우리 감사 마가렛 Gardel 아낌없이 고분자의 사용을 허용. 우리 인정이 작업을 사용 하는 NIH (1R15GM116082)에서 지원 합니다.

1입니다. 부드러운 실리콘 기판의 제작
<ol><li>1.75 g A 구성 요소 및 B 구성 요소의 1.75 g으로 무게 (A:B = 1:1) 부드러운 실리콘 엘라 스토 머 키트 (폴리스 티 렌)를 사용 하 여 트레이 무게.</li>
	<li>A 구성 요소 무게 트레이에 B 구성 요소에 추가 하 고 적절 한 주걱 스틱을 사용 하 여 5 분 동안 함께 그들을 섞는다.</li>
	<li>35 mm 페 트리 접시 위의 혼합물을 추가 합니다. 몇 분 동안 배양 접시에 걸쳐 균등 하 게 확산 혼합물을 허용 한다. 참고: 페 트리 접시 지름과 부드러운 실리콘의 양을 부드러운 실리콘 두께 결정 합니다. 여기, 두께 약 3.5 m m; 될 것입니다. 토론 섹션에서 고무 두께 선택 하는 것에 대 한 더 많은.</li>
	<li>모든 기포를 제거 하려면 15 분 동안 진공 챔버에, 뚜껑 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 이 시간 동안 미리 70 ° c 뜨거운 접시가 열</li>
	<li>핫 플레이트에는 70 ° C에 도달 하면, 유리 슬라이드에 놓고 유리 슬라이드에 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 실리콘을 하자 30 분 동안 70 ° C에서 치료. 로 페 트리 접시 녹아 있습니다 핫 플레이트에 직접 폴리스 티 렌 접시를 배치 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 부드러운 실리콘에 형광 Microbeads 커플링
<ol><li>(발견된 페 트리 접시)에 치유 부드러운 실리콘 깊은 UV 챔버 (185 및 254 nm의 빛 파장의 깊은 UV 램프와 인클로저)에 배치 합니다. 부드러운 실리콘 샘플 (UV 램프에서 ~ 5-10 cm) 5 분에 대 한 깊은 자외선 노출.<ol>
<li>실리콘 깊은 자외선에 노출 되는, 아래 단계 2.2-2.6와 함께 진행 합니다. 깊은 자외선 노출 후 샘플을 검색 하기 전에 적어도 5 분 동안 깊은 UV 챔버를 드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한편, 19 mg microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)의 밖으로 무게 하 고 그것에 이온된 수 (DI) 물 500 μ를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 EDC를 분해.</li>
	<li>별도 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 11 mg N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo NHS)의 밖으로 무게, 디 물 500 μ를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 떨고 sulfo NHS를 해산. 그런 다음, 단일 microcentrifuge 튜브에 EDC sulfo NHS 솔루션 결합.</li>
	<li>이 EDC/sulfo NHS 솔루션 (1 %w / v 재고 농도)와 30 μ 0.44 μ m 직경 빨간색 (또는 필터 큐브 형광 현미경에서 사용할 수에 따라 다른 형광 색)의 수정 카복실산 형광 microbeads을 추가 합니다.</li>
	<li>EDC/sulfo NHS/비드 혼합물에 추가 하는 콜라겐의 0.02 m g (쥐 꼬리, 0.02 M 초 산에 4 mg/mL의 재고 농도)에서 나 약 0.02 mg/mL의 농도를.</li>
	<li>EDC/NHS/구슬/콜라겐 소용돌이 나 구슬 결합 하기 전에,에 걸쳐 균등 하 게 분산은 되도록 짧게 혼합물.</li>
	<li>플라스틱 EDC/NHS/구슬/콜라겐의 1 mL 나 혼합물 parafilm 다른 얕은, 평면 뚜껑 (작은 직경)의 상단에 배치의 조각에. 반전이 혼합물에 부드러운 실리콘 페 트리 접시는 부드러운 실리콘 표면 혼합물을 연결 하지만 아래 작은 페 트리 접시의 뚜껑의 표면을 직접 만지지 않는다. 거꾸로 페 트리 접시 스페이서의 양쪽에서 하나 또는 두 개의 유리 슬라이드를 사용 하 여 거꾸로 페 트리 접시, 인상. 참고: 그림 1 단계 2.7를 수행 하는 방법을 볼 수를 참조 하십시오.</li>
	<li>알루미늄 호 일 샘플을 커버 하 고 30 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
	<li>부드러운 실리콘 페 트리 접시를 제거 하 고 그것을 똑바로 설정 (실리콘-쪽).</li>
