저자는 위에서 설명한 연구에 참여에 대한 운남 지방, 인민 중국의 공화국과 Agboville, 코트 디부 아르에서 지역 사회에 감사하고 있습니다. 우리는 프로토콜의 테스트 및 실행 지원을 한 지역 현장 팀에게 빚을 졌네. 동영상 촬영 중에 그녀의 도움을 현미경 이미지, 연구소 지원과 스테파니 Krauth에 대한 Hanspeter 마사와 그의 팀이 제공하는 이벳 Endriss : 우리는 스위스 열대와 보건 연구소에서 다음 동료에게 특히 감사합니다. 마지막으로, 우리는 유용한 의견 시리즈를위한 두 익명 심판 감사드립니다.

1. 카토 - 카츠 기법 <ol><li> 현미경 슬라이드에 의자의 41.7 밀리그램의 (MG)를 보관하기위한 구멍 표준 카토 - 카츠 템플릿을 배치합니다. </li><li> 신문이나 알루미늄 호일의 조각에 신선한 배변 샘플 2~3그램 (g)를 퍼, 그리고 체 거기에 상단에 와이어 또는 플라스틱 메쉬의 조각을 누르십시오. </li><li> 작은 플라스틱 주걱을 사용하여 메쉬에서 sieved 자료를 긁어 완전히있는 카토 - 카츠 템플릿에 구멍을 채우십시오. 초과 지저분한 물질을 제거하려면 주걱으로 구멍의 내용을 수준입니다. </li><li> 세로 이제 현미경 슬라이드에 준수 배변 자료를 방해하지 않으면 템플릿을 제거합니다. 템플릿 및 주걱는 세제와 물에 세척하고, 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 셀로판의 조각을 놓고 현미경 슬라이드의 배변 샘플을, 적어도 24 시간 (시간)에 글리세린 - 공작석 녹색 솔루션에 미리 흡수 했죠. </li><li> 두꺼운 도말 표본에 배변 자료를 보급하기 위해 부드럽게 깨끗한 마이크로을 누르샘플 슬라이드에 대한 범위 슬라이드, 골고루 현미경 슬라이드의 폭보다 약간 작은 직경의 원 안에 자료를 배포. </li><li> 슬라이드 슬라이드가 직사광선에서 떨어져 보관해야하는 기간 동안 30-60분 (분)에 대해 취소 할 수 있습니다. 그런 다음, 체계적으로 가벼운 현미경 (40 100x 배율)에서 두꺼운 도말 표본을 검사합니다. STH 계란의 수를 세고 종 (즉, A.lumbricoides, T.trichiura, 그리고 십이지장충)에 의해를 계 충화하다. 참고 다른 기생충 알 (예 주혈 흡충 mansoni)도이 방법으로 검출 할 수 있으며 계산 별도로 기록해야합니다. </li><li> 감염의 강도의 표준화 된 견적을 얻으려면, 통상 의자 (EPG)의 g 당 알 수로 표현, 24 (24 X 41.7 MG ≈ 1g)에 의해 알 수를 곱합니다. </li></ol> 2. Baermann 기법 <ol><li> 지혜를 폐쇄, 유리가 유입 및 고무 튜브를 첨부 보유 할 수있는 스탠드를 설정유입 경로의 맨 아래로 하 클립. </li><li> 의료 거즈의 한 부분으로 유입 경로 및 레이어 거기에, 체 또는 콘 모양 와이어 화면의 조각을 놓으십시오. </li><li> 수돗물로 유입 경로를 입력하고 설정 전체가 누출되지 않았는지 확인합니다. </li><li> 의료 거즈의 중간에 신선한 대변의 20-30그램을 퍼하고 완전히 물에 잠겨 있는지 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 물을 추가 할 수 있습니다. 샘플을 통해 의료 거즈를 접으십시오. </li><li> 아래에서 2 시간의 유입 경로에 인공 조명을 비춰. </li><li> 부드럽게 고무 튜브에 클립을 공개하여 원심 분리기 튜브에 유입 경로에있는 물 아래 부분의 50 밀리리터 (ML)를 배수한다. </li><li> 5 분 600 XG (상대 원심력)에 수집 된 물을 원심 분리기 조심스럽게 퇴적물을 방해하지 않으면 서 표면에 뜨는을 부어. 관의 마지막 몇 방울을 유지합니다. </li><li> 현미경 슬라이드에 솔루션의 퇴적물과 피펫 두 방울을 다시 중지되고 슬라이드를 검토가벼운 현미경 (종 확인에 대한 검색 및 100-400 배로 확대 한 확대를위한 40x 확대). S.의 첫 번째 단계 애벌레 (L1) stercoralis 살아 있으며, 적극적으로 현미경으로 이동합니다. </li></ol> 3. 20 m 셔틀 실행 테스트 <ol><li> 20 m 평면과 직선 실행 과정을 측정하고 콘으로 표시합니다. </li><li> 테스트 참가자가 가슴 18 주변의 손목 및 해당 송신기에 심장 박동 모니터를 착용 할 수 있습니다. 이 장비는 참가자의 심장 박동는 테스트 전후에 측정 할 수 있으며 따라서 참가자가 최대의 노력을 발휘 여부 모니터링합니다. </li><li> 20 m의 바퀴 delimiting 미리 녹음 된 소리 신호의 속도에 따라 코스에 앞뒤로 실행 참가자를 지시합니다. 시속 8.5 킬로미터 (km / 시간)의 실행 속도, 0.5 km의 등가 / 모든 분을 시간으로 20 m 간격 증가를 나타내는 신호의 주파수로 시작. </li><li> 일을 확인에 참가자는 새로운 20 m 간격에게 신호가 들리 때마다 시작하고 다음 신호가 도착 전에 완료됩니다. </li><li> 참가자를 중지 그는 / 그녀는 2 개의 연속 20 m 간격의 속도를 따라 실패하는 경우. </li><li> 참가자가 참가자의 연령 및 성별과 함께 완벽하게 완성 마지막 간격에 표시된 최고 실행 속도를 기록합니다. </li><li> 시험의 끝에서 달성 심장 박동이 아이의 최대 심장 박동수 19인지 확인합니다. 