저자 J. Priscu, A. Chiuchiolo과 수집 및 남극의 샘플의 보존에 도움을 맥머도 LTER 호소학 팀 감사합니다. 우리는 병참 지원을 Ratheon 폴라 서비스 및 PHI 헬기를 감사드립니다. 가벼운 micrographs는 고급 현미경 및 이미징 센터 마이애미의 센터에서 발생했다. 이 작품은 폴라 프로그램 보조금 0,631,659 및 1,056,396의 NSF 사무실에 의해 지원되었다.

1. 샘플 수집 <ol><li> 선택하고 물에 열을 샘플링하기 전에 언젠가는 샘플링 사이트를 준비합니다. 이것은 물의 열의 층상 레이어 드릴링과 아이스 홀 용해에 의한 교란 후 개혁 수 있습니다. GPS에 의해 드릴 사이트의 위치를​​ 파악합니다. </li><li> 물에 열을 액세스하려면 4 인치 순간 항공편 확장과 절단 비트에 부착된 순간 얼음 송곳으로 얼음을 뚫고 구멍을 뚫는하여 시작합니다. 구멍의 드릴의 동결을 방지하기 위해 물을 칼럼의 맨 위에 시추 약 4~6인치을 중단하여 액체 물에 드릴링을 방지하려고합니다. </li><li> 드릴 구멍은​​ 이전 샘플링에 15~60센티미터의 직경으로 확대해야합니다. 이것은 구리 파이프를 통해 온수 폴리에틸렌 글리콜을 순환 구멍 melter (벗고 다니는 모델)을 사용하여 수행됩니다. 홀 용해는 일반적으로 18시간까지 걸립니다. </li><li> 이전 물이 열을 샘플링에,되도록 모든 필요한 장비와 샘플 일orage 혈관이 샘플링 현장에서 조립한다. 샘플링 자료는 다음과 같습니다 Niskin 병 (5-10 패 용량), 깊이-보정 케이블 윈치, 메신저, 각 샘플링 깊이에 대한 충분한 샘플 병 및 샘플 전송 쿨러합니다. </li><li> 호수 물 필터링 샘플링 당일 완료되어야으로 이른 시간에 (~ 5시)의 샘플링 시작합니다. 보정에 부착된 Niskin 샘플러를 사용 (6 미터, 15 미터, 얼음 구멍 piezometric 수위에서 측정한 18 미터 샘플링 깊이, 본 연구의 경우) 원하는 깊이에서 물을 샘플 (1-5 패)를 수집 핸드 윈치. 물 열의 교란을 방지하기 위해서는 더 깊은 것들 전에 얕은 깊이를 수집합니다. </li><li> 스토어 호수 샘플 쿨러 및 샘플 사이트에서 ATV (모든 지형 차량)에 붙어 썰매를 사용하여 필드 실험실로 운반 인치 현장 실습 후 즉시 샘플링시 : 샘플 처리 또는 (액체 질소의 플래시 프리즈 예)를 안정화되어야한다. </li></ol> 2. Developme농축 문화 NT <ol><li> 농축 문화 재배의 경우 부드러운 여과를 (&lt;0.3 ATM)를 사용하여 47mm 0.45 μm의 기공 크기 polyethersulfone 필터에 호수의 물이 0.5-1 L을 집중해라. 자연 지역 사회의 다양성을 원하는 경우, 47mm 0.45 μm의 기공 크기 polyethersulfone 필터에 두 번째 샘플을 필터링하고 4. 진핵세포 생물 phylogenetic 다양성에 대한 Bielewicz 외에 따라 프로토콜을 따릅니다. </li><li> 필터와 같은 샘플링 깊이에서 수집한 필터링 호수의 물이 ~ 20 ML을 포함하는 50 ML 멸균 팔콘 튜브 필터를 전송합니다. 부드럽게 멸균 피펫을 사용하여 필터에서 세포를 씻는다. </li><li> 25cm이 무균 세포 배양 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 45 ML로 문화 볼륨을 높이기 위해 각 시료 농도에서 수집한 필터링 호수를 추가합니다. 다른 문화 미디어 enrichments이 원하는 경우 여러 각 샘플링 깊이에 대한 복제 설정합니다. </li><li> 50X의와 문화 flasks을 보완볼드의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 매체, BG11 및 F / 2 : 다음의 문화 미디어 1X의 최종 농도로 terile 솔루션. mixotrophic 생물 배양은 세트 최대 두 F/2-supplemented 혈관 필요하며 flasks 중 하나에 무균 쌀로부터 2-3 알갱이를 추가하는 경우. </li><li> 귀하의 미국 연구소에 출하하기 전에 남극의 최소 4 주 동안 온도 제어 성장 배양기에서 저온 (4 ℃)과 낮은 방사 (20 μmol m -2 광자들 -1)에서 문화 flasks을 품어. 2 주간 배양 후 적절한 성장 미디어를 포함하는 한천 플레이트에 농축 문화의 분리가 필요한 경우, 접시에 250 μL. </li><li> 미국, 멸균 50 ML 팔콘 튜브로 전송 농축 문화에 발송하십시오. 의 요청 선적 조건은 &quot;동결 안&quot;및 요청을 출하에 &quot;쿨하게.&quot; 남극 대륙의 운송 과정이 비교적 빠르고 (이주 상업용 비행기로)과 신뢰성이 높은 반면, 까다로운 장기 손실의 가능성이 있습니다전송 과정에서 isms. 따라서 수사 당국은 운송 과정에서 특정 종류의 손실이 평가 수 있도록 선적하기 전에 subsample을 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 미국에 도착 후, 125-ML 멸균 Erlenmeyer 플라스크에 적절한 성장 미디어 45 ML로 농축 문화의 양도 5 ML은 멸균 스폰지로 공을. 농축 문화는 4의 제어 환경의 성장 챔버 (낮의 성장 회의소, VWR) ° C/20 μmol m -2 광자의 -1 온도에서 문화를 서로 유지되어야합니다. 문화는 신선한 언론 매 30 일 이내에 양도해야한다. </li></ol> 3. 필터링 Enrichments에서 세포 Lysate 추출 <ol><li> 부드러운 진공 (&lt;10 PSI)를 사용하여 25mm 워트 먼지 GF / F 필터쪽으로 농축 문화의 필터 5 ML. 필터는 -80에서 몇 주 동안 저장될 수 있습니다 ° C에서 사전 RubisCO 활동을 시금 있습니다. </li><li> 멸균 스틸 가위로 4-5 섹션으로 필터를 잘라전송이 ML 스크류 캡 튜브로 멸균 포셉있는 조각 0.1 밀리미터 직경 지르코니아 / 실리카 구슬로 가득 방법 중 하나 오분 가득. </li><li> 10 MM NaHCO 3, 10 밀리미터 DTT, aminocaproic 3.3 MM : 신선한 추가, 필터 추출 버퍼의 1.25 ML을 (50 밀리미터 bicine, 10 밀리미터 MgCl 2, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 밀리그램 / ML BSA 및 0.1 % 트리톤 X-100 추가 산 0.7 밀리미터 benzamidine, 산도 7.8) 13과 속도 설정 48에서 30를 위해 Minibead 때리는 세 번 사용하여 세포를 방해. 1 분 얼음 보육과 샘플의 난방, 대체 beadbeating을 방지합니다. </li><li> GF / F 필터 섬유와 세포 벽의 잔해의 느슨한 펠렛을 형성 4 ° C에서 3,000 XG에서 2 분 동안 필터 슬러리를 원심 분리기. </li><li> 얼음처럼 차가운 90 % 아세톤 800 μL에 200 μL 나누어지는하고 잠그다를 제거합니다. 추출물 엽록소를 측정 (chl) 664 nm의 및 647 nm의 14 파장 값에서 분광 광도계에서. