K로 설정 &quot;화이트 밸런스&quot;에서 카메라 설정으로 풀 컬러 디지털 카메라를 사용하여 섹션에 긍정적 인 라벨의 이미지를 획득. 1 배에서 설정 한 이미지의 모양과 &quot;아날로그 게인&quot;을 최적화하기 위해 0.45와 1.00 사이에 &quot;감마&quot;설정으로 &quot;자동 노출&quot;모드에서 카메라를 사용합니다.&quot;라이브&quot;다음 이미지를 초점 프레임 스토어에 이미지를 캡처 &quot;스냅&quot;를 클릭하여 선이 라이트 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 카메라 아이콘을 클릭합니다. </li><li> 이 .tif가 압축 및 픽셀 레이션이 분명 해지고 방지하기 위해 파일로 이미지를 저장합니다. </li><li> 그리드 바 또는 다른 중요한 조직의 랜드 마크와 관련하여 투자 수익 (ROI)의 위치를​​ 나타내는 인쇄를 준비합니다. 이러한 인쇄는 후속 섹션의 이동 및 재 찾는 투과 전자 현미경 (TEM)에서의 ROI를 위해 유용 할 것이다. </li><li> 슬라이드에서 그리드를 제거 증류수에 씻어 부드럽게 가장자리가 건조시킨다. 참고 : 형광 이미지를 얻기 위해 지나치게 강한 조명을 사용하지 마십시오. 양자점의 광 안정성 몇 초까지의 영상 시간을 허용하지만, QD 신호의 담금질 물에 약 1 분 후 발생할 수있는 노출을 연장하지 않도록주의. QD이 섹션은 톨루엔과 탈수 표시 할 때 확장 또는 영구적 광 안정성 만 얻어지고,제조업체의 사양에 따라 커버 슬립 아래에 내장. 그러나,이 프로세스는 TEM에 의해 동일 구간의 상호 진단의 가능성을 배제한다. </li></ol></li></ol> 6. 투과 전자 현미경 <ol><li> TEM 설정 위보기 <ol><li> 100 kV로의 가속 전압을 사용하여 검사를 위해 TEM에 그리드를 전송합니다. 그리드 주위를 탐색하고 광학 현미경의 전망과 상관 로아를 찾기 위해 약 1,400X의 낮은 배율을 사용합니다. 50,000 배 주위 배율에서 양자점의보기 클러스터. </li><li> 개별 양자점 70,000X 확대에 이상을 준수하십시오. 보통 전자 밀도와 불규칙한 결정 구조와 양자점을 준수하십시오. </li></ol></li><li> 영상 <ol><li> TEM 영상을위한 디지털 카메라를 사용합니다. 흑백 1,392 X 1,040 픽셀 센서가 적합합니다. </li><li> MICR에 &quot;온&quot;에 &quot;카메라&quot;아이콘을 클릭하여 이미지를 수집다음 &quot;Off&quot;로 프레임 스토어에 이미지를 저장하려면 이미징 소프트웨어의 그래픽 인터페이스를 oscope. 주의 : 이러한 조작은 사용되는 현미경 시스템에 따라 달라질 것이다. 1.00의 &quot;감마&quot;설정과 자동 노출 모드에서 카메라를 사용합니다. </li><li> .tif 파일로 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 7. 클레멘 타인 이미징 <ol><li> TEM에 의한 형광 ROI 찾기 <ol><li> TEM에 의해 ROI를 해당 찾으려면 광학 현미경 이미지에서 인쇄를 사용합니다. 이러한 혈관 내강 구조로 조직 아키텍처 기능은 TEM을 사용하여 섹션 주변 탐색에 유용하다. </li><li> TEM에 의해 해당 ROI의 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li><li> 클레멘 타인의 이미지 오버레이 <ol><li> TEM에 이미지가 제대로 광학 현미경 이미지로 지향되어 있는지 확인하고 각 양상에서 볼 수있는 동일한 구조가 같은 크기가되도록 각의 확대를 수정합니다. </li><li> 동양빛 현미경과 TEM 이미지를 먹었고, 그들이 나란히 또는 immunolabeled 로아의 미세 기능을 강조하는 오버레이로 표시됩니다. </li><li> 포토샵 CS2를 사용하여 오버레이 이미지를 만듭니다. 먼저, 저전력 TEM 화상과 동일한 배율로 형광 이미지를 확대. 두 이미지의 방향을 다음 하나의 캔버스에 나란히 그들에게 측면을 붙여 넣습니다. </li><li> 이미지를 평평하게. </li><li> 이 합성 이미지에서 형광 오버레이를 만듭니다. 은 &quot;사각형 선택 윤곽 도구&quot;를 클릭 형광 이미지를 선택하고 그것에서 중복 된 레이어를 만들 수 있습니다. </li><li> 40 % 투명도 - 30 &quot;옵션을 혼합 / 레이어 스타일의&quot;를 조정합니다. </li><li> 은 &quot;이동 도구&quot;를 클릭하고 해당 TEM 이미지를 통해 형광 오버레이 레이어를 드래그합니다. 이미지를 맞 춥니 다. </li><li> 정렬을 달성 한 후, 최종 합성 이미지를 생성하기 위해 층을 &quot;결합&quot;. </li><li> 새로운 오버레이 이미지 a를 선택하기 위해 &quot;사각형 선택 윤곽 도구&quot;를 사용차 새로운 캔버스에 복사합니다. .TIFF 파일로이 저장합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors have no conflict of interest to disclose.

