저자는 고정 프로토콜의 제공에 pCAGAdDU 벡터와 올리버 고르 카 구축을위한 Lirui 뒤 감사드립니다.

1. 입력 벡터에 관심 유전자의 클로닝 <ol><li> 입력 벡터로 관심의 유전자를 복제합니다. 국소 이성화 효소 결합 벡터 (예 : pENTR / D-TOPO) 또는 제한 효소 중재 복제이 절차를 사용할 수 있습니다에 무딘 엔드 내고 다음 유전자의 PCR 증폭. </li></ol> 2. pCAGAdDu 대상 벡터에 관심있는 유전자를 전송 <ol><li> LR 재조합 (예 : 게이트웨이 LR Clonase II 효소 믹스)하여 대상 벡터에 입력 벡터의 관심의 유전자를 전송합니다. 이 아데노 바이러스 발현 벡터 (그림 1)을 생성합니다. </li><li> , PACI 제한 다이제스트에서 아데노 바이러스 발현 벡터의 10 μg을 선형화 DNA를 침전하고 100 μL 당 μg의 농도로 물에 resuspend을. 선형화 V의 복제 및 encapsidation에 필요한 바이러스 거꾸로 반복 (ITR)를 줘라바이러스 입자에 iral DNA. </li></ol> 3. 기본 바이러스 해물의 생성 <ol><li> 시드 1 개 6 잘 플레이트 잘 하나 2 ㎖ 세포 배양액 10 5 HEK293A 세포 (DMEM 10 % FBS, 5 % PenStrep)와 6의 세포를 배양 - 37 14 시간 10 % ° C CO 2 배양기 그들을 준수 할 수 있도록합니다. 세포는 자랄 때 약 50 %이어야한다. </li><li> Lipofection : 전송 염화나트륨 50 μM, 소용돌이 짧게 94 μL로 jetPEI 시약 6 μL. 소용돌이로 교반하면서 100 ㎕의 선형화 된 아데노 바이러스 벡터의 혼합 용액을 추가하고 15이 형질 혼합 배양 - 실온에서 30 분. </li></ol> 아데노 바이러스 감염에 대한 적절한 바이오 안전성 조건에서 다음의 모든 단계를 수행합니다! <ol start="3"><li> HEK293A 세포 함유도에 적가 솔루션을 분배하고 37 세포를 품어 ° C와 10 % CO 2. 형광 마커를 사용하는 경우, transfe를 평가시각적 12 후 ction의 효율 - 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 36 시간. 신선한 매체의 0.5 ML 3 일마다 추가합니다. </li><li> 분리하기 시작 확대와 둥근 세포 영역입니다 변성 효과 (CPE)에 대한 빛 또는 형광 현미경을 가진 3 일 - 매 2를 확인합니다. 이 효율적으로 바이러스 생성을 나타내는 것입니다. CPE의 넓은 영역 (그림 3)의 발생에 따라, 그것은 24 소요됩니다 - 72 시간 모든 세포가 감염되기 전에. </li><li> 모든 세포는 CPE의 흔적을 보여 주지만, 세포의 전반적인 박리가 발생하기 전에, 상층와 부드러운 피펫 및 전송 세포 (SN, 3-5 ml)에 의해 세포를 분리 할 때 15 ML의 폴리스티렌 튜브. </li><li> 15 드라이 아이스의 SN에 세포를 동결 - 20 분 파열 세포에 ° C 이후 37 신속하게 해동. 이 동결 및 해동 사이클 (F / TC)를 두 번 더 반복합니다. 일 안에 사용을 위해 얼음에 기본 바이러스 해물을 유지 또는 -80 ° C 장기 저장을 위해 동결. 추가 F/ TC 30에 의해 바이러스 역가를 줄일 수 있습니다 - 50 %. </li></ol> 4. 바이러스 증폭 <ol><li> 씨와 14 센티미터 조직 배양 접시에 90 %의 합류로 HEK293A 세포를 성장. </li><li> 기본 바이러스 해물 (1.5-2.5 ML)의 절반 세포를 감염 적어도 36 시간 동안 세포를 품어. 거의 모든 세포는 형광 현미경에 의해 결정 될 수있는 다음 감염해야한다. 이미 (더 집중 즉) 증폭 된 바이러스 주식의 재 증폭, 50의 감염의 다중성 (MOI) (6.3 참조) HEK293A를 감염. </li><li> 그들 모두는 CPE를 표시하지만, 분리되기 전 세포를 수확해야한다. 효율적인 바이러스 생산이 상태는 감염 후 48 시간 이내의 거리에 있습니다. (이것은 1 주일까지 소요되는 경우, 4.2에 설명 된 감염에 사용되는 아데노 바이러스 주식의 양을 증가 증폭의 또 다른 라운드를 고려한다.) </li><li> 50 ML의 폴리스티렌 튜브에 부드러운 피펫 및 전송 세포와 SN하여 세포를 분리. 4 10 분 ° C.에 대한 300 XG에서 세포를 스핀 다운 </li><li> SN를 제거하고 중간 SN (ca. 1 ML)의 적절한 볼륨 펠렛을 resuspend을. </li><li> 4 ℃에서 15 분 800 XG에서 세포와 원심 분리를 방해하는 3 F / TC를 수행 (집중 바이러스 해물 즉) 바이러스 입자를 포함 SN을 벗고 나누어지는 바이러스 해물은 -80를 저장 ° C. </li></ol> 5. 바이러스 역가 결정 <ol><li> 씨앗 10 5 A549 세포를 잘 당에 1 ML 매체와 세포가 6 시간 동안 준수하게에 12 잘 플레이트의 5 우물. </li><li> 중간에 시리얼 희석 (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000)을 수행하고, 잘 당 10 μl를 추가하는 집중 아데노 바이러스 (얼음에 해동) 1 μl를 사용합니다. 유동 세포 계측법에 게이트를 조정 한 잘 감염되지 않은 둡니다. </li><li> 36 시간 후, PBS 및 분리 세포 (예를 들어, 트립신에 의해)로 씻어, SN를 벗어. 