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> remaini을 원심 분리기4 번 NG 뜨는 °이 15,000 XG의 분 및 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 (불용성 세포 세포막의 펠렛 및 남은 GF / F 필터 섬유를 방지) 뜨는을 전송을위한 C #. 이 수용성 세포 lysate 이제 RubisCO의 carboxylase 활동 분석에 사용될 수 있습니다. </li><li> Lysate는 -80 ° C에서 액체 질소에서 12.5 %의 글리세롤과 플​​래시 동결 외에 후 저장할 수 있습니다. 활동의 손실이 lysate에서 효소의 감도에 따라 여러 동결 / 해동 사이클 이후에 발생할 수 있습니다. 따라서 신선한 대 냉동 lysate의 활동은 대규모 세포 lysate extractions하기 전에 테스트해야합니다. </li></ol> 4. RubisCO Carboxylase 활동 필터 분석 <ol><li> 빙판에 차게되어 15 ML 스크류 캡 microcentrifuge 튜브 (필요하지 캡)에 용해 lysate 125 μL를 전송합니다. 부정적인 컨트롤 샘플의 경우 15 ML 스크류 캡 microcentrifuge 튜브에 125 μL 용해 lysate를 추가하지만, (4.7 단계)을 기판을 추가하지 마십시오. 실행모든 샘플과 부정적인 컨트롤에 대한 반응을 중복. </li><li> 10 신선한 분석 버퍼의 ML (50 MM Bicine-NaOH, 산도 8.0, 50 MM NaHCO 3, 25 밀리미터 MgCl 2) 얼음의 냉기를 준비합니다. 충분히 5 ML 관으로 샘플과 부정적인 컨트롤 (샘플 / 제어 플러스 100 μL 추가 당 100 μL)의 모든 분석 버퍼 나누어지는. 연기 후드 모든 후속 단계를 수행합니다. </li><li> 14 CO 3 (500 μCi / ML) 당 ML aliquoted 버퍼에 대한 분석 버퍼의 아니 40 μL를 추가하고 얼음에 버퍼를 유지. </li><li> 14 C를 포함하는 분석 완충액 10 μL를 제거하고 분석 완충액 1 ML에 희석. 섞어 반전 후, 섬광 유리병에 칵테일 계산 바이오 안전 II의 섬광 3 ML에 1:100 희석 혼합물의 100 μL를 추가합니다. 믹스하는 반전. 섬광 카운트 (Beckman LS6500)는 분석과 함께 계속하기 전에 18,000 노출당 비용 (CPM) 이상이어야합니다. </li><li> 정도 아니 14 CO 3 검정 버퍼에 추가되었습니다 때,3-5 분 25 ° C와 부화 미리 건조한 목욕탕에 반응 튜브를 이동합니다. </li><li> lysates에 100 μL 분석 버퍼를 추가하고 25 살에 5 분 동안 품어 ° C. </li><li> 샘플로 15 밀리미터 Ribulose의 bisphosphate 20 μL를 추가하고 반응이 25에서 5-10 분 동안 진행하도록 ° C. </li><li> 반응을 중지하여 100 μL 프로피 온산 (100 %) (피셔)를 추가합니다. 비법인 14 C를 소진 2,000 XG에서 1 시간 동안 원심 </li><li> 3 ML 바이오 안전 II의 섬광 계수 칵테일을 포함하는 섬광 유리병에 시료의 전체 볼륨을 전송합니다. 섬광 계수 (B. Witte, R. Tabita 개인 통신)에 의해 산성 안정적인 최종 제품의 CPM를 결정합니다. </li><li> chl적으로 14 RubisCO 활동 률을 계산합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 우리는 추위에 적응 phototrophic과 남극 L에 거주 mixotrophic protists을 분리 농축 culturing를 활용안으로 Bonney. 볼드의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 (BBM) 15 F/2-Si 마린 중간 16, 17 BG11 중간 18 : 생물의 큰 다양성을 캡처하려면, 세 성장 미디어 유형을 테스트했습니다. 가벼운 현미경에 의한 농축 문화 영상 검사는 문화가 phototrophic의 protists (대부분의 세포에 엽록소 안료의 존재로 표시)에 의해 주도되고 있다고 발표하고 inoculum이 수행된있는 샘플링 깊이에 따라 세포 morphologies의 다양성과를 숨겨 문화에서 사용되는 미디어의 종류 (그림 1). 우리는 탄소 고정 가능성에 대한 프록시로서 효소에 의해 촉매 RubisCO carboxylase 활동의 최대 속도를 측정했습니다. Chl 풍요로움도 phototrophic의 protist의 바이오 매스 추정 (그림 2)로 모니터링했습니다. 같은 온도 / 라이트 정권 (ie. 4 ° C/20 μmol m -2들 -1), 탄소 고정 가능성 하에서 모든 문화권의 재배에도 불구하고그리고 phototrophic의 바이오 매스는 농축 문화 사이에 극적으로 변화. 문화가 4 전시 F / 2 성장 매체 (Enrichments 19, 21, 23)에 풍부하게하면서 최대 RubisCO 활동, BBM (Enrichments 4 및 6) 또는 BG11 (Enrichments 13 14) 성장 매체 중 하나에서 재배 농축 문화권에서 관찰되었다 - 34 배 낮은 최대 carboxylase 활동. carboxylase 활동 Chl 기초 표현 과정에서 이러한 차이는, F / 2 개 문화권의 낮은 바이오 매스 수준으로 인해 아니었다. 또한, RubisCO 활동 chl 농도 (., 그림 2, 삽입된 페이지 R = -0.023, P&gt; 0.1)와 연관되지 않았다. 다른 모든 문화에 관계없이 RubisCO 효소 활동 (그림 2) 상대적으로 낮은 chl을 전시하면서 6m 15 M (Enrichments 4 및 5)에서 호수로 주사 BBM 문화는 최고의 chl 수준했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> 1 그림.대표 미생물의 진핵세포 생물 농축 다른 생물의 성장을 위해 선택한 문화. 문화의 정체성은 패널의 왼쪽 하단에 있습니다. 모든 이미지는 1000X 확대 기름 침지를 사용하여 생성된 빛이 micrographs를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> 그림 2. 잠재적인 탄소 고정 용량 및 추출물 엽록소 호수 Bonney 격리 및 각종 문화 매체에 성장 남극 미생물의 진핵세포 생물 농축 문화의 수준. 문화 자세한 내용은 표 1을 참고 삽입된 페이지 :. 엽록소 사이의 피어슨 상관 관계 남극 미생물의 진핵세포 생물 농축 문화의 풍요로움과 탄소 고정 가능성을.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+and+gross+growth+efficiency+of+an+Antarctic+bacterivorous+protist.">Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist.</a> The ISME journal. 3, 252-260 (2009).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

