우리는 APC 최소 / + 마우스의 유전자형에 대한 잉 유에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 INSERM에서 자금과 국립 보건원에서 보조금 (CA057621 및 AI053194)에 의해 지원되었다.

주 : 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), UCSF의 승인 절차에 따라 수행 하였다. 모든 촬상 실험 비 생존 절차이었고 동물은 화상 획득의 종료 후 즉시 안락사시켰다. 마우스의 1 세대 참고 : APC 유전자에 돌연변이를 들고 APC 최소 / + 마우스는, 자발적으로 소장에서 50 ~ 100 선종을 개발한다. <ol><li> 크로스 APC 최소 골수 세포를 감지하는 C-FMS 프로모터에서 EGFP을 표현하는 C-FMS-EGFP 라인 ACTB-ECFP의 액틴 프로모터에서 ECFP을 표현 라인, 또한과 / + 마우스. ACTB-ECFP 및 C-FMS-EGFP 이형 동물 형광을 감지하는 데 사용됩니다. </li><li> 이미지를 명확하게 검출 선종에 연령 3 ~ 4 개월에 마우스를 사용합니다. </li></ol> M의 2 준비수술 전에 aterials 참고 : 현미경 셋업의 세부 이전 된 6,7 설명했다. <ol><li> 현미경 <ol><li> 가열 담요를 켭니다. 488 nm의 여기 및 고체 405 nm의, 561 nm의 및 640 nm의 레이저에 대한 아르곤 레이저를 켭니다. 현미경의 전원을 켜고 회전 디스크 제어 장치, AOTF, 레이저 제어 장치, 카메라 컨트롤러. </li><li> LED가 빨간색으로 바뀌 현미경 셔터를 엽니 다. 컴퓨터와 카메라 소프트웨어를 켭니다. </li></ol></li><li> 이미징 플랫폼 <ol><li> 무대 인서트가 깨끗한 지 확인합니다. 그렇지 않으면, 비누와 물로 후 건조 깨끗. </li><li> 이 커버 슬립을 가지고 삽입물을 확보하기 위해 실험실 테이프를 사용합니다. 무대에서 삽입을 놓고 알코올 와이프로 청소. </li><li> 실험실 테이프를 이용하여, 상기 스테이지의 오른쪽으로 가열 블랭킷 첨부. </li><li> 코 콘에 고무 다이아 프램의 무결성을 확인하고 necessar하면 변경y를 입력합니다. 위치 및 거즈 랩 테이프를 사용하여 동물에 이소 플루 란 마취 전달을위한 코 콘을 수정합니다. </li></ol></li><li> 이소 플루 란 마취 시스템 <ol><li> 이소 플루 란 탱크를 채우십시오. </li><li> 진공 켜고 / 분 1.2 L로 조정합니다. </li><li> 분무기에 증류수를 추가하고 이소 플루 란 시스템에 분무기를 연결합니다. </li><li> 산소 분석기를 켜고 이소 플루 란 시스템에 연결합니다. 산소 탱크의 전원을 켜고 산소 분석기는 100 %가 표시되는지 확인합니다. / 분 0.2 L에 O이 흐름을 조정합니다. </li><li> 질소 탱크를 켜고 / 분 0.8 L의 흐름을 조정합니다. 산소 분석기는 21 %가 표시되는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 수술 도구 및 플랫폼의 준비 <ol><li> 비누와 물로 해부 집게와 가위의 청소 2 쌍. </li><li> 뜨거운 비드 살균기를 켜고는 250 ° C에 도달 할 수 있습니다. 30 초 동안 수술 도구를 소독. 이를 식혀 보자. </li><li> 수술 벤치에 실험실 담그는 배치. </li><li> 수술 플랫폼으로 스티로폼 뚜껑을 사용합니다. 