3D 흉기 배양에 의한 iPSC 유래 흉비 이민자의 생성은 종양 항원 특이적 순진한 T 세포의 균질한 집단을 재생하는 생체 내 최초의 생체 내 방법이다. 주요 장점은 iTE가 생리적 관련이 있으며,이 방법은 지속적으로 특정 T 세포를 생산하는 생체 내 차동 방법이 더 강력하다. iTE는 생체 내증식, 암분 및 종양 억제 능력을 포함하는 순진한 T 세포와 같은 기능적 표현형을 가진 CD8 알파-베타 항-인성 특이적 T 세포의 균질한 화가난다.
절차를 시연하는 것은 닥터 라피쿨 이슬람내 실험실에서 포스트 닥터가 될 것입니다. OP9 배지에서 OP9/DLL1 세포배양을 시작하려면 섭씨 37도에서. 세포가 80~95%의 합류에 도달하면 X 마그네슘, 칼슘 및 페놀 레드 프리 PBS로 한 번 씻으실 수 있습니다.
포인트 0 5 % 트립신의 4 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 OP9 미디어와 파이펫의 4 밀리리터를 추가하여 세포 층을 분리하고 단일 셀 현탁액을 만듭니다. 세포 현탁액을 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원내 튜브로 옮킨다.
300G의 원심분리기와 섭씨 4도에서 5분간. OP9 미디어의 12 밀리리터에서 suppurate 및 다시 중단 세포를 흡인. 그런 다음 OP9/DLL1 세포 현탁액의 2밀리리터를 새로운 10센티미터 세포 배양 페트리 접시에 넣습니다.
OP9 미디어의 8밀리리터를 추가합니다. 이 구절을 2~3일마다 반복한다. 당일 제로수확에 의해 단세포 현탁액으로 유도된 만능 줄기 세포를 수확한다.
세포와 원심분리기를 섭씨 4도에서 300G에서 5분간 수집합니다. OP9 미디어의 10 밀리리터 당 100, 000 세포의 밀도로 IPC의 체퍼를 흡인하고 다시 중단합니다. 그런 다음 100, 000 셀을 CONfluent OP9/DLL1 10센티미터 접시에 접시를 매습니다.
이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 배양을 계속합니다. 셋째 날에는 오래된 미디어를 흡인하고 신선한 OP9 미디어의 10 밀리리터로 대체하십시오. 6일째에는 PBS 10밀리리터로 10센티미터 의 컨실린 OP9 접시를 세척합니다.
각 접시에 3 밀리리터를 0 5% 트립신에 추가합니다. 그리고 실온에서 3~5분 동안 배양합니다. OP9 미디어의 4 밀리리터를 추가하고 부드럽게 파이프를 사용하여 세포를 수집합니다.
세포를 100 마이크로미터 세포 여과기와 원심분리기를 300G, 섭씨 4도에서 5분간 전달합니다. 그런 다음 상체를 폐기하십시오. 분화 매체의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
새로운 10센티미터 OP9/DLL1 컨서우셔너 접시에 셀 서스펜션을 플레이트. 이산화탄소의 5%를 기록하며 섭씨 37도에서 배양을 계속합니다. 9일째에는 오래된 미디어를 흡인하고 10밀리리터의 신선한 차별화 매체로 대체하십시오.
섭씨 37도, CO2 5%로 세포를 계속 배양합니다. iPSC 식민지에서 심근세포가 관찰되는 날11일에는 파이펫을 사용하여 비부착 세포를 기계적으로 분리합니다. 100 마이크로미터 세포 스트레이너와 원심분리기를 300G, 섭씨 4도에서 5분간 필터링합니다.
그 후, 초신자를 흡인시키고 분화 매체의 24밀리리터에서 세포를 다시 중단한다. iPSC를 컨서적 OP9/DLL1 6개의 웰 플레이트로 플레이트합니다. 37°C의 이산화탄소로 세포를 배양합니다.
15일째에 모든 비부착 세포를 수집하고 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 필터링합니다. 300G의 원심분리기와 섭씨 4도에서 5분간. 이전에 설명한 대로 3~4일마다 비 부착 셀을 계속 전달합니다.
DGWO 치료 7일째에는 10센티미터 의 새로운 10센티미터 요리 4개를 꺼내보세요. 각 접시에 20밀리리터의 완전한 미디어를 채우게 합니다. 티믹 로브로 모든 니트로셀룰로오스 막을 10센티미터 접시로 옮킵니다.
집게를 사용하여 멤브레인에서 개별 엽을 분리하여 미디어에 담그도록 합니다. 실온에서 1 시간 동안 로브를 배양하십시오. 그런 다음 티믹 로브를 완전한 미디어가 있는 새로운 10센티미터 접시로 옮습니다.