	<li>접시에 PBS (pH 7.4)의 2 개 mL를 추가 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 부드러운 실리콘 표면 세척. 몇 분 동안 앉아 보자. PBS에서 aspirate 그리고 2 mL의 PBS로 다시 실리콘 세척. 실리콘 추가 대 한 치료는 하루에 대 한 하자. 그 이유로 장소 부드러운 실리콘 샘플 PBS에서 37 ° C에서 하룻밤.</li>
</ol>3. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 영역 들여쓰기와 실리콘 강성 측정
<ol><li>부드러운 실리콘 페 트리 접시를 검색 하 고 실리콘 표면 액체 표면 아래 몇 mm을 PBS의 1 mL 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>날카로운된 핀셋을 사용 하 여, 부드러운 실리콘에 5 1 m m 지르코늄 구체 indentors 드롭. 액체 매체에 구체를 담가 그리고 실리콘 레이어 및 다른 indentors의 위치에서 적어도 5 indentor 직경의 가장자리에서 그들을 드롭. 참고: 액체 표면 위에 떨어졌다 구체 실패할 수 있습니다 액체 매체 (부동 소수점) 입력 액체 매체의 표면 장력 때문.</li>
	<li>기본 페 트리 접시를 통해 이미지 수 있도록 현미경 스테이지에 부드러운 실리콘 페 트리 접시를 놓습니다.</li>
	<li>10 X 목표 단계 이미지를 사용 하 여 (건조 10 X 같은 나 0.30의 객관적인), 찾아서 초점으로 구체 indentor를가지고.</li>
	<li>부품의 단계 이미지는 indentor의 전부를가지고 고이 이미지를 저장. 타일 스캔을 사용 하 여 사용 가능한 경우. 어떤 눈에 보이는 결점에서 indentor 있으면 삭제 하 고 다른 indentor 바꿉니다.</li>
	<li>프레임의 왼쪽된 가장자리는 적어도 ~1.5 R indentor 센터에서의 거리를 라이브 단계 영상에서 indentor의 가장자리의 왼쪽에 이동 합니다. 센터는 indentor의 그대로 오른쪽 이미지 프레임의 오른쪽 가장자리 근처에 표시 됩니다 확인 하십시오. 단계 이미지 하 고 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>빨간 형광 채널에 대 한 조명 현미경 광원을 전환 합니다. X-및 y-좌표 변경 ( x-indentor 센터 내에서 하지만 프레임의 오른쪽 가장자리 근처의y 위치), 초점 (Z 감소) 아래로 구체 indentor의 센터 아래 빨간 형광 microbeads까지 그냥 초점 이동 합니다.</li>
	<li>(영상 프레임의 왼쪽된 가장자리) 근처 indentor 멀리 실리콘의 상위 계층에 microbeads 초점 이동까지 모든 z-0.5 µ m의 증가 대 한 이미지와 z 스택을 가져가 라.</li>
	<li>샘플에 다른 indentors와 3.4-3.8 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 실리콘의 강성 (탄성 계수)를 계산
<ol><li>ImageJ, 선 도구에 클릭을 사용 하 여 indentor의 위상 이미지를 열고 픽셀에서 indentor의 직경을 측정 합니다. 클릭 한 채로 indentor 가장자리에 지점에 커서를 정반대로 반대 지점에 가장자리에 고 길이 픽셀 커서를 해제 하기 전에 ImageJ 메인 윈도우의 상태 표시줄에 표시 합니다.<ol>
<li>분석을 클릭 하 여 길이 단위를 픽셀로 설정 되어 있는지 확인 | 설정 규모 길이의 단위를 확인 하 고.</li>
		<li>객관적인 확대 및 CCD 카메라 픽셀 크기에 의해 μ m indentor의 반경 픽셀 단위 변환 (μ R = R x μ m에 CCD 카메라 픽셀 크기 (픽셀)에서 / 객관적인 확대).</li>
	</ol>
</li>
	<li>열고 microbead 이미지의 빨강 채널 z-스택 (해당 되는 경우는 microbeads는 빨간색 형광) ImageJ에서 파일을 클릭 하 여 | 가져오기 | 이미지 시퀀스 고 스택의 모든 이미지를 선택 하 고 스택의 열을 확인 을 클릭 합니다. 참고: f 1에서 indentor 센터에서 microbeads 최상의 가능한 초점 이며 F2 프레임 번호는 프레임의 왼쪽된 가장자리 근처 (구슬 중심에서 R ~1.5의 지역)에서 microbeads에 있는 최상의 가능한 초점 프레임 번호입니다. Z-두 프레임 간의 차이 들여쓰기 깊이 δ.<ol>
<li>ImageJ에서 선 도구를 사용 하 여, 이미지에 잘 정의 된 microbead에서 선을 그립니다. 클릭 분석 | 프로필을 플롯 구슬에서 다른 프레임을 선택 하는 동안 업데이트 된 라인 스캔 강도를 라이브 버튼을 클릭 하십시오. 초점에서 프레임으로 최대 강도의 높은 가치를 제공 하는 프레임을 선택할 수 있습니다.</li>