이 심장 박동에 도달하지 않으면 자녀는 최대의 노력을 발휘하지 못한, 그리고 따라서 시험은 반복되어야합니다. </li><li> 3.248 * 연령 (년) + - VO이 최대 = 31.025 + 3.238 * 속도 (km / 시간에) : Léger 및 동료에 의해 ​​나온 방정식을 사용하여 참가자의 최대 에어로빅 용량 (VO 2 최대)를 계산 0.1536 * 속도 (km / 시간에) * 연령 (년). </li></ol> 4. 대표 결과 의 관점에서카토 - 카츠 기술과 STH 진단은 다른 기생충 알의 고유 한 특성은 대부분의 종 (20)의 식별 할 수 있습니다. A.lumbricoides의 알 (그림 1, 약 45-75 마이크로 미터 (μm) 길이 35-50 μm 폭) T.trichiura (그림 2)와 십이지장충 (그림 3)의 달걀보다 두꺼운 쉘 벽을 갖추고 있습니다. 비 수정 된 난자가 외부 코트이 부족하고 전반적인 약간 길쭉한와 큰 반면 A.lumbricoides의 난자 (그림 1)은 황금 갈색을 보일 외부 단 백성의 코트를 보유하고 있습니다. T.trichiura (그림 2, 약 50 μm 길이 22 μm 폭)의 알은 가늘고 긴 있으며, 독특한 극 플러그가 있습니다. 십이지장충 달걀은 (그림 3, 약 64-76 μm 길이 36-40 μm 폭), 반면에, 세포의 고밀도 클러스터 주변에 명확한 링에 이어, 매우 얇은 벽을 가지고계란의 중심 인치 S.stercoralis L 한 애벌레 (그림 4) 약 180-380 μm 길이와 짧은 구강 충치가. 서로 다른 성기 primordium는 (그림 4에 파란색 화살표로 강조 표시) 관찰과 애벌레 (그림 4에 빨간색 화살표로 강조)의 꼬리는 날카로운 끝이 될 수 있습니다. 아이들의 체력에 STH 감염의 진정한 영향은 여전히 13,14,15 논쟁을하고 있습니다,이 시점에서 미치는 영향에 대한 대표적인 결과가 없습니다. 20 m 셔틀이 운영하는 시험 결과의 해석은 다양한 방법으로 수행 할 수 있습니다. 아이들의 체력은 나이와 성별, 기타 잠재적으로 관련 건강 조건, 사회 경제적 상태 및 문화 습관의 측면에서 비슷합니다 감염된와 비 감염된 과목 사이에 비교할 수 있습니다. 이것은 단면 조사 13,14,15에서 수행 할 수있는STH 감염 상태와 감염된 및 비 감염된 어린이의 피트니스 물리적는 특정 시점에서 평가됩니다. 학교 노인 어린이의 체력이 anthelminthic / 위약 치료 전후 평가하는 무작위 통제 시험 디자인에 따라 때 증거의 강도는 모두 단기 및 장기 평가를 위해 수 있도록 높을 것입니다. 하나는 더 STH 감염 및 신체 피트니스의 강도 사이의 가능한 용량 - 반응 관계를 파악하고 체력과 multiparasitism 하나의 다른 수준을 비교하는 시도 할 수 있습니다. 야프 및 동료 15 일까지 제시 한 작품에서 같은 VO이 최대가 그려져 체력은, 크게 T.trichiura에 감염되지 않은 어린이 (그림 5)에 비해 T.trichiura에 감염된 어린이 줄일 수있는 것으로 확인되었습니다 . <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig1.jpg" /> Figu<html> . A.lumbricoides 달걀의 재 한 미세 이미지 : 수정 된 (A)와 (B) 500x 배율에 따라 비 수정 된. 스케일 바 = 50 μm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig2.jpg" /> 그림 2. 500x 배율에 따라 T.trichiura 달걀 미세 이미지입니다. 규모 바 = 50 μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig3.jpg" /> 그림 3. 500x 배율 아래에 십이지장충의 알의 미세 이미지입니다. 스케일 바 = 50 μm. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig4.jpg" /> 그림 4. 250x 배율에 따라 S.stercoralis L 한 유충의 미세 이미지입니다. 화살표 꼬리 (빨간색)와 성기 primordium (파란색)을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. d/3966/3966fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. T.에 감염되지 않은 아이들의 체력 수준에 비해 T.trichiura에 감염된 어린이의 체력 수준을 보여주는 그래프 trichiura.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 글에서 설명한 세 가지 프로토콜은 운남 지방, Bulang 소수 민족 (21)의 회원들과 아프리카 6,13,14의 다른 부분에서 중화 인민 공화국의 남쪽 - 서쪽에 테스트 실행되었습니다. 카토 - 카츠 기술에 대한 몇 가지 템플릿이 있습니다. 구멍 크기 각각의 독특한는 배변 소재의 독특한 금액을 제공합니다. EPGs의 계산 들어, EPG 견적에 도착 할 수있는 올바른 요소와 달...