이 연구는 클레멘 타인의 연구를위한 범용 프로브로 양자점의 잠재적 인 유틸리티를 보여 주었다. 위드 광학 현미경으로 볼 수 있고 쉽게 TEM으로 관찰 할 때 사용하는 585 나노 양자점 나노 입자는 밝고 안정된 형광을 보였다. 본 저자 중 한 명으로 이전의 연구는 또한 초 고해상도 광학 현미경 (7)에 적합하도록 양자점을 보여 주었다. 이들의 광 안정성 확장 시청 기간과 긴 영상 노출에 특?...

라이트 - 상관 및 전자 현미경 (클레멘 타인)의 과도 동적 이벤트 한 희귀 이벤트 2, 3, 4 복잡한 시스템의 분석을위한 강력한 방법이다. 질문에 따라 5 사용할 수 많은 다른 기술 순열 요청을 받고 있습니다 그러나 일반적인 요구 사항은 단일 샘플 6 동일한 구조가 여러 현미경 양식에 의해 촬영되어 있다는 것입니다. 클레멘 타인에 대한 우리의 특정 접근 방식은 보관 인간의 병리 조직의 연구 잘 특징과 7 이전에 게시 된 여기에 사용되는 경우에 개발되었다. 목적은 초 미세 구조 레벨에서 나타나는 면역 세포 표지 패턴의 내용을 명확하게하는 데 도움 형광 광학 현미경을 사용하여, 두 번째 단일 또는 외과 생검 샘플로부터 분석 된 데이터를 최대화하기 위해, 우선이었다. 양자점 나노 입자 (양자점)이 범용 마커 시스템 ABL의 가능성을 제공한다E는 모두 볼 수 있도록, 형광 광학 현미경 및 전자 현미경 (8, 9), (10). 이들 결정질 코어 구조들은 발광 스펙트럼 (11)까지의 파장의 광에 의해 여기 될 때 다른 크기의 양자점 형광 발광 피크의 넓은 범위를 생성 할 수있다. 이들 원자량은 투과형 전자 현미경, 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 또는 전계 방출 주사 전자 현미경으로 검출 가능한 전자 밀도를 수득하기에 충분하다. 심지어 하나의 양자점이 표적 분자 (12) 당 하나의 QD의 궁극적 인 감도를 제공 관찰 할 수 있으므로 그들은 특히 면역 세포 화학 연구에 적합하다. 또한, QD에 따라 그들이 매핑 적합한 개별 원소 서명을 가지고 사용될 수있다. 인간의 병리 샘플 번역 생물 의학 연구에 상당한 이점을 제공합니다. 수술 조직 및 생검 샘플을 정기적으로 biobanking과 approp로 제출riate 윤리 간극은 조사 연구에 액세스 할 수 있습니다. 인체 조직은 동물이나 질병의 체외 모델에서 발생할 수있는 관련성 또는 해석의 문제가 발생하지 않습니다. 그러나, 병리 샘플 시료 준비는 종종 최적이 아니다. 조직 지연 정착액에 배치되어있을 수 있습니다 부적절한 정착는 TEM 부적절한 샘플링 포르말린이 아닌 글루 타르 알데히드로 사용된다. 클레멘 타인 방법은 단일 샘플로부터 인간 가능한 진단 및 예후 정보를 최적화하기위한 가능성을 가지고있다. 그러나, 미니 중항 산소 발생기 (miniSOG)를 이용하는 것과 같은 몇몇 새로 개발 상호 접근 인해 태그 관심 유전자 (13)의 셀에 부호화해야 할 필요성에 병리에서 사용할 수 없다. 이러한 이유로 우리는 상호 면역 세포 화학 연구에 일상적으로 준비 TEM 조직의 QD 라벨의 유틸리티를 살펴 보았다. 양자점은 에칭 에폭시 또는 리에서 아크릴 수지 섹션에 적용ghtly 알데히드 고정 생검 조직 샘플은 하나의 샘플에서 상호 형광 광 현미경 TEM 데이터를 획득 할 가능성을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="657">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:117px;">Proscitech</td>
			<td style="width:119px;">C0205</td>
			<td style="width:167px;">Harmful chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:117px;">Proscitech</td>
			<td style="width:119px;">C010</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:117px;">Univar-Ajax</td>
			<td style="width:119px;">569</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol 100%</td>
			<td style="width:117px;">Fronine</td>
			<td style="width:119px;">JJ008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acetone 100%</td>
			<td style="width:117px;">Fronine</td>
			<td style="width:119px;">JJ006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ERL 4221</td>
			<td style="width:117px;">Proscitech</td>
			<td style="width:119px;">C056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DER 732</td>
			<td style="width:117px;">Proscitech</td>
			<td style="width:119px;">C047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NSA</td>
			<td style="width:117px;">Proscitech</td>
			<td style="width:119px;">C059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DMAE</td>
			<td style="width:117px;">Proscitech</td>
			<td style="width:119px;">C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium metaperiodate</td>
			<td style="width:117px;">Analar BDH</td>
			<td style="width:119px;">10259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">anti-somatostatin antibody</td>
			<td style="width:117px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">A0566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody diluent</td>
			<td style="width:117px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Qdot 585 Streptavidin Conjugate&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q10113MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B7389-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glutaraldehyde 50%</td>
			<td style="width:117px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:117px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PCN5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS &#34;Dulbecco A&#34;</td>
			<td style="width:117px;">Oxoid&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSAc (10%)</td>
			<td style="width:117px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">900.022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm</td>
			<td style="width:117px;">Pechiney PP</td>
			<td style="width:119px;">M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0)</td>
			<td style="width:117px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.09584.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Micromoulds</td>
			<td style="width:117px;">Proscitech</td>
			<td style="width:119px;">RL063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:117px;">Diatome</td>
			<td style="width:119px;">Ultra 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:117px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Morgagni 268D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fluorescence light microscope</td>
			<td style="width:117px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Axioscope A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Grids 300 mesh nickel (thin bar)</td>
			<td style="width:117px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G2740N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:117px;">RMC</td>
			<td style="width:119px;">Powertome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">TEM camera control software</td>
			<td style="width:117px;">Soft Imaging System</td>
			<td style="width:119px;">AnalySIS</td>
			<td>Version 3.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Image processing software</td>
			<td style="width:117px;">Adobe Systems Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">Photoshop CS2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles

