<p class="jove_content"&gt; 저자 유동세포계측법 분석 및 정렬와의 도움 제니퍼 이상하고 그렉 Bauman 감사하고 싶습니다. 이 작품은 FM으로 NCRR에서 NIH 그랜트 번호 2P20 RR020171 의해 켄터키 시작 자금의 대학에 의해 지원되었다; GIE는 대통령 대학원 원정대와 켄터키 기회의 원정 지원을 인정한다.</p

1. 버피 코트에서 사람 말초혈 Mononuclear 전지 (PBMCs)의 분리 <ol><li> 병원이나 인근의 혈액 센터 위치에서 버피 코트 하나의 단위를 취득. 우리의 혈액 센터는 정상적인 혈액 기증자로부터 얻은 단위당 버피 코트 40-60 대한 ML 우리에게 제공합니다. </li><li> 버피 코트를 희석하기 위해 멸균 PBS를 포함하는 autoclaved 500 ML 유리 병으로 혈액을 붓고. PBS + 버피 코트의 최종 부피 250 ML이어야합니다. </li><li> 20 ML의 Lymphoprep 솔루션으로 각 열 50 ML 원뿔 튜브를 입력합니다. </li><li> 부드럽게 Lymphoprep 솔루션을 방해하지 않도록주의되는 희석 버피 코트의 25 ML과 Lymphoprep 솔루션을 입혀라. </li><li> 500 X g에서 실온에서 30 분간 튜브를 봐. 림프구 분율을 방해하지 않는만큼, 원심의 브레이크를 해제해야합니다. </li><li> 피펫으로 Lymphoprep 및 플라즈마 - 중간 계층 간의 인터페이스에서 PBMCs를 수집합니다. 약 1 ML까지 플라즈마 - 중간 오프를 기음아직 PBMCs을 포함 버피 코트 레이어를 다룹니다. 새로운 50 ML 관에 PBMCs를 전송하는 10 ML의 피펫을 사용합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻어 후 hemocytometer 의지에 대한 차가운 RPMI의 50 ML에 세포를 resuspend. 1 X 10 9 PBMCs - 일반적인 복구는 8 × 10 8이다. </li></ol> 이 절차는 혈액의 작은 볼륨 크기를 줄일 수 있습니다. 전체 혈액 샘플의 희석은 PBS에 1시 1분입니다. 2. 총 CD4의 자기 부정적 선택 + T 세포, CD4 + CD45RA + 나이브 T의 셀 또는 CD4 + CD45RO + EasySep 농축 키트를 사용하여 PBMCs에서 메모리 T 세포 (줄기 세포 기술) 4.25 X 10 8 PBMCs ~ 1 × 10 8시 따라야 할 단계. <ol><li> 2퍼센트 FBS 및 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 PBS에서 ML 당 5 × 10 7의 최종 농도로 Resuspend의 PBMCs. 신선한 14 ML의 폴리 프로필렌 원형 바닥 튜브에 세포를 이동합니다. <ol clasS = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> 총 인간의 CD4 + T 세포가 부정적인 선택에 의한의 분리 : 인간의 CD4 + T 세포 농축 항체의 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스와 실온에서 10 분간 부화를 추가합니다. </li><li> 부정적인 선택에 의해 인간 나이브 T 세포의 격리가 : PBMC의 세포 현탁액, 믹스 ML 당 방지 CD45RO 항체의 50 μL를 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어. 10 분간 상온에서 키트 (PBMCs의 당 ML 50 μL), 믹스와 부화와 함께 제공되는 농축 칵테일을 추가합니다. </li><li> 부정적인 선택에 의해 인간의 기억 T 세포의 격리는 : 인간 메모리 CD4 + 항체의 T 세포 농축 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스를 추가하고 실온에서 10 분 동안 품어. </li></ol></li><li> 동등 솔루션 전반에 걸쳐 그들을 배포할 잘 자성 입자를 섞는다. 나이브 키트에서 와동하지 nanoparticles 해. </li><li> 자성 입자를 (100 총 CD4위한 PBMCs의 ML 당 μL +와 나이브 T 세포 선택, 메모리 T 세포 선정 PBMCs의 ML 당 50 μL) 추가합니다. 부드럽게 나이브 T 세포 선택을위한 10 분 또는 메모리 또는 총 CD4 + T 세포의 선택 5 분 동안 상온에서 3 배 및 부화를 pipetting하여 섞는다. </li><li> PBS가 튜브 당 10 ML에 볼륨을 가져 2퍼센트 FBS와 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 추가합니다. 부드럽게 총 CD4 + T 세포, 순진 및 메모리 하위 집합 각각에 대해 5, 10 또는 2.5 분 실버 EasySep 자석으로 uncapped 튜브를 삽입하기 전에 3 배를 pipetting하여 섞는다. </li><li> 여전히 EasySep 자석의 튜브를 통해 관심있는 세포를 분리하기 위해 새로운 50 ML 튜브에 액체를 부어. </li><li> 단계 2.5 나은 복구를 위해 2.6을 반복합니다. </li></ol> 3. 세포 배양 조건 규제 T 세포를 유도해야 <ol><li> 에 의한 1 단계와 2 단계, 코트 조직 배양 플레이트 전날 먼저 (안티 인 경우에는 3 번 CD 항체를 diluting멸균 PBS 1 μg / ML의 농도에 OKT3 클론). 6 잘 접시는 PBS의 2 ML + 잘마다 안티 인 경우에는 3 번 CD를 추가할 경우, 12도 접시 1 ML을 추가 또는 24도 접시 당 500 μL 잘 추가하십시오. 코팅 번호판 4시 ° C에서 사용할 때까지 유지. </li><li> RPMI-1640 2.06 밀리 권총을 미리 보충 Glutamax - 전 25 MM 10 % 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신 및 50 μm의 β-메르 캅 토 에탄올을 추가하여 편광 매체를 준비합니다 HEPES 버퍼. 