실험실 술고래의 조각으로 커버. 마우스를 면도 후 변경 실험실 술고래의 두 번째 조각을 준비한다. </li><li> 덮여 스티로폼 뚜껑에 마취 라인 코 콘을 배치하고 일부 테이프 (안 실험실 담그는)에 스티로폼 뚜껑에 부착 장소에 보관하는 코 콘의 양쪽에 두 개의 바늘을 사용합니다. </li><li> betadine, 알코올 잎사귀, 멸균 거즈, 슈퍼 접착제, 현미경 슬라이드, 전기 면도기, 및 실험실 테이프 4 개를 조립합니다. </li></ol></li></ol> 주사의 3 준비 <ol><li> 후드에서 인슐린 주사기 준비 (28 G X ½)에 2,000 kDa의 로다 민 - 덱스 트란 (4 ㎎ / ㎖ 100 ㎕ 스톡의 AF647 - 복합 LY-6G (GR1) 항체 (1 ㎎ / ㎖)의 7 μL로 ) 복고풍 궤도 주입. 이 동물에서 개발 빈혈 꼬리 정맥 difficu를 만드는 것이므로 레트로 궤도 주사 APC 최소 / + 생쥐에서 권장지금이 피부를 통해 검색 할 수 있습니다. </li><li> 대장의 연동 운동을 저해 이미징 전에 1 ㎎ / ㎏ 피하 (SC)에 150 ㎕의 PBS에 희석 아트로핀 주사 초 인슐린 주사기를 준비합니다. </li></ol> 이미지에 대한 소장의 4 준비 <ol><li> 유도 챔버로 마취 회선이 오픈하고, 수술 테이블과 현미경에 라인이 닫혀 있는지 확인합니다. </li><li> 마취 챔버에 동물을 전송합니다. 마취 챔버를 닫고 (21 % O 2) 4 %로 이소 플루 란을 켭니다. </li><li> 마우스 깊이 천천히 (5-6 분 후) 통기성이 때, 그 측면에 수술 스테이지로 전송하고 GR1 항체 용액 및 / 또는 덱스 트란 용액 레트로 궤도 상을 주사. </li><li> 수술 플랫폼에 연결된 마취 라인을 엽니 다. 마취 실에 줄을 닫고 마취 콘에서 코와의 뒷면에 마우스를 넣어. </li><li> 이소 플루 란을 줄4 %에서 2.5 %로 농도. </li><li> 마우스가 아니라 그것의 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 테스트하여 마취되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 눈에 안과 윤활 연고를 추가합니다. </li><li> 실험실 테이프를 추가하여 수술 단계로 마우스의 사지를 고정합니다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여 복부 표면에서 머리를 제거합니다. 또한 인수하기 전에 산소 측정기의 위치를​​ 왼쪽 뒷다리에서 머리를 제거합니다. 수술 단계에서 실험실 담그는를 제거하고 머리의 오염을 방지하기 위해 깨끗한 하나를 교체합니다. </li><li> 알코올 잎사귀와 betadine와 복부 표면을 소독. </li><li> 마우스의 한 측면에서 SC (3.2) 아트로핀 용액을 주입한다. </li><li> 피부를 통해 1cm 복부 정중선을 절개하여 가위에 의한 복막 및​​ 포셉 한 쌍을 확인합니다. 조심스럽게 소장의 3-4센티미터을 끌어와 이미지에 하나 또는 여러 개의 종양을 식별합니다. </li><li> 유리 MICR을 가지고oscope 슬라이드와 위치를 상단에 종양 그것에 소장의 루프. </li><li> 슬라이드에 부착하는 소장을 따라 몇 위치에 어떤 슈퍼 접착제를 추가합니다. 접착제가 마를 때까지 한 분을 기다립니다. 