참고 :이 목록에 자료는 일반적인하고 다른 소스에서 얻을 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 카토 - 카츠 키트 1.5 mm 두께의 템플릿 mm 6 (mm) (직경)의 구멍 [400 플라스틱 템플릿, 400 플라스틱 주걱, 80 메쉬 크기의 나일론 화면의 20 m 역할, 친수성 ​​셀로판의 20 m 역할, 34 두께 μm.] </td><td> Vestergaard Frandsen </td><td></td><td> 글리세린 - 공작석 녹색 솔루션이 키트에 포함되지 않습니다하지만 어떤 화학 업체에서 구입하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 유리 유입 경로 [8cm (cm) 폭 6cm 깊이에 대한] </td><td></td><td></td><td> Baermann 기술에 대한 유리 유입 경로는 물 60 ML을 보유 할 수 있어야합니다. 일고무 호스와 거즈의 전자 크기는 사용 된 유리 유입 경로의 유형에 따라 달라집니다. </td></tr><tr><td> 생물 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> CX21LED/CX21 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> 상해 의료 기기 그룹 </td><td> 80 - 2T </td><td></td></tr><tr><td> 사전 녹음 된 신호 </td><td> Bitworks 디자인 </td><td> 팀 호출 장치 테스트 버전 1.3.1 </td><td> 아이폰 앱 </td></tr><tr><td> 심장 박동 모니터 </td><td> 북극의 </td><td> FT1 </td><td> 시계 및 송신기 </td></tr></tbody></table>

determining soil-transmitted helminth infection status and physical fitness of school-aged children