양자점 (QD) 나노 입자가 위드 형광 광 현미경 및 투과 전자 현미경 (TEM)을 이용하여 인간의 병리 조직의 면역 세포 화학적 상호 연구에 사용될 수있다하는 방법을 설명한다. 스트렙 타비 딘 결합 585 nm의 카드뮴 - 셀레늄 (의 CdSe) 양자점 (양자점)과 바이오틴 차 항체 및 시각화 다음에 우리가 소마토스타틴 (somatostatin)에 대한 일차 항체를 사용하여 인간의 소마토스타틴 종양의 초박 에폭시 섹션을 immunolabeled 한 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 섹션 위드 형광 빛 현미경으로 관찰 유리 슬라이드 상에 배치 된 시료 TEM 그리드 상에 장착된다. 광학 현미경은 종양 세포 내의 세포질 과립 패턴을 형성 밝은 오렌지 형광으로서 585 나노 QD 라벨링을 보여준다. 광학 현미경에 의한 중간 범위에서 낮은 배율 표지 패턴을 쉽게 인식 할 수 있으며, 비특이적 또는 배경 라벨링의 수준을 평가. 이것은 중요하다형태 학적 맥락의 후속 TEM에 의해 immunolabeling 패턴의 해석과 평가 단계. 같은 부분은 건조 도말 및 TEM으로 볼 수 있습니다. QD 프로브는 개별 분비 과립에 포함되는 비정질 재료에 부착하는 것으로한다. 이미지는 상관 분석을위한 광학 현미경으로 볼 수이자 (ROI)의 같은 지역에서 취득. 각 양상에서 이미지를 대응하는 다음 해당 지역의 TEM의 미세 구조에 형광 데이터를 오버레이 배합 할 수있다.

본 연구에 사용 된 소마토스타틴 종양 표본 stomal 콜라겐 조직과 혼합 도관 구조를 형성하는 종양 세포를 포함. 형광 빛 현미경으로 풍부한 분비 과립을 함유 개별 종양 세포는 호르몬 소마토스타틴 양성 표지를 나타내었다. 핵은 최소한의 비 특정 라벨 검출 (그림 1)과 어두운 구멍을 보였다. 낮은 배율 가변적 강렬한 과립 오렌지 형광이 아니라 특징으로하는 ...

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Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

correlative-light-electron-microscopy-using-quantum-dot

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K 조회수.  University of New South Wales Australia. A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

연구

생체공학

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

생산 및 일가 양자점 타겟팅

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...