우리는 그의 뛰어난 기술 지원, 지적 입력 및 정신적 지원 앞서 연구를 이동하는 역할을했다 앨리스 고간과 자오 - 징 왕에게 빚을 졌네. 이러한 연구 GAH에 NIH 보조금 AI036532에 의해 지원되었다.

1. 치명적인 조사 <ol><li> 사용되는 irradiator와 호환 microisolator 케이지에 10받는 마우스까지 넣습니다. </li><li> 총 복용량을 (BALB.B 수신자에 대한 총 투여 량 = 9 cGy)의 합계가 2 회에 걸쳐 동일한 비추다. 두 번째 조사는 먼저 한 후 3 시간이어야합니다. 사출 최종 조사 후 4-6 시간 사이에 발생합니다. C를 137 소스 나 RS2, 000, irradiator 하나를 비추다 마우스. </li><li> 이식 때까지 산성화 물과 microisolator 케이지에서 두 번째로 방사선 선량, 상점 쥐를 따라. </li></ol> 2. Splenocyte 준비 <ol><li> 기관 지침에 따라 한 기증자 마우스를 안락사시켜야. 125x10 6 splenocytes - 각 기증자는 일반적으로 75x10 6 산출. 12x10 6 CD8 T 세포 - CD8 정화 키트를 사용하여 각 마우스는 일반적으로 6x10 6 산출. </li><li> 첫번째 오른쪽 바로 중간 선에 수직 2cm 절개 2cm을 만들어 비장을 제거흉곽 아래에. 모피, 피부와 내장의 막으로 자른다. </li><li> 비장을 제거 5 % FBS와 1640 RPMI로는 배양 접시에 40 μl 메쉬 화면에서 비장을 배치하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 전체 비장이 메쉬 화면 통과 될 때까지 비장을 분리 부술 수있는 주사기 플런저를 사용하십시오. </li><li> 각 WT와 L2G85.B6 기증자에 대해이 과정을 반복합니다. 1-50 ML 원뿔 튜브에있는 모든 WT 단세포 정지를 수집하고, 별도의 50 ML 원뿔 튜브에있는 모든 L2G85.B6 단세포 정지를 수집합니다. </li><li> 4에 10 분에 1,200 rpm으로 세포를 원심 분리기 ° C. 5% FBS와 카운트 세포와 1,640 RPMI에 Resuspend 펠릿. </li></ol> 3. 골수 준비 <ol><li> 기증자 마우스 중 하나 뒷다리에서 피부를 제거합니다. </li><li> 대퇴골과 경골주의 / 비골에서 가능한 한 많은 근육 조직으로 떼어. </li><li> 엉덩이 관절에서 떨어져 대퇴골을 절단하여 뒷다리를 제거합니다. 단 경골 / 비골 교차로 아래 뒤쪽 손을 떼어. 모든 뼈 인하는 튼튼한 가위를 사용하여야한다. </li><li> 주의 깊게 남아있는 근육 조직을 제거합니다. 비골 - 비교적 적은 골수가 비골에서 발견하고 노력을 가치가되지 않습니다 잘라. </li><li> 두 번째 뒷다리와 추위 1,640 RPMI 5퍼센트 FBS를 반복 과정에서 뒷다리를 배치합니다. 40x10 6 골수 세포 - 각각의 마우스는 20x10 6 시까 얻을 수 있습니다. </li></ol> 4. 골수 제거 <ol><li> 추운 미디어 (~ 1 ML)의 적은 양으로 큰 배양 접시에있는 미디어 및 장소에서 한 뒷다리를 제거합니다. </li><li> 무릎 관절을 떼어. 경골에 주사기 (볼륨&gt; 5 ML), 삽입 피하 바늘을 사용하여 모든 빨간색 자료는 경골의 내부에서 제거 될 때까지 주사기를 놓으면 되죠. 대퇴골과 과정을 반복합니다. 골수이없는 나머지 뼈를 폐기하십시오. 둘째 뒷다리와 과정을 반복합니다. </li><li> 대형 페트리 접시 및 사용 주사기 플런저와 μl 40로 골수를 포함하는 pipetting 미디어에 의해 단일 ​​세포 현탁액을 만듭니다화면을 조화. 피펫 단세포 50 ML 원뿔 튜브에 서스펜션과 얼음 계속. </li></ol> 5. 