그리고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 이 전송 및 인큐베이션을 두 번 더 반복합니다. 집게를 사용하여, 흉엽을 접시에 고정시키면서 다른 한편으로 는 중앙에 100~200 마이크로미터 깊이 절개를 하고 로브의 직경의 절반을 연장하여 T 세포 전구체로 의 이동을 용이하게 한다.
티믹 로브를 완전한 차별화 매체로 채워진 새로운 10센티미터 접시로 옮기습니다. 하부 및 상층 그리드가 있는 3D 배양 판을 사용하는 경우 두 그리드를 멸균 PPS로 채우면 매달려 방울의 증발 및 건조를 방지하십시오. 다음 전송 30 하나의 DGWO를 포함하는 완전한 매체의 마이크로 리터는 3D 배양 플레이트의 각 우물에 티믹 로브를 처리.
OP9/DLL1 공동 배양으로부터 비부착 T 계보 세포를 수집합니다. 그리고 20 마이크로리터당 2, 000 ~ 5, 000 T 세포 계보 세포의 밀도로 세포를 다시 중단한다. 3D 배양 판의 각 흉부 엽에 T 리니지 셀 서스펜션 20 마이크로리터를 추가합니다.
이산화탄소의 5%와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 P200 파이프를 30 마이크로리터로 설정합니다. 각 우물에서 미디어를 여러 번 파이프하여 흉엽을 둘러싼 모든 세포를 제거합니다.
그런 다음 각 우물에서 미디어를 흡인하고 완전한 미디어의 30 마이크로 리터로 대체하십시오. 이 과정을 반복하여 미디어를 파이프, 제거 및 교체하여 로브로 마이그레이션하지 않는 미숙한 T 세포를 제거합니다. 매일 25~30개의 마이크로리터를 변경하여 로브를 계속 배양합니다.
4일 또는 5일째에 가벼운 현미경 검사를 사용하여 엽 주위의 iPSC 유래 티믹 이민자의 후광 형성을 확인합니다. 로브 중단 없이 미디어를 파이프하여 iTE의 매일 을 수집합니다. 매일 미디어를 변경하고 약 12일까지 컬렉션을 계속합니다.
수확 된 iTE는 분자 분석 또는 생체 내 이식 실험에 사용할 준비가되어 있습니다. 이 연구에서는, 공동 배양 태아 흉부는 iPSC 파생 된 T 세포 혈통 세포가 흉엽으로 마이그레이션 할 수 있는지 여부를 분석하기 위해 단면된다. 시드되지 않은 대조엽은 내인성 CD3 양성 세포의 배포된 성상세포와 같은 흉막 상피 웹을 특징으로 하는 조직 아키텍처를 갖는다.
그러나 iPSC 유래 미성숙 T 세포로 시드된 흉엽은 iPSC 유래 미성숙 T 세포의 이동을 나타내는 CD3 양성 단핵 세포로 다시 채워집니다. 티믹 마이크로 환경 내에서, 그리고 성숙하는 T 세포는 이후에 iTE로 퇴각합니다. 유동 세포 분석은 다양한 세포의 현상 특성화를 테스트하기 위해 사용됩니다.
엑스트라 티믹 T 세포는 CD4, CD8 이중 양성 T 세포 및 CD8 알파 단일 양성 T 세포를 양성 선택 마커의 발현 없이, MHC 클래스 원은 반면 iTE는 CD8 알파 단일 양성 MHC 클래스 1 양성 T 세포 표현형의 균일한 집단인 반면, 백혈구로부터 퇴화하기 전에 양성 선택을 통해 성공적인 통로를 나타낸다. iTE는 코그네이트 펩티드에 대한 항원 특이성을 가지고 있습니다. iTE는 뉴클레오단백질이 사이토카인의 세포 생산으로 나타나지 않기 때문에 관련이 없는 펩타이드로 미리 로드된 세포를 제시하는 항원과 결합하였다.
그러나 iTE 공동 배양 항원 제시 세포는 cognate 펩티드 GP100으로 미리 펄스, 세포 내 TNF 알파 인터류킨 II 및 인터페론 감마를 생산한다. 오픈 라인 세포 배양은 ABS 슬롯에 크게 의존한다는 것을 기억하십시오. 생성된 iTE는 종래의 T 셀과 함께 작동하는 다른 분석에서 사용될 수 있다.
예를 들어, T 세포 청산 분석, 사이토카인 생성 분석, 생체 종양 회귀 시험, T 세포 분화 연구, 등 세테라. 이 기술은 많은 면역학적 또는 그러한 프로젝트에 적용될 수 있습니다. T 세포 분화, 펄스 타이밍 T 세포 성숙, 및 헤마토크트 전구 또는 줄기 세포로부터의 항원 특이적 T 세포의 생성을 포함한다.
이 영상을 본 후 보는 사람은 유도된 만능, 줄기세포 유래, 3D 흉관 배양 시스템을 이용한 종양 항원 특이적 티믹 이민자를 생성하는 방법을 이해해야 한다.