다음, 2 NG / ML TGF-β와 5 NG / ML IL-2를 추가합니다. 여기, 한 리간드 또는 미디어에 관심 억제제를 추가할 수 있습니다. 2 X 10 6 세포 / 편광 매체 ML의 농도에서 2 단계의 세포를 Resuspend. </li><li> 37 미리 따뜻한 접시 ° C와 세포를 추가하기 전에 안티 인 경우에는 3 번 CD-코팅 우물의 PBS를 기음. 6 잘 접시, 24 잘 접시 12 잘 접시 또는 세포의 1 ML에 대한 세포의 2 ML에 대해 4 ML 당 우물의 세포 현탁액을 추가합니다. 의 증발을 줄이기 위해 PBS와 빈 우물을 채워미디어. 37 ° C / 5% CO 2에서 3 일 동안 알을 품다. </li><li> 3 일 게시물 도금에서, 500 X g에서 5 분간 원심에서 접시를 돌리다. 접시의 바닥에 T 세포를 방해하지 않고, 미디어의 절반을 제거하고 새로운 미디어로 바꿉니다. 우물이 세포 (3 × 10 6 / ML 이상의 농도)로 초만원 된 경우 또는, 동등하게 다른 반 인 경우에는 3 번 CD 코팅 강판으로 볼륨을 분리하고 원래의 볼륨으로 다시 새로운 매체를 추가하십시오. 37 ° C / 5% CO 2에 두명 게 세 일 동안 알을 품다. </li></ol> 4. T 세포의 세 인구의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) <ol><li> 멸균 PBS에 0.​​5 % (W / V) 소 혈청 알부민 (BSA)과 2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하여 버퍼를 세척 FACS를 준비합니다. 4에 플레이스 버퍼 ° C 감기 얻으려고 말야. </li><li> 잘 세포 배양에서 세포를 제거하고 전체 세포 회복을 위해 PBS의 2 ML 각 우물을 린스. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브에있는 모든 세포를 놓고 10 500 XG에 원심 분리기분 4에 ° C. </li><li> 세포 밀도를 결정하는 hemocytometer에 세포를 세어보세요. </li><li> 장소 3-5 보상 컨트롤에 대한 각자 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 튜브 회 × 10 5 세포. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브, 튜브 당 더 이상 35 이상 X 10 6 세포에 남아있는 세포를 놓습니다. </li><li> 4 ° C와 대기음 미디어에서 5 분 동안 세포를 내려 봐. 1 X 10 6 세포마다 추위 세척 버퍼의 90 μL으로 정렬되는 세포를 Resuspend. 감기 세척 버퍼 보상 제어 튜브의 100 μL에 Resuspend. </li><li> 정렬되는 셀, 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA-PE-Cy5 3 μL 및 1 회 안티 CD127-APC의 1 μL X 10 6 세포를 결합. 네 번째 튜브에 방지 CD127-APC의 세 번째 튜브 and1 μL로 PE-Cy5 - 최초의 보상 제어 튜브, 두 번째 튜브에 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA 3 μL에 아무런 항체를 추가 없습니다. 어둠 속에서 45 분 동안 얼음에있는 모든 튜브를 품어. </li><li&gt;는 정렬되는 셀 및 보상 제어 튜브 1 ML에서 차가운 세척 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 4에서 5 분 500 XG에서 모든 세포를 원심 ° C. </li><li> 버퍼를 세척의 ML 당 1 X 10 7 세포의 농도에서 버퍼와 resuspend 세포를 기음. 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 필터링하기 전에 세포의 ML 당 DNase II 1.5 μL를 추가합니다. 관 당 더 이상 3.5 이상 ML 여러 다섯 ML의 원형 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 세포를 이동합니다. 버퍼를 닦고 300 μL로 보상 제어 세포를 Resuspend. </li><li> PE, APC와 PE-Cy5 필터에 의해 교차 검출을 최소화하기 위해 MoFlo 흐름 cytometer에 대한 보상을 설정합니다. 한 ML 갓 태어난 송아지의 혈청을 포함하는 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 T 세포, 순진 (CD25-CD45RA +)와 메모리 (CD25 - - CD45RA) - iTregs을 (세포가 CD25 하이 CD127 -/LOW CD45RA) 정렬 게이트를 설정합니다. </li></ol> 5. 억제 분석 <ol><li> suppr 만들기ession 분석의 100 U / 페니실린의 ML, 스트렙토 마이신 100 μg / ML, 5 NG / ML IL-2 및 TGF-β에 AIM-V의 2 NG / ML를 추가하여 미디어. </li><li> 분석의 날, heterologous CD4 +와 같은 1 단계와 2 단계에 표시된 버피 코트에서 T 세포를 정화. 이것은 억압 분석의 대상 세포되며 그림 2 주 0에서 볼 수 있듯이, CD25 + Treg 세포를 포함하지 않습니다. </li><li> 세포 대신에 2 μL의 ML 당 5 밀리미터 주식 솔루션의 1 μL를 사용을 제외한 제조 업체의 지침에 따라 같은 CellTrace 키트와 라벨 세포. 직접 빛으로부터 밖으로 유지할 수있다는 것은, 5 밀리미터 주식 솔루션을 만들기 위해 CFSE 중 하나를 유리병에 CellTrace 키트가 제공 DMSO 18 μL를 추가합니다. 