공 초점과의 현지화를 촉진하기 위해 종양을 가리키는 슬라이드에 선을 그릴 수있는 마커를 사용합니다. </li></ol> (5) 위치 결정 스테이지에서 마우스 및 준비 이미지 획득을위한 <ol><li> 사지에서 랩 테이프를 제거합니다. </li><li> 현미경 단계에 마취 라인을 열고 수술 플랫폼을 닫습니다. </li><li> 아래로 복부 측면과 코 콘에서 코와 현미경 단계로 조심스럽게 마우스를 전송합니다. 일부 실험실 테이프로 마취 라인을 고정합니다. </li><li> 재 위치 커버 미끄러 창 중 하나의 중앙 부위를 위하여 마우스 및 / 또는 슬라이드. 조심스럽게 실험실 테이프로 슬라이드 아래로 테이프. </li><li> 마우스의 왼쪽 사지에 산소 농도계 프로브를 연결합니다그 마음과 호흡과 산소 포화도 수준을 따릅니다. </li><li> 저체온증을 피하기 위해 가열 블랭킷와 마우스를 포함한다. </li><li> 이미징 1.5 %로 2.5 %에서 이소 플루 란 농도를 낮 춥니 다. </li></ol> μManager 소프트웨어를 사용하여 이미지의 6 취득 <ol><li> 구성 설정에 이미지 품질을 개선하기 위해 2500 rpm으로 CSUX 속도를 증가시킨다. </li><li> 10X 0.5 NA 또는 20X 0.75 NA Fluar 렌즈 목표를 선택하는 목적 드롭 다운 메뉴를 사용합니다. </li><li> 색상 드롭 다운 메뉴에서 레이저 405 nm의를 선택합니다. </li><li> 라이브 클릭하고 현미경으로 초점을 조절합니다. </li><li> 자동 화상 극단적 화소 값에 기초하여 표시 화상의 최대 및 최소 픽셀 강도를 조정하는 자동 클릭. 디스플레이 이미지의 픽셀 세기의 히스토그램은 메인 윈도우의 하단의 그래프로 표시됩니다. </li><li> 에서 파이퍼 제어판 창에서 카메라 노출을 조정시계의 수를 (하나의 시계가 33.333 밀리 초입니다) 변경. </li><li> 신호가 낮은 노출 너무 밝은 경우, 현미경 제어부를 이용하여, 레이저 강도를 감소시킨다. </li><li> 488 nm의, 561 nm에서 640 nm의 레이저 라인에 대한 신호 강도를 확인합니다. 레이저 자체의 제어 유닛 (488 nm 내지 561 nm의) 또는 현미경 제어부와 레이저 강도를 조정한다. </li><li> 멀티 D 획득 창에서, 시점 박스에 체크 및 시점의 개수 및 원하는 시간 간격을 입력하세요. </li><li> , Z-스택 상자를 선택하십시오 &quot;상대 Z&quot;를 선택하고 현재 위치에 Z 스타트 및 Z 엔드 기준을 정의합니다. 참고 : 10 배 또는 20 배 목표를 들어, 떨어져 각각 3 Z 평면, 8 μm의 4 μm의 시작합니다. </li><li> 여러 위치 이미징의 복수 위치 (XY) 상자에 체크 표시를 한 후, 편집 위치 목록을 클릭 4-6 다른 위치를 표시합니다. </li><li> 채널 상자를 선택하고 새로운에서 채널을 추가하고 레이저에게 드롭 다운 메뉴와 일반에서 라인을 선택(33.333 밀리의 배수로) 각 채널에 대한 노출에 전자. </li><li> &quot;멀티 D 획득&quot;창에서 이미지를 저장을 선택합니다. </li><li> 폴더를 선택하고 획득 된 모든 이미지는 자동으로 주어진 이름 접두사와이 폴더에 저장됩니다. 참고 : 각 연속 수집은 각 시점에서 각 색상의 각 Z 슬라이스에 대한 개별 TIFF 파일과 같은 별도의 하위 폴더에 저장됩니다. </li><li> 멀티 D 취득 창에서 설정 저장을 클릭하여 모든 설정을 저장합니다. </li><li> 획득을 시작하기 위해 다차원 취득 창에 취득 클릭합니다. </li><li> 산소 농도계 프로브를 사용하지 않는 또는 잘 작동하지 않는 경우 (맥박이 안정 또는 검색 할 하드가 아닌 경우), 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 확인하여 마취의 효율성에게 이미징 절차를 수행하는 동안 매 15 분을 확인합니다. 