이 작품은 건강 R01 CA131990 (BFS 및 RRM)의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다. 라이브 세포 이미징은 Karmanos 암 연구소, 웨인 주립 대학 및 아동 건강 및 개발 국립 연구소의 Perinatology 조사 지점에 의해 NIH 센터 보조금 P30 CA22453 의해 일부 지원 현미경, 이미징 및 Cytometry 자원 코어에서 수행되었다 , 웨인 주립 대학교.

1. 아이스크림 - 기판을 준비한다 <ol><li> 허용 아이스크림 - 기판은 4 ° C.에 50 μl aliquots 및 매장으로, 탈이온수에서 아이스크림-기판의 1 밀리그램 / ML의 재고 솔루션을 준비 열기 튜브 전에 실내 온도에 격차 따뜻하게 동결 건조된 </li></ol> 그것은 ~ 50-5 분, 열이 ° C 분산을 촉진하기위한 초음파 중탕 냄비에서 아이스크림 - 기판을 선동하는 데 필요할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 4에 하룻밤 얼음 해동의 rBM는 ° C; rBM 항상 얼음 다루어 져야합니다. </li><li> 10X 인산염을 만들려면 염분이 (PBS), 80g NaCl을 용해 (1.37 M), 2g KCl (0.027 M), 14.4 g 나 2 HPO 4 (1 M) 및 2.4 g KH 2 PO 4 (0.02 M)에서는 버퍼 800 ML의 ultrapure 물. 1.0 M HCL과 7.4로 PBS 버퍼 용액의 산도를 조정합니다. 볼륨 1리터에 지참, 여과하여 멸균. </li><li> 냉장 콜라겐 전 냉장 10X PBS 1 일부로 8 부품 : 얼음 콜라겐 전 솔루션을 준비합니다. 산도를 조절혼합물의 멸균 0.1 M NaOH를 사용하여 7.2-7.6 있습니다. 산도 스트립과 산도를 확인하고 멸균 물로 10 부분에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 각각, 25 μg / ML 및 2.4 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브에 콜라겐 전 용액에 아이스크림 - 콜라겐 봐도 diluting하여 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 전을 준비합니다. </li><li> 각각, 25 μg / ML 및 12-15 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브 rBM에서 아이스크림 - 콜라겐 IV를 (Cultrex 혹은 Matrigel) diluting에 의해 재구성 지하 막 (rBM) 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 IV를 준비합니다. 거품을 만드는 피하기 위해 부드러운 pipetting을 사용하여 얼음에 섞는다. </li></ol> 2. MAME cocultures 준비 cocultures의 개략도 그림 1을 참조하십시오. <ol><li> 장소 35 mm 배양 접시 또는 IbiTreat μ-요리 35-mm를 사용하여이 사각형 플라스틱 coverslips (10 분, 공기 건조를 위해 70 % 알코올로 소독). 여기 오시는 길 우리가 스튜에 사용하는 coverslips 및 μ-요리 모두를위한직립 현미경에 죽는다. 거꾸로 현미경에 대한 연구를 위해, 우리는 μ-접시를 사용합니다. </li><li> 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 I과 섬유아 세포의 원하는 번호를 섞는다. 콜라겐 나는 매트릭스 : 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해서는 미디어의 10 μl 플러스 아이스크림 - 콜라겐 전 60 μl 500 섬유아 세포를 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 피펫은 100 μl micropipettor를 사용하고 fibroblast의 70 μl 확산 : 아이스크림 - 콜라겐 I : 콜라겐 I 행렬 각 coverslip의 전체 표면 이상 고체화하기 위해 30 분 동안 CO 2없이 humidified 배양기에서 37 ° C에서 떠나야합니다. </li><li> 양도 35-mm 평형하는 10 분 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리. </li><li> 인큐베이터에서 제거하고 그들이 실내 온도에 올 때까지 후드를 35-mm 요리를 둡니다. </li><li> 경화 아이스크림 - 콜라겐 제가 위에 rBM 매트릭스 : 임베디드 섬유아 세포와 콜라겐 I 행렬 아이스크림 - 콜라겐 IV의 60 μl를 추가합니다. 