1 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도로 prewarmed PBS + 0.1 % (W / V) BSA의 대상 세포의 필수 수를 (1 × 10 7 최대) Resuspend. 세포의 ML 당 5 밀리미터 CFSE 1 μL를 추가 및 5 minut 위해 37 ° C의 물을 욕조에 품어네;. 염색법을 끄다 5 분 동안 얼음에 품어 10 % FBS와 완전 얼음 차가운 RPMI 5 볼륨을 추가합니다. 추위 전체 RPMI 및 resuspend 1 회 이상 전지 × 10 억제 분석 매체의 100 μL 당 5 세포. 씻으십시오 </li><li> Treg 억제 감독관 구슬은 2 X 10 7 구슬 / ML의 주식 농도에 있습니다. 구슬의 펠렛 숫자 eppendorf 튜브에 빨리 원심 분리하여 실험 당 세포의 총 수를 같음. RPMI하고 다시 펠렛과 함께 한 구슬을 씻는다. RPMI의 흡인 후 resuspend 비즈 일이 잘되어 당 구슬의 해당 금액은 억제 분석 매체의 8 μL에 있다고. </li><li> 96 잘 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에, 원하는 대상에 CFSE 묻은 세포 (1 × 10 5 세포 / ML), 경위 비즈와 신선한 억제 분석 미디어의 편광과 정렬된 세포 (1 × 10 5 세포 / ML)을 추가 (CFSE의 스테인드) : 200 μL의 최종 볼륨에서 효과기 (정렬)의 비율. 모든 조건은 tripli에서 설정합니다cates. </li><li> 물론 당 92 μL 억제 검정 매체에 CFSE의 스테인드 세포 100 μL, 경위 비즈 8 μL 신선한, 흠없는 세포 1 × 10 5를 추가하여 두 제어 조건의 첫 번째를 준비합니다. 위와 같은 세포 구성 요소지만, 감독관 비즈를 Treg 않고 두 번째 컨트롤을 준비합니다. </li><li> 5 일 동안 37 ° C / 5% CO 2로 알루미늄 호일과 부화에 커버 플레이트. </li><li> 어둠에서 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 pipetting과 장소에 의해 각각의 우물에서 세포를 수집합니다. 4 ° C, 기음 미디어에서 5 분 500 XG에 세포를 원심 분리기, 그리고 4 단계에서 버퍼를 닦고 300 μL 추운 FACS에 resuspend. 처음 3 X 10 4 CFSE + 세포 퀘스트 소프트웨어와 히스토그램에서 대상 세포를 대표하는 라이브 림프구 게이트에서 이벤트를 분석. </li></ol> 6. 대표 결과 흐름 cytometric pseudocolor의 예 5 일간의 시간을 기 이상의 플롯을 점rse 모니터링 iTreg 차별이 FoxP3과 CD25의 공동 표현 상대를 기반으로, CTLA-4 및 CD45RA는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 그림 3의 히스토그램은 iTregs (CD25 하이 CD45RA - CD127 -/LOW 세포)가 정렬되는 성공적인 억압 분석 보여줍니다. 규제 / 억제 능력을 인수했다고 5 일 문화의 유일한 부분 집합이다를 그림 4는 Tregs의 유도를 보여줍니다 나이브 T 세포 풀 (상단 패널) 및 표준 iTreg 매체에서 5 일간의 문화 이후에 메모리 T 세포 풀 (하단 패널)에서. 초기의 세포 CFSE의 염색법 역시 순진 (오른쪽 위 패널) 또는 메모리 T 세포 (하단 오른쪽 패널) 만 세포 분열 몇 라운드 후 iTregs (최고 FoxP3 - 표현 세포)로 구분 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 절차의 도식. PBMCs ART 세포 - + CD25 CD4의 자기 부정적인 선택을하기 전에 기울기 원심 분리를 통해 인간의 말초 혈액 중에 분리 5. 문화 5-6일 후, 세포는 FACS를 받아야하고 진압하는 활동을 측정하는 heterologous CFSE 분류 대상 세포와 공동 incubated됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> 그림 2 죄를 씻고 인간의 기본 CD4 + CD25 -. T 세포가 매체를 iTreg에서 배양해 있습니다. 세포가 나누어지는가 CD45RA, FoxP3, CTLA-4와 CD25 마커의 진행 상황을 모니터링하는 단지 격리 (매일 0) 이후 및 일 1, 3 및 세포 배양 5에서 수집됩니다. iTreg 프로필 CD45RA에 해당 - FoxP3 안녕하세요, CTLA-4와 CD25 안녕 안녕하세요 (인 - 그래프 창에 강조). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> 그림 3. + CFSE 라 CD4 투석을beled 세포 (1 × 10 5 / 잘가) 정렬 순진, 메모리 또는 iTreg 세포의 면전에서 억제 경감 구슬을 Treg 함께 배양해있다 (3 × 10 4 /도).에게 5 일 후에 세포가 수확되고 스테인드 세포 CFSE 프로필이 유동세포계측법에 의해 분석됩니다. iTreg 세포의 존재는 완전히 CD4의 확산 + T 세포를 abolishes. 숫자 본부받은 CFSE-라벨이 세포의 비율을 나타내는입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> 그림 4 인간의 기본 순진 죄를 씻고. (CD4 + CD25가을 - CD45RA +)와 메모리 (CD4 + CD25 - CD45RO +) T 세포가 CFSE와 매체 iTreg의 교양 물들일 수 있습니다. 5 일 후에 세포 phenotyped과 세포 분열 속도가 예상됩니다. 다른 이름으로 그림 2에 표시된 두 집합에서 차별 iTreg 집합은 해당CD45RA - CD25 안녕 FoxP3 하이와 CTLA-4 안녕하세요 (후자이 보이지 않음). 비교 CFSE의 염색법 프로필은 5 일 문화 중 가장 proliferative 세포로 iTregs를 (여기서는 가장 높은 표현 FoxP3 T 세포 등)를 확인하실 수 있습니다.

