이 작품은 건강 그랜트 RO1DC002756 국립 연구소와 Purdue 학술 진흥 재단에 의해 투자되었다. 우리는 실험과 수치과 관련하여 도움이 로드니의 McPhail와 조언 도리스 우와 Wiese 장 감사드립니다.

요리법 칙 Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7.2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0.23 g </td><td> CaCl 2 + 2 시간 2 O </td></tr><tr><td> 0.37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0.115 g </td><td> 나이 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ML </td><td> 물 (조직 문화 학년) </td></tr></tbody></table> 참고 : 7.4로 산도를 조정합니다. 물로 1,000 ML에 최종 볼륨을 가져와. 10X PBS <table border="1"><tbody><tr><td> 40g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7g </td><td> 나이 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1.2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ML </td><td> DEPC 물 </td></tr></tbody></table> 참고 : 7.4로 산도를 조정합니다. 최종 가져와물 500 ML에 볼륨. 작업 농도 (1X)는 같은 18 MΩ - cm의 전도성과 물을 생성하는 Millipore 자외선 조사 시스템 얻은로 조직 문화 등급 물 9 부분 1 부분 10X 주식을 diluting에 의해 이루어집니다. explant 개최 매체 SAG <ul><li> L - 글루타민과 함께 DMEM/F12, 10 MM Hepes </li><li> 10 % 인슐린, 전송, 셀레늄 (ITS +1) </li><li> 1퍼센트 펜 - strep </li></ul> Explant 문화 매체 <ul><li> explant 개최 매체 SAG </li><li> 10 NG / ML Neurotrophin - 3 (NT - 3) </li><li> 10 NG / ML ciliary neurotrophic 인자 (CNTF) </li></ul> 척수의 해부 및 유지 매체 <ul><li> L - 15 </li><li> 10% 소태아 혈청 </li><li> 1퍼센트 펜 - strep </li></ul> 37-38에서 부화 계란 ° C. 70 % 에탄올에 도구와 Sylgard 해부 접시를 해부 소독. 요리 도구를 해부하면 UV가 밤새 소독 수 있습니다. <ol><li> 한 ML 무균 PBS, 믹스, 그리고 튜브의 바닥에 정착하는 비즈 기다리는와 microtube에 넣어 비즈. </li><li> 비즈가 정착하고 PBS에 resuspend 후에 뜨는을 제거하여 비즈를 여러 번 씻으십시오. </li><li> 상온에서 1 시간 동안 단백질 (PBS에 희석) 또는 PBS 혼자 (컨트롤)을 정화의 구슬을 품어. </li><li> 콜라겐에 배치까지 1ml PBS로 24 잘 플레이트에서 PBS와 저장소의 구슬을 씻어. </li></ol> 2. Statoacoustic 신경절의 해부 <ol><li> E4에서 난자에서 배아를 제거하고 배아 세포막을 제거하는 여자 울리는의 솔루션과 함께 접시에 넣습니다. </li><li> 차가운 HBSS 최대 직면하고있는 귀의 소포와의 측면에 위치 배아를 가득 Sylgard © 늘어선 페트리 접시에서 배아를 놓습니다. 해부 핀을 사용하여 요리에 배아를 핀. </li><li> 두 해부 핀을 사용하여 피부를 통해 수평 절단을 즉시 복부운하 파우치는 약 그것은 달팽이 덕트가 만나는 곳이. 수직 절단이 앞쪽에 있고 SAG에 후부합니다. 세 인하 마주하고 피부를 리프트하고 제거하는 포셉 또는 해부 핀을 사용합니다. 참고 : SAG는 brightfield 기본 조명과 함께 쉽게 볼 수있는 지느러미 파우치, 그리고 ventromedially 프로젝트와 pharyngeal 아치에 의해 왜곡시킨다 복부 달팽이 덕트 사이의 중간 정도 otocyst의 anteroventral 가장자리에 위치하고 있습니다. 달팽이 덕트 elongates는 dorsoventral 차원 있도록 점진적으로 햄버거 - 해밀턴 단계 9월 23일에서 25일까지 사이 E4에서 증가합니다. </li><li> SAG에서 분리 사후 방향으로 otocyst를 당겨. 해부 핀과 SAG를 둘러싼 조직을 치환 조심스럽게 # 55 포셉를 사용하여 배아에서 SAG를 제거합니다. mesenchymal 조직 및 SAG에서 튀어나온 신경 번들의 큰 덩어리를 제거합니다. </li><li> 넓은 입을 pipet 팁 사용으로 explant를 전송미디어를 들고 0.5 ML의 SAG의 explant 24 - 우물 판. 최대 4 시간 동안 얼음이나 실온에서 explants 보관하십시오. </li></ol> 3. 척수의 해부 <ol><li> 난자에서 E6 배아를 제거하고 여자 울리는의 솔루션을 포함 접시에 넣습니다. 