3 번 CD 고갈 골수에서 3 번 CD + 세포를 고갈하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 우리 연구실은 Miltenyi Biotec (- 130-093-021에는 3 번 CD-비오틴)에서 만든 키트를 사용합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 골수에서 3 번 CD + 세포를 고갈시킵니다. Miltenyi 키트에 대한 버퍼는 지금의 맥 버퍼 (2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), PBS, pH를 7.2에서 0.5 % BSA)라고합니다. <ol><li> 4에 10 분 ° C 및 count 세포에 1,200 rpm으로 splenocytes 및 골수 세포를 centrifuging하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 모든 표면에 뜨는을 제거합니다. Resuspend 골수 맥 버퍼 1 천만 골수 세포 당 100 μl의 세포. </li><li> 사용에는 3 번 CD 고갈로 계속은 &#39;프로토콜을 생산하고 있습니다. </li><li> 멸균 PBS로 3 번 CD 소모의 골수 세포에게 3 번 씻으십시오. 카운트 3 번 CD는 골수 세포를 고갈과 10 7 세포를 삽입 할 수있는 적절한 볼륨에 resuspend. </li></ol> L2G85.B6 마우스에서 CD8 T 세포를 정화하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 또한, WT splenocyte 기증자에서 CD8 T 세포를 고갈하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 우리 연구실은 Miltenyi Biotec (- 130-049-401, CD8 정화 - 130-095-236 CD8 고갈)에서 키트를 사용합니다. <ol><li> 10 7 세포 당 90 μl 맥 버퍼에 WT 펠렛을 Resuspend. &#39;프로토콜 (- 130-049-401 CD8 고갈) 제조에 따라 CD8 T 세포 고갈를 계속합니다. </li><li> 10 7 세포 당 40 μl 맥 버퍼에 L2G85.B6 펠렛을 Resuspend. &#39;프로토콜 (- 130-095-236 CD8 정화) 제조​​에 따라 CD8 T 세포 정화를 계속합니다. </li><li> 각 셀 인구를 산출하고 멸균 PBS 각 인구에게 3 번 씻는다. 18x10 6 WT (CD8 소모) splenocytes 및 2x10 6 CD8 T 세포를 정화 L2G85.B6를 삽입하기 위해 적절한 볼륨에있는 각 인구 Resuspend. </li></ol>7. 사출 준비 <ol><li> microcentrifuge 관에서 CD8 T 세포를 정화 10 7 3 번 CD 고갈 골수 세포, 18x10 6 WT (CD8 소모) splenocytes, 그리고 2x10 6 L2G85.B6 조화를 이루고 있습니다. 300 μl에 멸균 PBS와 resuspend로 씻으십시오. </li><li> 받는 마우스의 꼬리 정맥에 셀 준비를 삽입. 주사는 28 게이지 바늘을 사용하여 수행해야합니다. </li><li> 산성화의 물 microisolator 케이지에 저장 마우스. 점수 마우스는 매일 쿡 외 1 개발 점수 GVHD 점수 시스템을 사용합니다. </li></ol> 8. 발광 생물 이미징 <ol><li> 여섯 일 후 이식, 4 MG D-luciferin을받는 쥐를 주입. luciferin 5 분 루시 페라 제와 반응 할 수 있습니다. </li><li> 작은 binning 5 분 동안 bioluminescence의 영상 및 이미지 수신자의 isoflurane 챔버에 마우스를 마취. 가능한 한 많은 이벤트로 수집하는 동안이 고해상도 이미지를 생성합니다. </li><li> 생활을 사용하여 데이터를 분석이미지 소프트웨어. 의사 색 이미지의 규모는 최상의 결과를 얻을 수 있도록 변경 될 수 있습니다. 그러나, 같은 규모의이 실험에서 사용하는 것이 필수적입니다. </li><li> 관심 영역은 관심의 각 지역에서 방출되는 자속을 (광자 / 초) 계산하여 정량화 할 수 있습니다 생활 이미지 소프트웨어 및 조명 emittance를 사용하여 생성 할 수 있습니다. </li></ol> 9. 대표 결과 약 7-10일 게시물 이식, 쥐 GVHD의 임상 징후를 보여주는 시작합니다. 마우스 미용 부족으로 단 정치 못한 인해 나타납니다. 수신자는 7~10일 게시물 이식 사이에 체중을 잃게됩니다. 받는 마우스의 활동과 자세는 약 12​​-14 일 후 이식까지 비교적 정상으로 유지됩니다. 누적 GVHD 점수는 꾸준히 최초의 2-3주 게시물 이식 (그림 1A)를 통해 증가 할 것이다. 질병 과정은 마우스 사이에 매우 변수입니다하지만, 수신자가 균일 30-40 D에 의해 GVHD에 굴복해야합니다ays 후 이식 (그림 1B). 