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저자가 공개하는 게 없다.

Treg 전송, 그들의 효율적인 생성 및 안정적인 유지 보수 방법을 autoimmunity 그래프트 거절 및 다른 면역 또는 염증 - 매개 질환을 퇴치에 엄청난 치료 가능성을 가지고 있지만 아직 개발되지 않았습니다. 인간의 T 세포를 순환만이 1-5%는 Tregs가로서 자신의 제어 확장과 차별화는 병원에 Tregs의 구현의 주요 억지력으로 소수를 극복. 우리가 TGN1412 재판 13 일부터 배운대로 반면에, 그것은 심히 ?...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> 축 - 방패 </td><td> 1,114,547 </td><td> 실온에서 보관 </td></tr><tr><td> 냉장 벤치 - 탑 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> 밝은 라인 Hemocytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 메모리 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 나이브 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,155 </td><td></td></tr><tr><td> 빅 쉬운 EasySep 매기그물 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 18,001 </td><td> 은화 </td></tr><tr><td> 5 ML 라운드 히프 폴리스티렌 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ML의 폴리 프로필렌은 라운드 - 어쨌든 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 안티 인 경우에는 3 번 CD 항체 </td><td> 바이오 엑스 셀 </td><td> BE0001-2 </td><td> 클론 : OKT3 </td></tr><tr><td> 24 자 셀 폴리스티렌 문화 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 자 라운드 히프 조직 배양 플레이트 </td><td> Grenier 바이오 원 </td><td> 650,180 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I와 HEPES 버퍼와 RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 72,400 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16,000 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> TGF-β1 재조합 인간 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> MP Biomedicals 주식 회사 </td><td> 810,531 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> 클론 : 4E3 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> 클론 : HI100 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> 클론 : MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNase II </td><td> MP Biomedicals 주식 회사 </td><td> 190,370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo 흐름 Cytometer </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 소프트웨어 </td><td> 트리 스타 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 세포 퀘스트 프로 소프트웨어 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 갓 태어난 송아지 고기 세럼 </td><td> Gibco </td><td> 16,010 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0,870,112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace의 CFSE의 세포 증식 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> 억제 검사기 비즈를 Treg </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm의 나일론 셀 스트레인어 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