최근 분자 연구 환경 3, 19, 20의 범위에 걸쳐 단세포 eukaryotes의 높은 다양성을 보고된 바 있으나, protist의 서식지의 전체 범위에 걸쳐 분리의 부족으로 이러한 개인 종의 기능적 역할은 식품 거미줄에 주로있다 알 수없는. 본 연구에서 우리는 상대적으로 undersampled 환경, 영구 얼음으로 덮인 남극 호수에서 대사 다양성을 전시 미생물 진핵세포 생물 종에 대해 풍부하게하는 방법을 설명했습?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> BBM </td><td> 시그마 </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> 시그마 </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> 시그마 </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F 필터 25mm </td><td> 피셔 과학 </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F 필터 47mm </td><td> 피셔 과학 </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethersulfone 필터, 0.45 μm의 기공, 47mm </td><td> 막 생명 과학 </td><td> 61,854 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 세포 배양 플라스크, 25cm 2 </td><td> 코닝 </td><td> 430,639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurna내가 성장 챔버 </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> 지르코니아 / 실리카 구슬, 0.1 밀리미터 diamter </td><td> BioSpec 제품 </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> 미니 비드 때리는 사람 </td><td> BioSpec 제품 </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> 나사 캡 microcentrifuge 튜브 (1.5 μL) </td><td> 미국 과학 </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> 콜로라도 314 아냐 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> -20 ° C에서 400 μL의 aliquots에 보관 </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> 시그마 </td><td> R0878-100mg </td><td> 10 MM 트리스 - 프로피 온산 (산도 6.5)에 디졸브 </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