생물주의 사항은, 그것은 C를 해결하는 것이 좋습니다10 실온에서 분간 PBS 한 번에 세척을위한 PBS 100 μL 4 % 파라 포름 알데히드의 ELL 학생. </li><li> 감염 마커 표현의 FACS 분석을 수행합니다. 플롯 감염된 세포의 절대 수 (그림 4)에 &#39;μL 바이러스 해물 적용된&#39;. 감염의 선형 범위를 결정하고 X = 1,000 μL를 사용하여 선형 범위의 표준 곡선으로부터 희석 바이러스의 ML 당 역가를 계산합니다. </li></ol> 6. T 세포 감염 <ol><li> 에서 휴식 / 순진 CD4 T 세포를 분리 DO11.10 TG, MACS (나이브 CD4 + T 세포 분리 키트 II) 또는 FACS는 정렬을 사용하여 CARΔ1 TG 마우스 (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> 소규모 실험, 96 - 웰 둥근 바닥 플레이트 잘 하나에 MOI 50를 달성하기 위해 바이러스 해물의 적절한 볼륨을 피펫. </li><li> T 세포 배지에 50 μL의 최종 감염 볼륨 (RPMI1640, 10 % FBS, 5 % PenStrep, 5 % NaPyruvate, 1X NEAA, 1X MEM 필수에 4 × 10 5 T 세포를 추가비타민, 1X L-글루타민, 1:250,000 메르 캅토 에탄올, 10 MM HEPES). 예를 들면 : MOI 50는 3 × 10 5 T 세포를 감염하는 데 사용되어야한다; 바이러스 역가가 3 × 10 9 ML -1 바이러스 양 = MOI X T / 휴대폰 번호 / 바이러스 역가 = 50 × (3 × 10 5) (3 × 10 9 ML -1) = 0.005 ML </li></ol> 참고 : 느슨한 컵 (튜브 당 TP 3 ML까지)와 폴리스티렌 튜브 10 6 순진 T 세포 당 165 μL의 감염 볼륨 MOI 50를 사용하여 큰 세포 수, 규모의 감염. <ol start="4"><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 90 분 동안 세포를 품어. </li><li> 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어. </li></ol> (선택 사항 : 세포를보다 효율적으로 바이러스를 제거하기 위해 다시 세척 할 수있다) <ol start="6"><li> 세포를 resuspend200 μL T 세포 자극 항체가없는 및 IL-2 또는 다른 사이토 카인없이 중간 37 40 시간 동안 그들을 나머지 5 % CO 2 배양기에서 ° C가 활성화되기 전에 그 유전자의 발현을 허용합니다. </li></ol> 7. T 세포 활성화 및 편광 <ol><li> 의 볼륨 항 CD3와 작은 시약 컵에 휴대폰 번호 (예 : 4 × 10 5)에 해당 안티 CD28 결합 비즈를 피펫, PBS의 10 배 볼륨을 추가하고 2 분 동안 자석에 올려 . 상층 액을 취하여 200 μL 편광 매체 구슬 (Tregs의 경우 : T 세포 배지 + 1 NG / ML TGFβ, 100 U / ML IL-2) resuspend을. </li></ol> 참고 : 셀은 또한 안티 CD28 및 안티-CD3 항체로 코팅 조직 배양 접시를 사용하여 활성화 할 수 있습니다, 또는 알부민 323-339 펩타이드 항원 펄스 조사 BALB / C 비장 세포를 사용하여 DO11.10 T 세포 수용체 특정 방식으로합니다. <ol start="2"><li> Centrifug전자는 이전과 같이 세포를 휴식, 200 포함 μL 편광 중간 항 CD3를 및 안티 CD28 항체 결합 비즈 SN과를 Resuspend 세포를 벗어. 매체를 변경하지 않고 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 72 시간 동안 배양한다. </li></ol> 8. T 세포 고정 및 유동 세포 계측법에 대한 염색 <ol><li> 세포를 씻으 : 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어. 따라서 다음의 모든 세척 단계를 수행합니다. </li><li> 100 μL 고칠 수 죽은 세포 염색 용액에 세포를 resuspend을 4에서 30 분 동안 품어 ° C. </li><li> 세포를 씻으, 100 μL PBS에 resuspend을, PBS, RT에서 부화 15 분에 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. </li><li> 세포를 씻으, PBS 200 μL 얼음처럼 차가운 70 % 메탄올에서 그들을 resuspend을하고 얼음에 30 분간 배양한다. </li></ol> 참고 : 세포 생물주의하지 않고 지금부터 취급 할 수 있습니다!<ol start="5"><li> 60 μL의 마스터 믹스 60 μL PBS + 10 ㎍ / ㎖ FC-블록 (불특정 바인딩을 차단하는 안티 FCR3). 준비 세포를 씻어 PBS + 안티 FCR3의 40 μL에서 그들을 resuspend을하고 RT에서 15 분 알을 품다. </li><li> 20 μl를 추가 PBS + 안티 FCR3 1 μg PE-결합 방지 Foxp3의 항체를 포함, ° C 하룻밤 4에 잘 혼합 배양. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으과 흐름 cytometer에 대한 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.