면역 CD4 + 규제 T 세포 (Tregs)의 개발과 유지 보수 및 인체에 대한 자신과 공생 항원의 광대한 양의 immunologic의 항상성 유지에 필요한 말초 관용에 기여한다. Tregs 및 염증성 종래의 T 세포 사이의 균형을 Perturbations는 immunopathology이나 암이 발생할 수 있습니다. Tregs의 치료 주사는 대장염 1, 유형 I 당뇨병 2, 류마티스 관절염 및 이식편 대 숙주 질환, 인간 대 마우스 Treg 생물학 5 4 몇 가지 근본적인 차이점 murine 모델에 효과있는 것으로 표시되었지만 지금까지 임상 사용을 배제하고있다. 충분한 숫자, 순도, 안정성 및 치료 Tregs의 유도 특이성의 부족들이 전직 생체내 확장 6 조건을 최적화할 수있는 인간 Treg 개발의 역동적인 플랫폼을 necessitated. 여기 D4 단계로 세분 수있는 단일 인간의 말초 혈액 기증자로부터 유도된 Tregs (iTregs)의 차별 화를위한 방법 방접원을 그리다 : 말초 혈액 mononuclear 세포, CD4의 자기 선택 + T 세포의 절연, 체외 세포 배양 및 형광의 활성화 T 세포 하위 집합의 셀 정렬 (FACS). Treg 서명 전사 인자의 forkhead 상자 P3 (FoxP3)는 인간 7의 활성화 유발 전사 인자이며 다른 독특한 마커 존재 마커 조합 패널 억제 활동과 T 세포를 식별하는 데 사용해야하기 때문에. 문화에 6 일이나하면 Google 시스템에서 세포 나이브 T 세포, CD25 및 CD45RA들의 상대적인 표현을 기반으로 메모리 T 세포 또는 iTregs로 demarcated 수 있습니다. 메모리와 나이브 T 세포가 다른보고 편광 요구 사항 및 plasticities 8을 가지고로서 CD45RA +와 CD45RO로 초기 T 세포 인구의 사전 분류 + 하위 집합 수 B전자는 이러한 불일치를 검사하기 위해 사용됩니다. 다른 사람과 일치하는, 우리의 CD25 안녕 CD45RA - FoxP3 9 iTregs 명시적 높은 수준의, GITR 및 CTLA-4 11 CD127 12 낮은 수준. 각 인구의 FACS 따라 결과 세포 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE) - 라벨 T 세포 autologous의 확산을 병신하는 상대적 능력을 평가하고 억압 분석에 사용할 수 있습니다.

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

generation-induced-regulatory-t-cells-from-primary-human-nave-memory

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K 조회수.  University of Kentucky. 우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

연구

면역학 및 감염병학

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.