		<li>Z-z-스택 프레임 사이 증가 0.5 μ m 이므로, δ로 μ m에서 들여쓰기 깊이 계산 (F2-F1) = 0.5 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(마이너스 반대 부 력 힘), 그것의 무게 때문 indentor 여 즉 젤에가 해지는 힘을 계산, 들여쓰기 강제 F, 중력 때문에 가속도 x indentor-액체 매체의 밀도 (밀도) x indentor의 볼륨으로. 방정식 F 를 사용 하 여 = (4/3) x (ρindentor -ρ중간) x (R3) x 3.142 g R 은 indentor의 반지름 x ρindentor indentor, ρ매체 의 밀도 액체 매체의 밀도 이며 g 는 중력 (9.81 m/s2) 때문에 가속도. SI 단위의 F (N)를 오른쪽에 모든 수량을 표현 한다.</li>
	<li>영의 계수 (E) 수정된11 헤르츠 모델12 방정식을 사용 하 여 실리콘의 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg"> 장소: c =; 뒤에 헤르츠 모델 식을 수정 하는 수정 계수 v = (비압축 자료7에 관해서는 0.5로 찍은); 실리콘 젤의 Poisson의 비율 F = 들여쓰기 힘; R = indentor 반경; 그리고 Δ = 들여쓰기 깊이. 전자 실바에서를 SI 단위로 오른쪽에 모든 수량 표현<ol>
<li>보정 계수 c 3을 다음과 같이 계산 합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg"> 장소: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg">; 그리고 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg">. 이 수정 계수는 부드러운 실리콘 (있는 경우) 아래는 페 트리 접시 (또는 뻣 뻣 한 실리콘)을 잘 준수 하는 경우에 사용 하기 위해 특별히 주목 한다.</li>
		<li>H 양의 실리콘 추가 페 트리 접시 지름에 따라 부드러운 실리콘 층의 높이 계산 합니다. 또는, 직접 단계 영상에 의해 실리콘 층의 위쪽 및 아래쪽 표면의 z 좌표를 결정 하 여 h를 구하는 (작은 불순물 중 표면에 초점에와 서). 큰 h에 대 한 유의 (h2 > Rδ), 보정 계수 c 1에 가깝다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 indentor 단계 4.1-4.4 반복 합니다. 영의 계수는 실리콘 샘플에 대 한 평균 탄성 계수를 각 indentor에서 얻은 평균.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+Substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li><li>Style, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+methods+for+measuring+the+elasticity+of+gel+substrates+for+cell+culture:+microspheres,+microindenters,+and+atomic+force+microscopy.">Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy.</a> Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).</li><li>Hertz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Beru&#776;hrung+fester+elastischer+Ko&#776;rper.">&#220;ber die Beru&#776;hrung fester elastischer Ko&#776;rper.</a> Journal f&#252;r die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+a+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs.</a> Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).</li><li>Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-intrusive+measurement+of+wall+shear+stress+in+flow+channels.">Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).</li><li>Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+tools+to+study+cellular+mechanotransduction.">Biophysical tools to study cellular mechanotransduction.</a> Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).</li><li>Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony.">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

