이 새로운 골수 이식 프로토콜은 숙주 수지상 세포가 이식 대 숙주 및 이식편 대 백혈병 반응을 이식하는 방법을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. Ex vivo 세포 재생을 통해 이 프로토콜은 단순히 배양 상태를 수정하여 대식세포 및 호중구와 같은 다른 면역 세포 집단의 역할을 테스트하도록 적응할 수 있게 한다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 실험실 매니저 크리스탈 호색과 학부 산예프 구르샤니가 될 것입니다.
기증자 T 세포 고갈 C57BL/6 골수 제제의 경우, 안락사 한 기증자 마우스의 표준 프로토콜에 따라 대퇴골과 경골을 수확하고 뼈를 1 % RPMI 배지를 함유 한 92 밀리미터 직경페트리 접시로 옮직다. 가위를 사용하여 각 뼈에서 끝을 제거하고 신선한 1 % RPMI 매체가있는 26 게이지 바늘이 장착 된 3 밀리리터 주사기를 채웁니다. 바늘을 한 뼈의 한쪽 끝에 삽입하고 플런저를 우울하게 하여 골수를 캐비티 밖으로 플러시하고 수집 셀 스트레이너로 넣습니다.
모든 골수가 수집되면 75 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 골수 조각을 변형시키고 단일 셀 서스펜션을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮킨다. 세포를 원심분리에 의한 퇴적물을 환원하고 0.5%BSA로 보충된 PBS의 밀리리터 농도당 6개의 세포에 20배 10회 10회에서 펠릿을 재연한다. 다음으로, 1회 당 THI1 항체0.05 마이크로그램을 6세포에 10마이크로그램을 추가하여 섭씨 4도에서 30분 배양에 대한다.
인큐베이션이 끝나면 10밀리리터의 얼음 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻고 0.5%BSA의 밀리리터 농도당 7개의 세포로 2회 10시에 펠릿을 재봉, 37도에서 45분간 배양할 수 있는 멸균수에 2%DNAse를 보충하였다. 인큐베이션이 끝나면 세척당 15밀리리터의 신선한 PBS로 세포를 두 번 세척하고 0.5%BSA를 함유한 PBS의 20밀리리터에서 펠릿을 재놓습니다. 림프절과 비장을 40 마이크로미터 모공 스트레이너에 풀링하고 주사기 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직을 제거하여 세포를 방출합니다.
1%FBS로 보충된 RPMI 배지로 스트레이너와 플런저를 세척하여 모든 세포와 퇴적물을 원심분리에 의한 세포와 퇴적물을 수집합니다. 세포 펠릿에 ACK 리시스 버퍼 5밀리리터를 추가합니다. 실온에서 5 분 후, 1 %의 FBS로 보충 된 중간 크기의 5 밀리리터와 반응을 중지하고 원심 분리에 의해 백혈구를 펠릿.
계산을 위한 MACS 버퍼의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 신선한 MACS 버퍼에서 밀리리터 당 8개의 세포에 2회 10의 농도로 세포를 희석한다. 항에리스로이드, 항과립구, 항B세포 및 항NK 세포 고갈 항체의 적절한 농도를 섭씨 4도에서 15분 배양하기 위해 6세포에 1회 10회당 첨가한다. 인큐베이션이 끝나면 10밀리리터의 얼음 차가운 MACS 버퍼로 세포를 세척하고 신선한 MACS 버퍼에서 밀리리터 농도당 8개의 세포로 10회 10회에서 펠릿을 재연합니다.
다음으로, 섭씨 4도에서 15분 배양을 위해 혼합된 6개의 세포에 1회 당 1회 당 0.22 마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 얼음 차가운 MACS 버퍼의 10 밀리리터로 세포를 세척하고 표준 비드 절연 프로토콜에 따라 MACSxpress 분리기를 사용하여 자기 비드 분리에 의해 결합되지 않은 농축 T 세포를 수집합니다. 분리의 끝에서, T 세포를 원심분리에 의한 퇴적물 및 계산을 위한 신선한 MACS 버퍼의 5밀리리터에서 펠릿을 재보종.
골수 유래 수지상 세포를 생성하기 위해, 야생형 또는 인자 B 녹아웃 마우스의 대퇴골으로부터 골수를 증설하고 ACK 리시스 버퍼의 5밀리리터에서 적혈구를 분해하고, 5분 후 1%FBS로 보충된 RPMI의 10밀리리터로 반응을 중지한다. 원심분리에 의한 전혈구를 수집한 후, 배양 배지의 10밀리리터에서 밀리리터 농도당 6세포에 10나노그램을 2배로 재차, GM-CSF의 밀리리터당 20나노그램을 세포에 첨가한 후 37°C의 100밀리리터를 개별 100x15mm 페트리 요리에 10밀리리터를 첨가한다. 6일째에는 골수 유래 수지상 세포 배양을 플레이트당 LPS 밀리리터당 25마이크로그램으로 활성화합니다.
배양된 골수 세포의 85% 이상이 수지상 세포로 분화한다. 자기 비드 농축 후 T 세포 순도는 90 %이며 주요 MHC 불일치 C57BL / 6 BALB / c 모델은 이식 후 GVHD 개발에 밀접하게 대응한다. 중증도의 피크는 세포 전달 후 약 11 일 발생 한 다음 임상 점수및 체중 회복의 감소에 의해 16 일까지.
수령인은 이식 후 30~40일 간 GVHD에 균일하게 굴복했습니다. 흥미롭게도, 인자 B 녹아웃 수지상 세포를 가진 이식은 수신자 생존및 GVHD 임상 점수를 향상시킵니다. 루시파라제-트랜스포동 A20 B 세포 림프종은 살아있는 동물의 종양 성장을 모니터링할 수 있게 한다.
이 대표적인 실험에서는 골수를 단독으로 받은 모든 야생형 BALB/c 수신자와 A20이 종양 재발로 사망했다. 골수 유래 ACC1 고갈된 기증자 T 세포로 이식된 야생형 BALB/c 수신자는 GVHD로 사망하였다. 또한, 기증자 골수와 ACC1 고갈된 T 세포를 수신한 동물은 GVHD와 종양 재발 둘 다에서 정지했습니다.
충분한 골수 세포를 생성하려면 수집 된 경골과 대퇴골 뼈는 골수 교정 전에 근육 조직이 완전히 없어야합니다. 바이오티닐라제 항 CD3 및 항-비오틴 마이크로비드를 사용하여 골수 세포의 음의 정제는 또한 골수에서 림프구를 고갈하기 위해 수행 될 수 있습니다.