바이러스 생성 및 적정 최적의 형질 결과, 선형화 된 벡터의 질과 양이 가장 중요 나타납니다. 감염이 빠르게 번 효율적인 바이러스 생산이 발생 진행할 것이기 때문에 우리는 문화의 초기 전면에 자라 난의 기본 해물 생산에 부정적인 영향을 관찰하지 않았다. 그러나 HEK293A 세포에 의해 바이러스 생산 효율을 감소 긴 삽입에 의해 영향을받을 수 있습니다. 일부 오픈 읽기 프레?...

Tregs의 면역 관용을 유지하고 지나친 면역 반응을 저해하는 중요합니다. Tregs의는 방관자 T 세포의 활성화를 억제합니다. 따라서, Tregs의의 제거가 활성화 된 T 세포 1에 의해 구동 치명적인자가 면역과 자기 파괴에 이르게한다. Tregs의는 CD4 단일 긍정적 인 전구체의 부정적인 선택시 흉선에서 개발하지만, 그들은 또한 차선의 공동 자극 1,2 낮은 복용량 항원의 자극에 따라 순진 CD4 T 세포에서 주변에 구별 할 수 있습니다. 주변 Tregs의이 용기 나 폐에 내성을 제공 연루되어있다 반면 흉선 Tregs의는 자기 항원에 대한 조직의자가 면역을 억제하는 것 같습니다. 이러한 유도 Tregs의이 유력 음식과 공기, 공생 세균 및 알레르기 3,4에서 환경 항원을 포함하여 점막 외국 항원을 인식 한 후 T 세포의 활성화를 방지합니다. 또한, Tregs의 태아 펩티드에 산모의 허용 오차 5를 구축하고 사전에 중요하다환기 이식편 대 숙주 질환 6. 동시에, Tregs의도 7,8 종양 세포의 면역 감시를 감쇠에 의해 원치 않는 효과를 중재. Tregs의의 특징 기능은 하위 - 지정하는 전사 인자 Foxp3의 필요와 기능 9,10 Treg 부여하기에 충분 포크 헤드 도메인을 포함하는 전사 인자의 표현이다. Foxp3의 발현을 유도 할 수있는 몇 가지 신호 전달 경로가 알려져있다. 하지만, 제어, 규제, 또는 트리거 T 세포 수용체에 대한 응답으로 차별화를 Treg 조절하는 분자 프로세스는 덜 잘 이해하고 있습니다. Tregs의 매우 효율적으로 TGFβ와 IL-2 (11)의 존재 반대로 CD3와 anti-CD28 항체 순진 CD4 T 세포의 자극을 통해 체외에서 유도 할 수 있습니다. 새로운 Tregs의 생체, Treg 분화를 촉진 분자의 조작에 기능적으로 미래 therapi에 대한 엄청난 잠재력을 품는다ES 예를 들어, 천식 치료, 크론 병, 및 이식 11,12. 반대로, Treg 차별화를 차단하는 분자의 치료 변조 종양 환자의 복합 치료의 향후 접근 방법의 이점을 제공 할 수 있습니다. 체외 분화 분석에서 T 세포 부분 집합의 분화와 관련된 분자 변화에 대한 설명은 쓸모있다. 순간, 검색 또는 제어 T 세포 분화가 자궁외 유전자 발현의 가장 일반적인 방법은 순진 T 세포에서 실패한다는 사실에 의해 방해되는 유전자 제품의 화면으로 실험하려고합니다. 예를 들어, 일렉트로와 레트로 바이러스 전달이 활성화 된 T 세포에만 효과가 있습니다. 초기의 기대, 휴식 세포에서 일반적으로 효과적입니다 렌티 바이러스 전달, 대조적으로 사이토 카인 13만큼 순진 T 세포의 사전 활성화가 필요합니다. 또한, 일렉트로 동안의 cDNA 또는 발현의 전송자체가 T 세포 활성화의 기능을 부여하고 심지어 칼슘 2 + 신호를 동원 할 수 세포막의 탈분극을 포함 하고 NFAT 단백질 (미발표 관찰과 REF. 14) 활성화합니다. 40 시간 - 마찬가지로, 레트로 바이러스 전달을 위해, 순진 T 세포는 18 활성화해야합니다. 이 시간 동안, 세포 분열의 과정에서 핵 막 고장이 발생하고 레트로 바이러스 벡터 15의 후속 게놈 통합 할 수 있습니다. 이러한 방법은 따라서 헬퍼 T 세포 분화의 결정적인 단계이다 항원과 초기 T 세포 발생의 초기 분자 규제를 해결 할 수 없습니다. 