머리와 배아 세포막을 제거합니다. </li><li> Sylgard에 몸을 © 차가운 척수의 해부 매체를 포함하는 해부 접시를 놓습니다. 위치와 실험자 직면하고있는 배아 &#39;복부 아래 &quot;와 꼬리를 핀. 각 사지 통해 앞쪽에 말까지 해부 핀을 넣으십시오. </li><li> 집게 및 /를 사용하거나 핀을 해부하는 것은 조심스럽게 척수의 지느러미 표면을 볼 때까지 복부 방향으로 이동, 피부와 조직을 제거합니다. </li><li> 척수의 전체 길이를 따라, 앞쪽에 방향으로 사후에 해부 핀으로 척수의 지느러미 중간선을 잘라요. 이것은 별도의 척수의 왼쪽과 오른쪽 양쪽으로 &quot;열린 책&quot;을 만듭니다. </li><li&gt;, 옆으로, 주변 조직을 제거 척수를 분리하고 지느러미 루트 신경 (DRG)를 쉽게받을 수 있습니다. 척수와 DRG 사이 해부 핀 또는 집게를 문지르고하여 DRG와 meninges을 제거합니다. </li><li> 집게와 척수의 꼬리 - 대부분의 끝을 잡고 실험자부터 멀리 올려서하여 본문에서 척수를 제거합니다. 나머지 DRG와 meninges을 제거합니다. </li><li> 포셉 (또는 접시에 핀)와 척수의 한쪽 끝을 잡고 척수를 이등분하는 배면의 중간선을 따라 잘라 Vannas 가위를 사용합니다. </li><li> 조직을 고정하고 조직의 길이를 따라 작은 explants (100-500 음 길이)를 잘라 Vannas 가위를 사용하는 집게와 explant의 한쪽 끝을 잡아. 바닥 플레이트 한 explant 가장자리를 따라 조직의 명확한 농화로 인식된다. </li><li> 0.5 ML 차가운 해부 매체와 24 잘 접시에 explants를 전송하기 위해 넓은 입을 pipet 팁을 사용합니다. 얼음 explants는 조직 생존, F를 유지하기 위해 계속또는 최대 4 시간. </li></ol> 4. neurite 반응을 테스트하기 위해 정화 단백질과 문화를 Explant <ol><li> 제조 업체의 지시에 따라, 얼음, 15 ML 원뿔 튜브 1.5 MG / ML 콜라겐 솔루션을 준비합니다. </li><li> 콜라겐 솔루션 7-7.4를 사용하여 산도 표시기 종이의 산도를 가지고 있는지 확인합니다. 1 μl 권 NaOH를 추가하여 산도를 조정합니다. </li><li> 다양한 입 pipet 팁 및 대기음 초과 액체를 사용하여 24 자 판에 explants을 전송합니다. 여러 explants 잘 하나에 교양 수 있지만, 서로 별개로 적어도 500 μm의를 배치해야합니다. </li><li> 잘 explant를 포함하는 콜라겐의 0.5 ML을 추가합니다. 우물의 바닥 표면에 explant를 놓습니다. 콜라겐은 상온에서 중합 시작되므로 다음 잘 진행하기 전에 완전히 각 문화를 설정해야합니다. </li><li> 콜라겐 중합에 30-45 분 ° C 슬라이드 따뜻한 37 문화 판을 놓습니다. 콜라겐은 polyme을 때그것이 젤 닮았 것입니다 rized. </li><li> 정화 단백질 (PBS에 희석) 또는 PBS (제어) 중 하나와 함께 보충 0.5 ML 따뜻한 explant 문화 매체를 추가하고 37 품어 ° C, 5 % CO 2. neurite 가지의 효과는 24 시간으로 표시됩니다. 참고 : 42 시간 문화 SAG의 explants에 동일한 프로토콜을 사용하고 있습니다. </li></ol> 5. 방향 neurite의 파생물을 테스트하는 단백질 코팅 비즈와 공동 문화를 Explant <ol><li> explant 문화 단계 4.1-4.4로 시작합니다. </li><li> pipet을 사용하여 PBS에서 잘 콜라겐 솔루션과 explant를 포함하는 1-5 비즈를 전송. </li><li> explant의 가장자리에서 비즈 50-500 μm의 위치를​​ 위해 집게를 사용하십시오. </li><li> 콜라겐 중합에 30-45 분 ° C 슬라이드 따뜻한 37 접시를 놓습니다. 조직이나 비드는 콜라겐이 polymerizes로 전이 될 수 있습니다. 첫 5 분 동안 문화와 다시 위치 조직 및 구슬을 확인하십시오. </li><li> 0.5 m 추가내가 잘하는 각각의 미디어를 SAG 24 시간 동안 품어. </li></ol> 6. immunohistochemistry로 neurite 가지의 시각화 <ol><li> PBS의 문화를 씻어 PBS에서 4 % paraformaldehyde로 실온에서 1 시간 수정. </li><li> 테플론 마이크로 주걱의 둥근 엔드와 젤의 가장자리 주변의 추적에 의해 우물의 벽에서 젤 풀어. 우물에서 젤로 immunostain을 수행합니다. PBS로 여러 번 씻어. </li><li> 4 박 0.5 ML 차단 솔루션 (10 % 송아지 혈청, PBS에 0.​​1 % 트리톤 X - 100, 0.1 %의 나트륨 azide) ° C.에 품어 </li><li> 4 박 0.5 ML 차 항체 (항 - β - Tubulin 항체가 솔루션을 차단에 1:500 희석)에 품어 ° C. </li><li> PBS로 여러 번 씻어. 4 박 0.5 ML 차 항체 (알렉사 형석 488 염소 안티 - 마우스 IgG 항체 2B가 1:500 희석)에 품어 ° C. 앞으로이 단계부터의 감도를 조명으로 인해 호일에 어두운 또는 포장에 접시를 유지보조 항체. </li><li> ° C PBS에서 일주일 4에서 PBS와 저장소에 여러 번 씻어. </li></ol> 7. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> 그림 1. 정화 NT - 3 및 E4 여자는 SAG의 explants에서 NT - 3 - 코팅 구슬의 neurite - 촉진 효과의 대표적인 결과입니다. 신경 세포 기관 및 neurites β - Tubulin와 immunostained 및 공촛점 현미경에서 10X 목적으로 몇 군데를했다 SAG. 체외 24 시간 후, SAG의 explants 컨트롤 (1A)에 비해, NG / ML 정화 인간 NT - 3는 세포 배양 매체 (1B)에 추가 100 존재에 큰 neurite의 파생물을 표시합니다. SAG의 뉴런은 NT - 3의 포인트 소스가 로컬 neurite 가지를 홍보할 수 있습니다는 것을 입증하는 in100 NG / ML NT - 3 절어 비즈와 공동 교양되었습니다. Explants 더 표시되고 측면에 밀도 neurite 가지비드가 반대편 (1D)에 비해 및 PBS (1C)에 배어 구슬과 문화를 제어에 비해 직면 explant. 스케일 바 = 200 μm의. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> 그림 2. E6 병아리 척수에 정화 Wnt5a 및 Wnt5a - 코팅 구슬의 neurite - 촉진 효과의 대표적인 결과입니다. 척수의 explants는 β - Tubulin와 immunostained 및 공촛점 현미경으로 몇 군데 있었다. 정화 마우스 Wnt5a (400ng/ml), 병아리, 척수의 explants에서 neurite 가지의 존재 성장 24 시간의 증가 이후 (2B) Wnt5a (2A)없이 양식 컨트롤에 비교했다. 500 NG / ML Wnt5a에 배어 구슬은 또한 문화 (2C)를 제어에 비해 neurite 가지 (2D)를 추진하고, 척수의 explants의 가장자리 300-500 μm의 배치. 비슷한 공동 문화 결과는 이전에 다음 ID로 Wnt5a - 표현 세포 8 발표했다. 스케일 바 = 200μm의.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 혈청이없는 조건에서, 병아리의, 문화 E4의 SAG와 E6 척수의 explants을 해부하다하고 방법을 제시한다. 이 절차는 현재 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 대한 다양한 분비 리간드의 효과를 연구하기 위해 연구실에서 사용됩니다. 이 프로토콜의 소설 측면 culturing의 explants와 SAG의 neurite의 파생물에 대한 효과를 연구하기 위해 성장 요인에 배어 구슬의 사용을위한 혈청없는 시스템의 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 장비 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td></td><td></td><td> 우리는 brightfield 기본 조명과 Leica M80 stereomicroscope를 사용하여 </td></tr><tr><td> 따뜻한 슬라이드 </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> 콜라겐 중합 </td></tr><tr><td> 닭고기 계란 인큐베이터 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 humidified 세포 문화 인큐베이터 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 해부 자료 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;복사, 코팅 페트리 접시 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24 물론 세포 배양 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 뒤몽 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 뒤몽 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> 스테인레스 해부 핀 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 26002-10 </td><td> 배아 달아, 괜찮아요 해부 </td></tr><tr><td> 모리아 구멍 스푼 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10370-17 </td><td> 배아 수확 / 전송 </td></tr><tr><td> 200 μl 넓은 입 pipet 팁 </td><td> 다트 과학 Inc의 </td><td> 118 - 96R </td><td> Explant 전송 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 E6와 닭고기 달걀 </td><td></td><td></td><td> &amp; NBSP; </td></tr><tr><td> 칙 울리는의 솔루션 </td><td></td><td></td><td> 배아 수확 