피펫 팁, CA와아이스크림 - 콜라겐 나 : 저는 콜라겐 매트릭스 fibroblast를 긁적 피하 골고루 rBM 매트릭스 : refully 아이스크림 - 콜라겐 IV 뿌리 더군요. </li><li> 양도 35-mm 고체화하는 10 분 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리. 아이스크림 - 콜라겐 IV 동안 rBM 행렬이 응고되어 trypsinize과 상피 세포를 계산합니다. </li><li> rBM 매트릭스 : coverslips 향해 상피 / 종양 세포 현탁액의 장소 50 μl는 아이스크림 - 콜라겐 IV와 코팅. 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 장소 35-mm 요리. rBM 매트릭스 : 전지 40-60 분 아이스크림 - 콜라겐 IV에 연결하도록 허용합니다. 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해 2500 상피 또는 종양 세포를 사용합니다. </li><li> 각각 35 mm 접시에 2 % rBM를 포함하는 배지 2 ML을 추가합니다. 어떠한 약물 치료를하는 경우, 약물이 시간에 추가되어야합니다. </li><li> 이미징 전에 시간 원하는 기간 동안 품어. 장기 배양의 경우, 미디어마다 3~4일 변경해야합니다. 세포 유지하실 수 있습니다그들의 정상적인 문화 매체 인치 유방암 세포 라인 MAME cocultures 위해 MEGM의 SingleQuots로 보충 상피 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간에 (MEBM-PRF)을 사용합니다. </li></ol> 3. 공촛점 현미경으로 살아있는 MAME cocultures의 4D (3D + 시간) 이미징을 수행 <ol><li> 그림 증명 주요 연구 내용은 MAME cocultures 우리의 출판 절차 1에 따라 형광 셀 추적 염료로 분류했다. 이미징 전에 5% CO 2 배양기와 37 ° C에서 PBS로 세척 후 cocultures는 37 ° C 배양기에서 45 분 동안 MEGM 매체에 5 μm의 제품 CellTracker의 오렌지와 incubated했다 PBS로 다시 씻어 30 분 prewarmed MEGMmedium 함께 incubated . </li><li> 이미지 MAME cocultures은 자이스 혈구 LSM-510 메타 공촛점 현미경의 낮은 배율 (10X, 물 마른 렌즈)에 살고 있습니다. </li><li> 광학 부분은 구조의 전체 깊이에 걸쳐 간격으로 캡처됩니다. 우리의 연구에 대해서는 10 광학 부분을 캡처μm의 간격. </li><li> 3D의 이미지를 재구성하기 위해 광학 섹션을 사용합니다. 우리는 3 차원 reconstructions를 생성합니다 Volocity 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 세포 상호 작용과 그 주변 매트릭스와 상호 작용을 시각이 될 수있다 : 구조, 세포 있도록 3D reconstructions의 동영상을 확인하십시오. 우리는 QuikTime 플레이어 7에서 영화를했다. </li></ol> 4. 대표 결과 우리가 개발한 MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 취급하기 쉬운 실험 모델입니다. 여기에 휴대폰 요점을 되풀이하는 MAME 모델의 기능을 설명 : 유방암의 진행 중에, 라이브 세포 이미징의 세포 상호 작용은 시간이 지남에 따라 이러한 상호 작용을 수행합니다. 우리는 이상, preinvasive MCF10.DCIS 인간 유방암 세포주와 인간의 유방 암 관련 fibroblast 라인, WS-12Ti 사이의 이미지 상호 작용에 대한 능력을 보여주는문화의 3 주 이상의 기간. cocultures 3, 16, 23 일 정도 몇 군데 있었다. cocultures의 전체 볼륨을 통해 광학 부분은 그림 2에서 세 timepoints 각각에 대해 표시됩니다 3D 및 대표 예제 년에 복원되었다. 그림 2의 붉은 형광은 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포를 나타냅니다. 두 세포 유형 간의 장기 cocultures에 대한 차별하기 위해, 하나는 문화를 확립하기 전에 형광 단백질에 각각의 셀 유형을 transfect 또는 transduce 수 있습니다. differentially 식별을위한 형광 단백질로 분류되어 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포의 MAME의 coculture는 그림 3과 그림한다. 