마우스가 이러한 자극에 반응하는 경우 마취를 조정합니다. </li><li> 인수 후, 이소 플루 란 concent를 증가시켜 마우스를 안락사5 % 배급. 더 호흡 운동이 검출 없으면, 무대에서 마우스를 제거하고 자궁 전위를 수행합니다. </li></ol> Imaris 소프트웨어를 사용하여 이미지의 7 분석 <ol><li> 변환 파일 (보충 그림 1A)를 .ims합니다 <ol><li> 카메라 소프트웨어를 열고 파일 다음 배치 변환기를 클릭합니다. </li><li> 클릭 파일을 추가하고 첫 번째 위치의 첫 번째 파일을 선택합니다. 각 위치에 대해 반복합니다. </li><li> 업로드 된 각 파일에 대해 설정을 클릭하고 Z-스택에 대한 시간 채널에 대해, &quot;C&quot;와 &quot;Z&quot;에 대한 설정 &quot;t&quot;는 그 순서대로 표시되는지 확인합니다. </li><li> 원하는 폴더에 저장합니다. 검색 및 변환으로 새 파일을 만듭니다. </li><li> 모든 설정을 클릭하고 시작합니다. </li></ol></li><li> 조정 (보충 그림 1B) <ol><li> 특정 변환 된 폴더로 이동하여 첫번째 파일을 엽니 다. </li><li> 디스플레이 조정 창에서 배경을 조정필요한 경우, 각 채널에 대한 최소 수를 수정하여 신호 차단. </li><li> 필요한 경우, 최대 개수 (하부 최대 값이 클수록 신호의 강도)을 변경하여 상기 신호 강도를 조절한다. 참고 : 신호 강도 / 콘트라스트 조정이 더 좋은 시각화를하기 위해 휴대 행동이나 구획의 하이라이트 수 있습니다. 이 결과 자체를 변경하지 않습니다. </li><li> 편집 및 이미지 속성을 클릭합니다. </li><li> x, y 및 z의 값을 변경 (10X 대물, X 및 Y = 0.712, Z = 8 μM를 들어, 20X 대물 렌즈의 경우 : X 및 Y = 0.36, Z = 4 μM). </li><li> 시점을 조정하는 모든 등거리을 클릭합니다. 시작 날짜를 추가하고 인수의 시간을 시작합니다. 종료 날짜를 추가하고 수집 (보충 그림 1C)의 종료 시간. </li><li> 영화를 감상하려면 재생 버튼을 클릭합니다. </li><li> 편집을 클릭하고 흐린 이미지를 삭제하는 시점을 삭제합니다. </li><li> 두 개의 분리 된 인수의 도게에 가입하려면거기는 한 영화로, 첫 번째 영화의 마지막 시점에 가서 편집 클릭&gt; 두번째 파일을 추가하는 데 시간이 포인트를 추가합니다. </li></ol></li><li> 동영상으로 저장 (보충 그림 1D) <ol><li> 녹음을 클릭 .MOV 확장과 공의 압축 요소를 선택합니다. </li><li> 저장을 클릭합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

본 논문에서는 상세한 프로토콜은 창자의 장막 측에서 몇 군데 살아있는 동물에서 몇 시간 동안 장내 종양에서 골수 세포 역학의 디스크 공 촛점 이미징 회전에 설명되어 있습니다. 염증을 방지하기 위해 최적의 생리 학적 조건을 가지고, 소장의 이미지는 그대로 기관에서 수행해야합니다. 광이 도달하기 전에 상피 평활근 같은 상이한 조직 층을 통과해야하기 때문에, 소장?...