영역 들여쓰기 메서드는 쉽게 구현할 수, indentor의 선택과 부드러운 실리콘 샘플의 두께에 주의 지불 한다. 영의 계수를 계산 하는 데 사용 하는 방정식 조건11의 세트에서 유효 하 고 이들은 일반적으로 실리콘 샘플의 두께 indentor 반지름의 > 10% 일 때 만족 하 고 < indentor 반지름 x 13 ~. 우리는 발견 실리콘 두께 5-10 x의 indentor 반경 했다 좋은 선택, 어떤 점에서 샘플 두께 너무 높은 (...

부드러운 조직에 세포의 강성은 kilopascal 범위1, 누구의 강성은 몇 배나 더 높은 조직 문화 요리 달리 마이크로-환경에 거주. 세포 외 기질 단백질 코팅 부드러운 기판에 초기 실험 기판 강성 영향 어떻게 세포 이동으로2,3아래 기질을 보여주었다. 사실, 기판 강성 근본적으로 영향을 퍼지는 생 화 확 적인 신호를 유사한 방식으로 셀 기능4 . (세포 외 기질 단백질 코팅) polyacrylamide 젤은 (물 permeating) hydrogels mechanobiology 연구5대 문화 기질 세포로 광범위 하 게 사용 되었습니다. 입니다 (PDMS), 가장 일반적인 실리콘 (polysiloxane), 널리 사용 되었습니다 뻣 뻣 한 실리콘으로 megapascal 범위 강성과 마이크론 스케일 제조6. 더 최근에, 소프트 실리콘 기판 더 순수 관련 kilopascal 범위에서 경직 된 mechanobiology 연구7,8셀 문화 기판으로 고용 되었습니다.
여러 가지 방법은 유연한 기판, 원자 힘 현미경 검사 법, 스트레칭, 유동성, 및 들여쓰기 영역을 사용 하 고 둥글게 밀고 microindentors9 시 전체 샘플의 거시적인 변형 등의 강성을 측정 하는 데 사용 되었습니다. . 각 기술에는 그것의 자신의 이점 및 불리, 구체와 들여쓰기만 widefield 형광 현미경에 액세스 해야 하는 특히 단순 하지만 상당히 정확한 방법입니다. 금속 구체와 들여쓰기 hydrogels 이전 작업3,,910의 강성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 셀 운동 기판 강성의 중요성을 설명 하는 초기 작업 히드로 기판 강성3를 결정 하는이 방법을 활용. 더 최근에, confocal 현미경 검사 법 또한 우아한 특성10에 대 한 사용 되었습니다.
여기, 우리 제시 부드러운 실리콘 기판 준비 단계별 프로토콜 형광 구슬 커플링 (과 콜라겐과 같은 세포 외 기질 단백질 나) 상단 표면에 단지 단계 들여쓰기 구와 최고 표면 사용 하 여 이미징 및 형광 이미징, 각각, 그리고 마지막으로 실리콘 기판의 영의 계수를 계산 하기 위해 이미지를 분석. 이 방식으로 준비 하는 부드러운 실리콘 기판 견인 힘 현미경 실험에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 기반으로 (배양 접시) 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용은 또한 mechanobiology 연구를 외부 뻗 기를 사용 하 여 수 있습니다. 보증, 어디 가능한 합병증 방지에 필요한 실용적인 고려 사항 또한 표시 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:353px;">CY 52-276 A/B silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Dow Corning</td>
			<td style="width:144px;">CY 52-276</td>
			<td style="width:263px;">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Pierce EDC</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI22980</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;Pierce Sulfo-NHS crosslinker</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI-24510</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 &#181;m, 2 mL</td>
			<td>Spherotech, Inc.</td>
			<td>CFP-0558-2</td>
			<td>Store at 4&#176;C, do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.0 mm Acid washed Zirconium beads</td>
			<td style="width:191px;">OPS Diagnostics LLC</td>
			<td>BAWZ 1000-250-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:353px;">Deep UV chamber with ozone evacuator</td>
			<td style="width:191px;">Novascan Technologies, Inc.</td>
			<td style="width:144px;">PSD-UV4, OES-1000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Wide field fluorescence microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:144px;">DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Collagen I, from rat tail</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:144px;">354236</td>
			<td>Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">ImageJ-NIH</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:144px;">N/A</td>
			<td>public-domain software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stiffness measurement of soft silicone substrates for mechanobiology studies using a widefield fluorescence microscope