호수 Bonney는 남극, 맥머도 드라이 계곡에 위치한 다수의 영구 얼음으로 덮인 호수 중 하나입니다. 다년생 얼음 커버는 화학적으로 층상 수주를 유지하고 물을 다른 내륙 기관과는 달리 주로 탄소와 스트림로부터 영양소의 외부 입력을 방지합니다. Biota는 겨울 한 동안 연중 심각한 영양 결핍, 낮은 온도, 극단적인 그늘, hypersalinity, 그리고 24 시간 어둠 등 다양한 환경적 스트레스에 노출됩니다. 이러한 극단적인 환경 조건이 미생물 2로 거의 대부분 호수 Bonney에 biota을 제한하고 있습니다. 단세포 미생물의 eukaryotes은 ( &quot;protists&quot;)는 세계 biogeochemical 자전거 3의 중요한 선수이며, 수산물 식품 웹의 기본 및 차 역할을 모두 점령, 마른 계곡 호수에있는 탄소 사이클에서 중요한 생태적 역할을 재생합니다. 내가 문제를 해결 마른 계곡 수산물 식품 웹, protists에서norganic 탄소 (autotrophy)는 organotrophic 생물 유기 탄소 4, 2의 주요 생산자이다. Phagotrophic이나 박테리아와 작은 protists를 복용시킬 heterotrophic protists는 식품 웹에서 5의 최고 포식자 역할을합니다. 마지막으로, protist 인구의 알려지지 않은 비율이 결합된 mixotrophic 신진 대사 6, 7이 가능합니다. protists의 Mixotrophy가 육식 동물의 미생물의 phagotrophic 섭취와 함께 광합성 능력을 결합하는 능력을 포함한다. mixotrophy의이 양식은 일반적으로 이해 해산 탄소 분자를 포함 세균 종의 mixotrophic 대사, 다릅니다. 가 거의 protist의 분리는 영구 얼음 덮인 극지방 호수에서 현재,이 극한 환경에서 protist의 다양성과 생태 연구는 제한된 8, 4, 9, 10, 5되었습니다. 간단한 마른 계곡 호수 식품 웹에서 protist 대사 다양성의 더 나은 이해를 위해 R 모델의 개발에 도움이됩니다글로벌 탄소주기의 protists의 OLE. 우리는 호수 Bonney에서 잠재적으로 phototrophic 및 mixotrophic protists 격리시킬 농축 문화 방식을 채용. 물 열에 샘플링 깊이는 일차 생산 맥시멈 및 protist phylogenetic 다양성 4, 11의 위치뿐만 아니라 protist의 영양 모드에 영향을 미치는 주요 비생물적 요인의 다양성을 바탕으로 선정되었습니다 : 얕은 샘플링 깊이는 주요 영양소에 대한 제한됩니다 동안 깊이 샘플링 깊이 빛의 유무에 의해 제한됩니다. 또한, 호수 샘플은 phototrophic 생물의 다양한 성장을 촉진하는 성장 미디어의 여러 유형으로 보충했다. RubisCO는 캘빈 벤슨 Bassham (CBB) 사이클, autotrophic 생물은 무기 탄소를 수정하고 수생 및 지상파 식품 거미줄 12 높은 영양 수준을위한 유기 탄소를 제공하는 주요 통로에 올라서 제한 속도를 catalyzes. 본 연구에서는 우e는 호수 Bonney 농축 문화의 탄소 고정 잠재력과 신진 대사 다양성에 대한 프록시로 최대 carboxylase 활동을 모니터링하기 위해 필터 샘플을 13으로 바뀌었 방사성 동위 원소 분석을 적용.