아데노 바이러스 전달은 인간의 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하는 인간의 세포 유형의 숫자​​에 과도 자궁외 유전자 발현을 부여하는 것으로 알려져있다. 그것은 세포 활성화 또는 세포주기의 진행에 대한 요구 사항없이 진행됩니다. C의 표면 발현AR 효율적인 바이러스 부착 및 국제화를 위해 필수적이며, T 세포 특이 적 프로모터에 따라 절단 된 버전 CARΔ1의 유전자 발현 아데노 바이러스 감염 16에 감염 마우스 흉선 세포 및 T 세포를 렌더링하는 발견되었다. 중요한 유전자는 흉선 세포 발달을 변경하지 않거나 순진 CD4의 체외 분화 서로 다른 하위 집합으로 셀 (데이터 표시되지; 심판 17.) 마. T 세포의 아데노 바이러스 - 매개 형질는 이전에 접근 19,20 발현 17,18에 사용되며 노크 다운되었다. 형질 전환 된 T 세포는 시판 DO11.10 TG에서 정제 될 수있다 CARΔ1 TG (코닉, 주식 회사와 REF 17.). 중요한 것은, 아데노 바이러스 전달이 활성화 명백한 증거를 유도하지 않고 순진 T 세포에 대한 관심의 유전자의 고 발현 할 수 있습니다. T 세포는 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 - CD69 -) 후 infecti에 비에 감염된 세포와 유사한 Treg으로 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 재조합 아데노 바이러스 생산은 아데노 바이러스 플라스미드 (그림 1) HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 얻을 수 있습니다. 이 플라스미드는 일반적으로 복제 무능한 재조합 아데노 바이러스 21을 렌더링 삭제 E1 및 E3 유전자와 인간 유형 5 아데노 바이러스 게놈을 포함합니다. 그들은 전단 아데노 바이러스 (22)의 안정적 통합을 통해 불후의 한으로 HEK293A 세포가 복제 결핍을 보완. 아데노 바이러스 벡터가 큰 (~ 40 KB) 결과적으로 잘 기존의 제한 효소 중재 복제에 적합하지 않습니다 때문에, 우리는 게이트웨이 시스템을 채택했다. 관심의 유전자는 처음에 쉽게 람다 재조합 반응 (LR) 23를 통해 아데노 바이러스를 대상 벡터에 전송 될 수있는 작은 입력 벡터로 복제됩니다. 우리는 pCAGAdDu 벡터를 생성원핵 ccdB 선택 마커 24 측면을 노릴 LR 사이트를 포함하는 발현 카세트 CAG 프로모터 (닭 액틴 프로모터 및 CMV 증강)을 결합하여. 이 발현 카세트 소 성장 호르몬 폴리 (A) 신호를 포함하는 시퀀스 융합 진핵 세포 감염 마커 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 coexpression 수 있도록 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) 요소가 융합되어 있습니다. 프로토 타입 CMV 프로모터가 매우 활성화에 의존하고 순진 T 세포의 유전자 발현 그러므로 불리한 것으로 발견 된 이후 우리는 CAG CIS 규제 시퀀스를 선택했다. 여기, 우리는 체외 Treg의 분화 효율을위한 프로토콜 및 활성화 (그림 2)하지 않고 순진 CD4 T 세포를 형질 도입하는 방법을 제공합니다. 방법은 자궁외 유전자 발현을 활성화하거나 순진 상태에서 위의 CD4에게 T 세포 분화를 노크. 그것은 overexpresse의 효과를 테스트 할 수 있습니다T 세포 부분 집합의 약속까지 초기 TCR 자극에 따라 초기 신호 이벤트 기간 동안 관심의 D 유전자. 우리의 검증 실험은 Th2 사이토 같은 살전 다른 T 세포 집합, Th9, Th17의, TH22, 또는 TFH 세포의 분화와 비슷한 아데노 바이러스 응용 프로그램을 구축하는 기초를 제공합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