그림 2는 6 일 후 이식을 이미지로 된받는 사람 쥐를 보여줍니다. 의사 색의 규모는 비장과 창자에서 방출되는 높은 광도로 몸 가벼운 emittance를 변화 보여줍니다. 속에서 CD8 T 세포의 축적은 이전 연구 결과 6 일치합니다. 받는 마우스는 이후 시점에서 이미징 또는 전직 생체 이미징에 대한 euthanized 할 microisolator 케이지에 다시 배치 할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 기준 </td><td> 등급 0 </td><td> 1 학년 </td><td> 2 급 </td></tr><tr><td> 체중 감량 (wkly.) </td><td> &lt;10 % </td><td> &gt; 10 % - &lt;25 % </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> 자세 </td><td> 표준 </td><td> 나머지에서만 Hunching </td><td> 여러 hunching, impairs movemeNT </td></tr><tr><td> 활동 </td><td> 표준 </td><td> 활동 감소를 운영 마일드 </td><td> 자극하지 않는 고정 </td></tr><tr><td> 모피 텍스처 </td><td> 표준 </td><td> ruffling 검토 할 온화한 </td><td> 심한 ruffling / 가난한 정리 </td></tr><tr><td> 피부 질감 </td><td> 표준 </td><td> 손 / 꼬리 크기 조정 </td><td> denuded 피부의 명백한 지역 </td></tr></tbody></table> 표 1. 쿡 외 1996 1이 점수 시스템을 개발했습니다. 마우스는 왼쪽에있는 기준의 각에서 매일 골을해야합니다. 각 마우스는 각 기준에 대해 0-2의 점수를 부여하고 총 점수는 모든 개별 점수의 합입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> 그림 1. Lethally 방사능 BALB.B은 10 7 뼈 이식되었습니다골수 세포 단독으로 또는 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화 18x10 6 CD8 T 세포 고갈 WT splenocytes 및 2x10 6. A) 골수을받는 임상 점수 데이터를 단독으로 또는 CD8 T 세포와 WT splenocytes을 소진하고 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화. B) 골수을받는 단독으로 또는 함께의 서바이벌 데이터 CD8 T 세포 WT splenocytes을 소진하고 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> 그림 2. Lethally 방사능 BALB.B 마우스는 10 7 골수 세포 단독으로 또는 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화 18x10 6 CD8 T 세포 고갈 WT splenocytes 및 2x10 6으로 이식되었다. 받는 사람이 intraperitoneal 주사를 통해 4 MG D-luciferin을 주입 한 작은 binning에서 5 분 동안 Xenogen의 IVIS를 사용하여 이미징했다. PS보라색은 낮은 강도를 나타냅니다, 붉은 관심의 높은 강도 지역별은 전체 마우스와 총 자속 (광자 / 초) 주변에 그려진 된 정량화 된 나타냅니다 eudo 색의 이미지가 표시됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> 그림 3. Lethally 방사능 BALB.B 마우스는 10 7 골수 세포 단독으로 또는 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화 18x10 6 CD8 T 세포 고갈 WT splenocytes 및 2x10 6으로 이식되었다. 받는 사람이 intraperitoneal 주사를 통해 4 MG D-luciferin을 주입 한 작은 binning에서 5 분 동안 Xenogen의 IVIS를 사용하여 이미징했다. 보라색은 낮은 강도를 나타냅니다과 빨간색이 높은 강도를 나타냅니다 의사 색 이미지가 표시됩니다. 받는 사람이 A) 4 일, B) 일 6, C) 일 8 포스트 송금 이미징했다.