토양 - 전송 기생충 (STH) 감염은 일반적인 현상입니다. 사실, 10 억 건 이상의 사람들이 주로 빈곤은 우선 위생 동작, 물 공급 및 위생 종종 결핍 1,2입니다. Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, 두 십이지장충 종, Ancylostoma duodenale 및 Necator 개발 도상국에 영향을받습니다 americanus는 가장 널리 STHs 3아르. 십이지장충 병, ascariasis 및 trichuriasis로 인해 예상되는 글로벌 부담은 10.5 22.1이며, 각각 6,400,000 장애 조정 삶 년 (DALYs), 4. 또한, 추정 30~1억명는 틀림없이 또한 상당한 공중 보건에 미치는 영향에 5,6의 원인이 Strongyloides stercoralis, 글로벌 중요성의 가장 무시 STH 종에 감염되어 있습니다. 여러 종 감염은 (즉, 하나의 개인으로 끌여 다른 STHs) 일반적인 있으며, 감염이 린되었습니다<html> 낮아 생산성과 개발 도상국 1,3의 따라서 경제 전망에 ked. 일반적인 STHs의 진단은 세계 보건기구 (WHO) 등 감염의 확산과 강도를 결정하는 비교적 간단한 방법입니다 가토 - 카츠 기술 7,8를 권장합니다. 그것은 감​​염된 과목이 대소변에서 전달하는 기생충 알 검출을 용이하게한다. S.stercoralis의 진단에 관해서는, 가능한 간단하고 정확한 도구는 현재 없습니다. Baermann 기술은 진단에 가장 널리 활용 방법입니다. Baermann 기술 뒤에 원칙은 애벌레가 phototactic 9아르로 그 활성 S.stercoralis의 애벌레가 조명 신선한 배변 샘플에서 마이그레이션 할 수 있습니다. 그건 좀 덜 정교한 실험실 자료가 필요하며 문화, 면역 방법 5 이상이 소요 짧은 시간입니다. t &quot;은 복통, 설사, 그리고 pruritus, 이러한 빈혈 등의 만성 증상에, 이하와 영양 실조, 그리고인지 장애 최대 10하지만 심한 일반적인 증상.에서 STH 감염 범위와 관련된&gt; Morbidities 증상은 일반적으로 불특정 때문에와 미묘한는, 그들은 종종 들키지, 영향을받는 개인에 의해 정상 상태로 간주됩니다, 또는 주어진 환경에서 더 많이 할 수있는 다른 질병의 증상으로 간주됩니다. 따라서, STH 감염의 진정한 부담이 평가에 의해 과소 평가되어 생각할 수 있습니다 보통 인구 기반 조사의 경우와 같이 도구는 자기 선언 징조와 증상에 의존. 1980 년대 후반과 1990 년대 초, 스티븐슨과 동료 6-12 년간 11,12 세 소년의 체력을 낮추면 STH 감염의 가능성을 강조했다. 과학적 탐구의이 라인은 최근 13,14,15 새로운 추진력을 얻게되었습니다. 20 미터 (m) 셔틀이 운영하는 시험을 개발D Léger 외. (16)에 의해 검증과 어린이 17 에어로빅 피트니스을 측정 전세계 사용됩니다. 시험은 표준화가 용이하며 20 m 길이 및 평면 실행 과정과 오디오 소스를 사용할 수있는 곳을 수행 할 수 있습니다, 리소스 제한 설정 13의 사용이 매력적인하고. STH 감염 학교 - 노인 아동의 체력에 영향을 가지고 있는지 평가에서 시도를 촉진하고 표준화하기 위해, 우리는 실행하고 아직 정확하고 재현 결과를 제공하는 간단 STH 감염 또는 측정 체력 진단 방법을 제시한다. 이 STH 감염의 건강에 미치는 영향에 관한 새로운 증거를 생성하는 데 도움이 될 것입니다.

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Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

토양 - 전송 helminths (STHs)과 만성 감염 stunting, 그리고 성장 자녀의 낭비, 흡수 장애를 일으 킵니다. 따라서, 이러한 감염은 또한 아이들의 체력을 줄일 것을 그럴듯합니다. 여기, 우리는 STHs과 어린이의 물리적 피트니스을 평가하기위한 20 미터 셔틀이 운영하는 시험의 진단을위한 두 기술을 표시합니다.

결정 토양을 전송 기생충 감염 현황 및 학교 세 어린이의 물리적 휘트니스

Soil-transmitted helminth (STH) infections are common. Indeed, more than 1 billion people are affected, mainly in the developing world where poverty ...

determining-soil-transmitted-helminth-infection-status-physical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.1K 조회수.  Swiss Tropical and Public Health Institute, Basel, Switzerland. 토양 - 전송 helminths (STHs)과 만성 감염 stunting, 그리고 성장 자녀의 낭비, 흡수 장애를 일으 킵니다. 따라서, 이러한 감염은 또한 아이들의 체력을 줄일 것을 그럴듯합니다. 여기, 우리는 STHs과 어린이의 물리적 피트니스을 평가하기위한 20 미터 셔틀이 운영하는 시험의 진단을위한 두 기술을 표시합니다.

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Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

임상 항체 샘플 Phagocytic 활동 결정

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

에서 계란을 사용하여<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; 등<em&gt; 생체내에서</em기생충 유도된 폐 염증의&gt; 모델

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

코튼 면화씨 벌레의 Densovirus의 호스트 피트니스에 호스트 조직 배포, 전송 모드 및 효과 조사를위한 프로토콜

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...