규제 T 세포 (Tregs의)는 자체뿐만 아니라 특정 외국 항원에 대한 면역 내성을 제공하기 위해 필수적입니다. Tregs의는 TGFβ와 IL-2의 존재 TCR과 공동 자극 체외 순진 CD4 T 세포에서 생성 할 수 있습니다. 이 미래의 치료를위한 엄청난 잠재력을지지하지만, 분자 신호 전달 경로 제어 차별은 대부분 알 수 있다고. 기본 T 세포는 자궁외 유전자 발현을 조작하지만, 일반적인 방법은 일차 항원 인식 이전에 T 세포의 가장 중요한 순진 상태를 대상으로 실패 할 수 있습니다. 여기, 우리는 Treg 분화를 유도하기 전에 체외에서 순진 CD4 T 세포의 이소성 유전자를 표현하는 프로토콜을 제공합니다. 그것은 복제 결핍 아데노 바이러스 전달을 적용하고 그 생성 및 생산을 설명합니다. 아데노 바이러스는 대량 삽입 (최대 7 KB) 걸릴 수 있습니다 및 높은 과도 overexp을 달성하기 위해 발기인을 장착 할 수 있습니다T 세포 ression. 그들은 형질 전환 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하면 효과적으로 순진 마우스 T 세포를 transduces. 중요한 것은 감염 후 T 세포가 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 - CD69 -)과는 Tregs의에 감염되지 않은 세포와 유사한 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 처음부터 CD4의 T 세포 분화의 조작을 할 수 있습니다. 그것은 초기 TCR 자극의 초기 신호 이벤트가 결국 차별화를 Treg으로 이어질 세포 변화를 유도 할 때 자궁외 유전자 발현이 이미 보장합니다.

바이러스 생산 높은 바이러스 역가의 생성의 경우, 기본 바이러스 생산 또는 바이러스 증폭 HEK293A 세포 수확의 타이밍이 중요합니다. 바이러스 생산의 시각적 징후와 대표 형광 및 위상 콘트라스트 이미지는 그림 3에 표시됩니다. CPE는 십일 삽입하지 않고 제어 pCAGAdDu 벡터 HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 관찰 하였다. CPE는 감염 마커 GFP의 높은 발현을 분리하고 전시...

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Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을 가능하게<em&gt; 체외에서</em&gt;.

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K 조회수.  Helmholtz Zentrum München. 순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을 가능하게 체외에서.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

급성 LCMV 감염에서 Early Follicular Helper T-Cell Commitment의 해독

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

저자 스포트라이트: 급성 LCMV 문제에서 TFH 세포 분화의 경로 규명

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...