통합 기판으로,이 경우 아이스크림 - 콜라겐에 MAME cocultures로, 우리는 침략 표현형으로의 전환과 관련된 proteolysis의 시간이지나면서 변화를 평가하고 계량하실 수 있습니다. 우리는 형광 절단 제품을 quantifying위한 메소드를 설립했습니다 그 결과아이스크림 - 콜라겐 저하 2,3에서. 우리는 레이블링 및 세포 핵을 세어 당 셀 단위로 MAME cocultures의 전체 3D 볼륨에 걸쳐 저하 제품을 정상화. 더욱이, 우리는 세포와 세포 내 구획에 저하를 집중하고 우리가 이전에이 설명한 것처럼 총 세포내 및 세포외 저하 제품을 계량하실 수 있습니다. 그림 2와 3의 녹색 형광은 두 개의 아이스크림 - 콜라겐 기판 절단 제품을 나타냅니다. 이때 differentially-라벨이 콜라겐은 우리가 유형 나 콜라겐 유형 IV는 콜라겐과 열화의 저하를 구분할 수 있겠 사용할 수 없습니다. MAME cocultures의 상호 작용은 동적이고 시간이 지남에 따라 변경할 수 있습니다. 현세와 동적 정보를 얻으려면,보기 같은 분야는 주 분부터 일정 기간 동안 반복해서 볼륨의 전체 표본을 통해 찍은 몇 군데와 광학 섹션 수따라서 4-D에 데이터를 수집. 그림 2에서는 23 일 동안에 발생할 오히려 극적인 변화를 보여주는 : 휴대폰 번호의 변화, 세포 마이 그 레이션 및 세포 상호 작용, 구조 볼륨, 구조 모양, 구형의 구조의 편차, 침략 outgrowths과 proteolysis합니다. 또한, 우리는 또한 인한 MAME cocultures로 볼륨의 전반적인 변화를 보여주는 굴욕적인 그들의이 기간 동안 세포외 기질을 둘러싼. 그림 2A에서 그림과 같이 삼일에서 볼륨 110000 μm의 3. 반면, 16 23일에서 MAME cocultures의 볼륨은 그림 2B와 C로 그림에만 46250 μm의 3입니다 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig1.jpg" /> 1 그림. MAME cocultures.의 개략도는 플라스틱 coverslip는 아이스크림 - 콜라겐 I 및 섬유아 세포 (마젠타)를 포함하는, 콜라겐 나는 코팅됩니다. 아이스크림 - 열을 포함하는 재구성 지하 막의 두번째 레이어 (rBM)lagen IV가 추가됩니다. 종양 세포 (적색)은 위에 도금과 문화 미디어의 2 % rBM는 오버레이 (흰색 도트) 미디어의 모든 변화가있는가 있습니다. 녹색은 아이스크림 - 콜라겐 I와 IV의 형광 절단 제품을 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig2.jpg" /> 그림 2. MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 MAME cocultures. 섬유아 세포는 콜라겐 아이스크림 - 콜라겐 IV를 포함 rBM와 I / 아이스크림 - 콜라겐 I 및 오버레이에 박혀 있었다. DCIS 세포 그런 다음 2 % rBM을 포함 매체와 rBM 및 오버레이에 놓는되었다. cocultures의 볼륨의 감소에 표시된대로 여기에 그림 coculture에서 23 일 동안 세포 증식, 아이스크림 - 콜라겐 IV와 (녹색)과 콜라겐 매트릭스의 저하가 발생했습니다. 세포 이미징 (적색)하기 전에 원래의 장소에 CellTracker의 오렌지와 레이블링에 의해 현지되었다. 같은 라이브 cocultures는 C로 촬영한 이미지를 23 일 동안 관찰되었다coculture 3, 16, 23 일 정도 onfocal 현미경. 그 결과 광학 조각은 Volocity 소프트웨어로 3D 년에 복원되었다. 배율, 10X. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig3.jpg" /> 그림 3. MAME 16일의 MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 cocultures 그 각각 명시 RFP (적색)와 YFP (흰색). Cocultures 설립과 그림 2에서와 같이 분석했다. 여기에 표시된 두 세포 유형은 그러나 differentially 그들은 서로 구분할 수 있도록 분류 하였다. 이 그림에서 높은 배율 이미지, 그림 2에서 이들에 비해, DCIS 세포 및 섬유아 세포 근처 분야에서 아이스크림 - 콜라겐 내의 확산 proteolysis의 표면에서 아이스크림 - 콜라겐 IV의 proteolysis를 보여줍니다. 배율, 20X.