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> 시그마 </td><td> H8264 </td><td> 절개를 SAG </td></tr><tr><td> L15 매체 </td><td> 시그마 </td><td> L5520 </td><td> 척수의 해부 매체 </td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11150 </td><td> 척수의 해부 매체 </td></tr><tr><td> Vannas 가위 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 501,778 </td><td> 척수의 해부 </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 준비 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 쥐 - 꼬리 콜라겐 유형 I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,249 </td><td> Explant 문화 </td></tr><tr><td> 10X PBS (무균) </td><td></td><td></td><td> NEU하기콜라겐 tralize </td></tr><tr><td> 1N NaOH (무균) </td><td></td><td></td><td> 콜라겐을 무력화 </td></tr><tr><td> 증류수 (무균) </td><td></td><td></td><td> 콜라겐을 무력화 </td></tr><tr><td> 산도 표시기 신문 (6.0-8.1) </td><td> 워트 먼지 </td><td> 2629-990 </td><td> 콜라겐 산도를 확인하려면 </td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 튜브 </td><td> 다트 과학 Inc의 </td><td> 818 - PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 μl 넓은 입 pipet 팁 </td><td> 다트 과학 Inc의 </td><td> 119 - R100 </td><td> pipet의 콜라겐하기 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explant 문화 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 매체 </td><td> 시그마 </td><td> D8437 </td><td> Explant 문화 매체 </td></tr><tr><td> ITS 1 </td><td> 시그마 </td><td> I2521 </td><td> 중간 보충 </tD&gt; </tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 중간 보충 </td></tr><tr><td> CNTF (쥐) </td><td> 시그마 </td><td> C3835 </td><td> 중간 보충 </td></tr><tr><td> NT - 3 (인간) </td><td> 시그마 </td><td> N1905 </td><td> 중간 보충 </td></tr><tr><td> 정화 마우스 Wnt5a </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 645 - WN - 010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi - 겔 블루 겔 비즈 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immunohistochemistry </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td> 정치 </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 물에 빨고 </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 시그마 </td><td> T9284 </td><td> 차단 솔루션 </td></tr><tr><td> 나트륨azide </td><td> 시그마 </td><td> S8032 </td><td> 차단 솔루션 </td></tr><tr><td> 송아지 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> 차단 솔루션 </td></tr><tr><td> 마우스 단클론 IgG2b 방지 β Tubulin 1 + II 항체 </td><td> 시그마 </td><td> T8535 </td><td> 레이블 셀 기관 및 neurites </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488 염소 항 마우스 IgG2 B 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> β Tubulin 항체를 감지 </td></tr><tr><td> 테플론 마이크로 주걱 </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> 우물에서 릴리스 콜라겐 젤 </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