절대적인 증거 해주기 섬유 아세포, 내피 세포, 면역 및 염증 세포, 세포 외 기질, 및 가용성 인자를 포함한 이종 세포 집단 이루어진 종양 미세 환경은, 거의 모든 기여함으로써 개시 및 고형 종양의 진행에 중요한 역할을한다는 것을 보여 암 하나의 특징. 사실상, 종양 진행 중에, 악성 종양이 유리한 미세 환경을 생성하도록 형질 전환 된 진화 암세포 및 간질 세포 간의 일정한 동적 상호 작용이있다. 종양 미세 환경에 침투 면역 세포 중 골수 세포는 세 가장 풍부하다. (TAM) 종양 관련 대 식세포로 구성된 골수 유래 억제 세포 (MDSCs), 수지상 세포 (DC) 및 호중구 (백혈구), 골수 세포는 골수에서 모집하고 점진적으로 사이토 카인, 성장 인자 및 단백질 분해 효소 방출, 종양에 침투 홍보 할 수 있습니다종양의 성장 및 4를 확산. 암 세포와 골수 세포 사이의 크로스 토크는 복잡하지만 동적이다. 따라서, 상호 작용의 성질에 대한 이해는 이들 세포 대신 항 종양 면역 반응에 참여하는 암의 진행을 촉진 결정하는 중요한 이유이며, 그것을 제어하기위한 새로운 타겟을 찾는 데 도움이 될 수있다. 의 intravital 현미경으로 직접 관찰은 살아있는 쥐 5의 조직 내에서 세포 역학에 대한 정보를 제공합니다. 이 4 색은, 다중 영역은 마이크로 렌즈 효과 회전 디스크 촛점 시스템은 유방 종양 6 내의 간질 세포를 연구하기 위해 디자인되었다. 이 방법은 장기의 연속 영상을 구현하고 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 (a) 급 이미지 획득, (b) 장기 마취, (c) 상이한 세포 유형을 따르는 네 가지 색상 취득, (D), 형광 표지 등의 여러 장점을 포함 다른 종양 구성 요소 및 다른 종양 미세 환경의 재치 (E) 관찰같은 마우스를 힌 것은 마우스 변동성 7-9로 마우스를 방지 할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다른 세포 행동은 종양의 진보적 인 단계를 표시하는 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 중심 폴리오 중간 T 종양 유전자 (PyMT) 모델에서보고되었다. (Foxp3의 EGFP 형질 전환 유전자에 의해 시각 Tregs) 혈관에 근접 우선적으로 마이그레이션 규제 T 림프구 수지상 (의 CD11c-DTR-EGFP), 암 관련 섬유 아세포 (Fsp1 + / +-EGFP) 및 골수 세포 (C-FMS 반면, -EGFP)은 종양 덩어리 내에보다 종양 주변부에서 높은 운동성을 나타낸다. 급성 전신 저산소증의 상태에서 세포는 다른 마이그레이션 : Tregs는 6 계속 이동 골수 세포는 대조적으로 마이그레이션 중지합니다. 또한, 동일 마우스 모델에서, 종양은 단계와 그 독소루비신 감도 변화를 도시 한 약물 분포를 약물 반응, 및 독소루비신 관련된치료는 종양 세포의 골수 CCR2 의존적 채용 리드. 따라서, 라이브 영상도 현장에서 약물 반응에 대한 통찰력과 chemoresistance 10, 11의 생물학을 높일 수 있습니다. 선종 성 용종증 대장균 (APC) 유전자 돌연변이는 일반적으로 인간의 대장 선종 및 암 (12)과 대장 암 (13)에 대한 매우 높은 위험을 수여 가족 성 선종 성 용종증 (FAP)에있는 APC 유전자 결과의 단일 사본의 돌연변이에서 발생합니다. 마우스 변형 APC 최소 / +는 APC 유전자의 코돈 850의 절단 돌연변이를 수행하고 자발적으로 모든 소장 14 ~ 16에 걸쳐 여러 장 선종을 개발하고 있습니다. 복강을 여는 부위에 액세스하기위한 필요가 있기 때문에 소장의 장기의 intravital 이미징 때문에 절차의 침습성의 도전이다. 단기 라이브 영상 성udies는 이전에 건강한 장 (17, 18)에 간행되었지만, 장내 종양의 장기 직접 관찰은보고되지 않았습니다. 수술 이전 화상 유방 종양 6,10 사용의 intravital 스피닝 디스크 현미경 시스템을 사용하여 설계 및 소장의 장막면을 통해 종양 시각화 정제되었다. 이 논문에서, 프로토콜은 하나의 APC 최소 / + 마우스를 사용하여 소장 종양 내 골수 세포의 행동을 수행 할 수 있다는 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ApcMin/+ mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ACTB-ECFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:141px;">3773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cfms-EGFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">D7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:107px;">Butler Animal Health Supply</td>
			<td style="width:141px;">29450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxygen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X PBS</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Saline Buffer</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td>