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Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

미생물 eukaryotes 모두 영구 얼음으로 덮인 남극 호수에서 photosynthetically 파생 카본과 최고의 육식 종의 원천입니다. 이 보고서는 남극 호수, 호수 Bonney에서 metabolically 다양한 미생물의 eukaryotes를 분리하기 위해 농축 문화 접근법을 설명하고 Ribulose-1 ,5-bisphophate carboxylase의 oxygenase (RubisCO) 활동을 위해 방사성 동위 원소 분석을 사용하여 무기 탄소 고정 가능성을 평가합니다.

탄소 고정 가능성 화학 층상 남극 호수 및 평가에서 미생물 진핵 농축 문화의 확립

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

establishment-microbial-eukaryotic-enrichment-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K 조회수.  Miami University. 미생물 eukaryotes 모두 영구 얼음으로 덮인 남극 호수에서 photosynthetically 파생 카본과 최고의 육식 종의 원천입니다. 이 보고서는 남극 호수, 호수 Bonney에서 metabolically 다양한 미생물의 eukaryotes를 분리하기 위해 농축 문화 접근법을 설명하고 Ribulose-1 ,5-bisphophate carboxylase의 oxygenase (RubisCO) 활동을 위해 방사성 동위 원소 분석을 사용하여 무기 탄소 고정 가능성을 ?...

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Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

StemCell 기술에서 RosetteSep 키트와 함께 인간의 피를에서 NK 세포의 농축

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

연구

생물학

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

가금류 생산 샘플에서 세균 공동체의 정성 및 정량 평가를위한 하이브리드 DNA 추출 방법

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

유전자를 사용 하 여 프로토콜 변환 연구에 대 한 적절 한 동물 모델을 식별 하기 위해 농축 분석 설정

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

그노토바이오틱 아메리칸 바퀴벌레설립 및 유지보수(페리플라나 아메리카나)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Cuvette-type Fast Repetition Rate Fluorometer에 의한 Colacium sp.의 부착 단계의 광생리학 측정

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.