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	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 마우스에 GVHD 유도를위한 프로토콜은 손쥐 GVHD의 임상 관련 모델을 나타냅니다. 원래 버거 외에 의해 설립. 1994 년 BALB.B 변형 조합에 C57Bl / 6 의존 CD4, 가장 일반적인 임상 시나리오 3 매우 유사한 CD8 T의 effectors 2에 의해 중재 GVHD 사망률과 MHC-일치합니다.이 그것은 혼자 CD8 T 세포를 이식하면이 모델 GVHD 발생하지 않습니다 알려져 있지만, 질병의 진행은 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μM 셀 스트레이너 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e - 비오틴 </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 비오틴 Microbeads </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a Microbeads </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-049-401 </td><td> 비장에서 CD8 T 세포를 고갈하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td> CD8a 정화 항체 칵테일 </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-095-236 </td><td> 정화하는 데 사용비장에서 CD8 T 세포. </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

그라프 트 - 대 - 호스트 질환 (GVHD)는 hematological 결함의 다양한 치료 요법으로 골수 이식의 광범위한 사용에 제한 장벽입니다. GVHD는받는 사람에 주입하는 골수 이식에 존재하는 성숙 alloreactive T 세포에 의한와 호스트 장기에 손상을 일으킬 수 있습니다. 그러나 마우스에서 T 세포는 GVHD 원인 골수 inoculum에 추가해야합니다. 광범위한 작업은 T 세포 응답 포스트 이식을 특성화하기 위해 수행되었지만, 발광 생물 이미징 기술은 생체에서 T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는 비 침습적 방법입니다. 치명적인 조사 후,받는 사람 쥐들이 기증 마우스의 골수 세포와 splenocytes으로 이식되어 있습니다. L2G85.B6 (constitutively 루시 페라 제 표현 형질 전환 생쥐)에서 T 세포의 하위 집합은 이식에 포함되어 있습니다. 특정 T 세포 하위 집합을 이식함으로써, 하나는 생체에서 특정 T 세포 하위 집합을 추적 할 수 있습니다과 위치에 따라 다양한 시간 지점에서 GVHD 홍보에서 특정 T 세포 하위 집합의 역할에 관한 가설을 개발합니다. 미리 결정된 간격 게시물 이식에서받는 마우스는 Xenogen IVIS CCD 카메라를 사용하여 이미징 있습니다. 빛의 세기가 광자 강도 (빨간색 = 높은 강도, 보라색 = 낮은 강도)을 기반으로 한 의사 컬러 이미지를 생성하는 생활 이미지 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 4-7일 게시물 이식 사이에받는 마우스는 GVHD의 임상 징후를 보여 시작합니다. 쿡 외. 1받는 사람 쥐 모피 텍스처, 피부 무결성, 활동, 체중 감소 및 자세에 따라 질병의 진행을 quantitate 할 수있는 점수 시스템을 개발했습니다. 마우스는 매일 채점, 그리고 그들이 죽어가는이 될 때 euthanized 있습니다. 받는 마우스는 일반적으로 20-30일 게시물 이식 죽어가는이됩니다. 손쥐 모델은 GVHD의 면역학을 공부를위한 유용한 도구입니다. 선택적으로 특정 T 세포 하위 집합 알을 이식각 하위 집합이 재생 역할에주의 식별 낮은. 비 invasively 생체에서 T 세포 응답을 추적하는 것은 손쥐 GVHD 모델에 가치의 또 다른 레이어를 추가합니다.

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Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는 능력<em&gt; 생체 내</em&gt; 이식 - 대 - 호스트 질병 중 T 세포 응답의 개발 및 영구화에 대한 자세한 분석을 할 수 있습니다.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K 조회수.  The Ohio State University Medical Center. 손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는 능력 생체 내 이식 - 대 - 호스트 질병 중 T 세포 응답의 개발 및 영구화에 대한 자세한 분석을 할 수 있습니다.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...