닭 내이 (内耳)의 감각 기관은 statoacoustic 신경절 (SAG) 뉴런의 주변 장치 프로세스에 의해 innervated 있습니다. 감각 기관의 innervation이 성장 axons 및 / 궤도를 따라 그들의 감각 기관 목표 내에 축삭 안내 단서 1과 생존 요인 2 조합에 따라 달라집니다. 예를 들어, 전형적인 축삭지도 신호 경로, semaphorin - neuropilin와 기능 간섭은 귀의 axons 3 misrouting 생성. 또한, 여러 가지 성장 요인 Neurotrophin - 3 (NT - 3) 및 뇌 유래 Neurotrophic 팩터 (BDNF)를 포함 내이의 감각 대상, 표현하는 것은 다시 SAG의 axons 4 misrouting로 이어지는, 유전자 변형 동물에 조작되었습니다. 이 같은 분자 체외 5,6의 생존과 여자는 SAG의 뉴런의 neurite의 파생물을 모두 추진하고 있습니다. 여기서는 설명하고 체외 방법에서 현재 U있는 입증알려진 같은 Wnts 같은 morphogens뿐만 아니라, SAG의 neurite의 파생물 및 신경 세포 생존을 촉진에 중요한 성장 요인을 포함하여 가용성 단백질에 여자는 SAG의 neurites의 반응을 테스트하는 노래. 이 모델 시스템을 사용하여, 우리는 분비 리간드는 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 견딜수 수있는 효과에 대한 결론을 그릴 수 있도록 최선을 다하겠습니다. SAG의 explants은 배아 일 4 (E4)에 해부 및 24 시간 동안 혈청이없는 조건 입체 콜라겐 젤의 양식입니다. 첫째, neurite 응답은 단백질 보충 매체 culturing의 explants에 의해 테스트됩니다. 그런 다음 분비 리간드의 포인트 소스 neurite 가지에 대한 방향성 영향을 미칠 수 있는지 여부를 물어, explants는 단백질 코팅 비즈와 공동 교양 및 지역 홍보 또는 파생물을 억제하기 위해 비드의 능력에 대한 assayed 있습니다. 우리는 또한 해부의 실연 (7 번 프로토콜 수정) 및 E6 척수의 explants 문화를 포함합니다. 우리정기적으로 단백질과 단백질 절어 구슬의 bioactivity을 확인하기 척수의 explants를 사용하고 SAG의 explants 같은 문화 조건에서, 병아리, 조직과 종에게 교차 반응을 확인할 수 있습니다. 시험 관내 assays에서 이들은 신속 특히 생체내에서 연구를 수행하기 전에, 영양 (생존) 또는 SAG의 뉴런에서 열대 (방향) 효과를 발휘 분자에 대한 심사를위한 편리합니다. 또한,이 방법은 높은 신경 세포의 생존 8, 혈청이없는 조건에서 각각의 분자의 테스트를 수 있습니다.

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 - 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.

Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

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JoVE Journal

Neuroscience

12.0K 조회수.  Purdue University. 우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 - 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.

비디오: Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

마우스에서 완전한 Transection 형 척수 손상의 유도

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...