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	<li>Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+proteolysis:+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis.">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).</li><li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protease+activity+in+living+cells:+from+two+dimensions+to+four+dimensions.">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).</li><li>Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+hepatocyte+growth+factor+promotes+invasion+of+human+mammary+ductal+carcinoma+in+situ.">Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ.</a> Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+live-cell+imaging+demonstrates+that+beta1-integrin+promotes+type+IV+collagen+degradation+by+breast+and+prostate+cancer+cells.">Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells.</a> Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).</li><li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p21-activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer.">p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> Neoplasia. 10, 314-328 (2008).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantifying+the+dynamics+of+tumor+associated+proteolysis.">Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).</li><li>Cavallo-Medved, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+demonstrates+that+proteases+in+caveolae+of+endothelial+cells+degrade+extracellular+matrix.">Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix.</a> Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).</li><li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microvasculature+and+microenvironment:+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models.">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

보여준 바와 같이, MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징에 사용될 수 있습니다. 저희 연구실에서는 지속적인 연구에서 우리는 proteolytic DCIS의 침략 ductal 암종으로의 전환과 연관된 경로뿐만 아니라 같은 케모카인 / 시토킨 / 성장 인자의 통로로서 이런 변화에 참여 proteolytic 경로와 다른 경로 간의 상호 작용을 확인?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 재구성 지하 막 (Cultrex) </td><td> Trevigen </td><td> 3445-005-01 </td><td> Matrigel (BD Biosciences)과 비교 </td></tr><tr><td> 콜라겐 전 </td><td> 응집 연구소 </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> 아이스크림 - 기판 (콜라겐 I, IV) </td><td> Invitrogen </td><td> 아이스크림 - 열 I-D12060 아이스크림 - 열 IV D12052 </td><td></td></tr><tr><td> 22-mm 플라스틱 coverslips </td><td> 피셔 과학 (주) </td><td> 12-547 </td><td> 10 분하고 사용 전 공기 건조를 위해 70 %의 에탄올에두고 반으로 잘라. </td></tr><tr><td> 세포 배양 배지 </td><td> Lonza </td><td> MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 </td><td> 붉은 무료로 페놀 </td></tr><tr><td> μ-접시를 ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80,136 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity 소프트웨어 </td><td> Perkin-엘머 </td><td> 버전 5.5 </td><td> 이미징 소프트웨어의 다른 브랜드는 3D reconstructions 및 동영상을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

mame models for 4d live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression

세포 상호 작용 : 우리는 용어 MAME (M ammary rchitecture 및 M icroenvironment 전자 ngineering), 그리고이 세포의 실시간 라이브 세포 이미징을 위해 그들을 이용하는 3D coculture 모델을 개발했습니다. 우리의 전반적인 목표는 침입 표현형 자신의 진행을 공부하는 preinvasive 유방 병변의 구조를 요점을 되풀이 모델을 개발하는 것이었습니다. 특히, 우리는 침략 ductal carcinomas에 preinvasive 유방 상피 세포의 진행을 강화하거나 감소에 연루되어 종양 microenvironment의 사전 악성 유방 상피 세포 변형 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 분석하는 모델을 개발했습니다. 다른 세포 유형의 최신 연구는 myoepithelial 세포, 섬유아 세포, macrophages과 혈액 및 림프의 microvascular 내피 세포 수 있습니다. 동안 유방 내에서 세포 상호 작용 요점을 되풀이하도록 설계되었습니다 MAME 모델 외에도암 진행, 우리는 전립선 암의 진행에 대해 비교 가능한 모델을 개발했습니다. 여기에서 라이브 세포 이미징 및 현장에서 유방 ductal 암종 (DCIS) 시간이 지남에 침입 표현형에 대한 세포 및 섬유아 세포의 cocultures의 전환을 수행하는 기능 proteolysis 분석의 사용과 함께 3D cocultures 설립을위한 절차를 설명 문화 이십삼일 이상이 경우. MAME cocultures은 여러 개의 레이어로 구성되어 있습니다. 섬유아 세포는 종류 나 콜라겐의 맨 아래 레이어에 포함됩니다. 그 문제는 DCIS 세포가 놓는이되는 재구성 지하 막 (rBM)의 레이어를 배치됩니다. 2 % rBM의 최종 상위 계층이 포함되어 있으며 미디어의 모든 변화 보충함있다. 침입 표현형에 진행과 관련된 영상 proteolysis에, 우리는 (아이스크림) 염료 침묵 형광등 매트릭스 단백질 (아이스크림 - 콜라겐 나 RB의 중간 계층과 혼합 콜라겐 I과 아이스크림 - 콜라겐 IV의 레이어와 혼합을 사​​용하여M)하고 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 문화를 관찰합니다. 광학 부분은 캡처 처리 및 Volocity 시각화 소프트웨어와 3D 년에 복원되었습니다. MAME cocultures 23 일 과정 동안, DCIS 전지는 분아 따위에 의해 중식 대형 침략 구조로 뭉쳤다. 섬유아 세포는 마이 그 레이션하고 이러한 침략적 구조에 포함된다. 콜라겐의 형광등 proteolytic 조각 DCIS 구조의 표면으로 협회에서 발견되며, intracellularly, 또한 주변의 매트릭스에 걸쳐 분산. 대상 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로 또는 cocultures의 세포 성분의 개조가 MAME 모델 소설 치료적 접근에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수있는 제안, invasiveness을 줄일 수있는 약물.

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MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

mame-models-for-4d-live-cell-imaging-tumor-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

14.3K 조회수.  Wayne State University. 우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

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Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에</em후보 치료 대리점> 테스트

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

연구

의학

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

마우스 경부 림프절의 고주파 초음파 이미징

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...