			<td style="width:107px;">UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Use at 1mg/Kg mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">28G1/2 insulin syringe</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">329465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Remium cover glass</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-548-5M</td>
			<td>24x50-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-550-15</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Krazy glue</td>
			<td style="width:107px;">Office Max</td>
			<td align="right">7111555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Betadine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat blanket</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar Industries</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cotton tipped apllicators 6-inch</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">72310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anesthesia system</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:141px;">Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">stage insert</td>
			<td style="width:107px;">Applied Sientific Instrumentation</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse Ox oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:107px;">Starr Life Sciences</td>
			<td style="width:141px;">MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nebulizer</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:107px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mManager</td>
			<td style="width:107px;">Vale lab, UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ICCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:141px;">XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinning disk confocal sacan-head</td>
			<td style="width:107px;">Yokogawa Corporation</td>
			<td style="width:141px;">CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

골수 세포는 종양 내에서 가장 풍부한 면역 세포이며 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다. 현대의 intravital 이미징 기술은 기관 내부의 살아있는 세포 행동의 관찰을 가능하게되지만, 소장으로 인한 장기 및 종양 접근성 일부 암에서 문제가 될 수 있습니다. 장내 종양의 직접적인 관찰은 이전에보고되지 않았습니다. 여기에 설명 된 수술은 형질 전환 형광 기자 마우스와 주사 추적자 또는 항체를 사용하여 살아있는 생쥐의 장내 종양 내에서 골수 세포 역학의 직접 관찰 할 수 있습니다. 이를 위해, 신속한 화상 취득 장기 연속 촬상을 허용 4 색 멀티 영역, 마이크로 렌즈 효과 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고있다. 교차 소장의 여러 선종 개발 APC 최소 / + 마우스 골수 세포를 시각화하는 C-FMS-EGFP 마우스와 ACTB-ECFP 마우스와 함께지하실의 장 상피 세포를 시각화합니다. 이러한 혈관 및 호중구 및 장막 표면을 통해 이미징 종양을 위치시키기위한 절차와 다른 종양 성분을 라벨링하는 절차도 설명된다. 영상의 몇 시간에서 컴파일 시간 경과 영화는 장 미세 환경에서 현장에서 골수 세포 행동의 분석을 할 수 있습니다.

ACTB-ECFP; APC 최소 / +의 소장에서 회전 디스크 초점 현미경, 비 종양 및 종양 조직을 이용하여 C-FMS-ECFP 마우스는 장막 표면에서 시각화 될 수있다. 촬영 후, 카메라 소프트웨어 분석 및 수집 (보충 그림 1)을 조정하는 데 사용됩니다. 형광 2,000 kDa의 덱스 트란 - 로다의 정맥 주입 및 LY-6G 항체 컨쥬 게이트 647, 후 혈관과 백혈구가 각각 (도 1)을 검출 ...

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K 조회수.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

비디오: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

연구

면역학 및 감염병학

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.