인간의 신체에서 부드러운 조직 일반적으로 kilopascal (kPa) 범위에 강성을 있다. 따라서, 실리콘 및 히드로 유연한 기판 경작 조건 비보에 부분적으로 모방 하는 실제 microenvironment에서 셀에 대 한 유용한 기판 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 영의 계수 등방성 선형 탄성 기판 mechanobiology 연구에 일반적으로 사용의 특성화에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 준비 하는 페 트리 접시 또는 뻣 뻣 한 실리콘에 부드러운 실리콘 기판, 형광 구슬 실리콘 기판의 윗 표면 코팅,는 형광 이미징 (중력)에 의해 상면을 밀리미터 단위 구체를 사용 하 여 프로토콜 구성 들여쓰기 실리콘에 구슬 표면 형광 현미경을 사용 하 여 및 실리콘 기판의 영의 계수 계산 결과 이미지를 분석 합니다. 기판의 상면 (형광 구슬) 뿐만 아니라 응용 세포 외 기질 단백질 커플링 실리콘 기판을 셀 도금 및 견인 힘 현미경 실험을 사용 하 여 후속 연구에 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 베이스로 페 트리 접시 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용을 외부 뻗 기를 포함 하는 mechanobiology 연구를 사용 하 여 수 있습니다. 이 프로토콜의 구체적인 장점은 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 widefield 형광 현미경,이 절차에 필요한 주요 장비입니다. 우리는 다른 탄성 계수의 부드러운 실리콘 기판의 영의 계수를 측정 하 여이 프로토콜을 보여 줍니다.

위에서 자세히 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여, 우리 준비 35 mm 페 트리 접시에에서 부드러운 실리콘, 30 분 동안 70 ° C에서 그것을 치료 하 고 형광 microbeads 결합 (및 콜라겐 나) 개요로 서 그림 1에 표시 된 위쪽 표면에. 깊은 UV 기판13커플링 최종 단백질에 대 한 이전 사용 되었습니다. (나) 경화 조건 여기에 사용 되는이 부드러?...

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Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K 조회수.  Old Dominion University. Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

연구

생체공학

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers can be used for controlled delivery of various biological agents such as small molecule drugs, cells, proteins and growth factors. The simplicity of the methodology in making IPC fibers gives flexibility in its application for controlled biomolecule delivery. Here, we describe a method of incorporating IPC fibers into two different polymeric scaffolds, hydrophilic polysaccharide and hydrophobic polycaprolactone, to create a multi-component composite scaffold. We showed that IPC fibers can be easily embedded into these polymeric structures, enhancing the capability for sustained release and improved preservation of biomolecules. We also created a composite polymeric scaffold with topographical cues and sustained biochemical release that can have synergistic effects on cell behavior. Composite polymeric scaffolds with IPC fibers represent a novel and simple method of recreating the cellular niche.

Scaffolds for tissue engineering need to recapitulate the complex biochemical and biophysical microenvironment of the cellular niche. Here, we show the use of interfacial polyelectrolyte complexation fibers as a platform to create composite, multi-component polymeric scaffolds with sustained biochemical release.

생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

뷰-포트 표시 하 고 적외선 빛에 투명 한 플라스틱 미세 소자를 제작 하기 위한 소프트 리소 절차

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...