We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 방법은 수중 생태계에서 바이러스와 미생물 역학의 포괄적 인 평가를 생성하는 도구를 제공합니다. 그들은 미생물 군집에 사용할 수 유기 및 무기 자원의 서 주식을 정량화하고 바이러스와 미생물 군집 존재의 구성의 특성을 목표로하고 있습니다. 다음 바이러스 풍부하고 미생물 풍부한 바이오 매스를 정량화에, 게놈 서열 정보는 지역 사회의 구조와 기능을 알 수있다. 모든 방법이 개발 또는 원격 필드 위치에서 응용 프로그램을 허용하도록 수정되었습니다. 그러나 제어 실험실 설정의 부족은 본질적으로 오류에 대한 몇 가지 가능성을 만듭니다. 여기에서 우리는 평가 각 매개 변수와 관련된 몇 가지주의 사항에 대해 설명합니다. 다음 오염 가능성에 샘플 동안 또한 분석 과정에서 오류 가능성을 산출 일부 매개 변수를 처리. 용존 유기 탄소 탄소 오염 (하류 샘플링 또는 보트 또는 잠수의 근방), 시료 전처리 과정 (장비 또는 부주의 핸들링 오염), 심지어 시료의 저장 동안 (다른 샘플을 냉장고에서 유기물 함유 샘플링 절차 중에 발생할 수 용제 / 휘발성 물질). 각 샘플 재배치 오염의 추가 소스를 포즈, 가능한 한 적은 수의 처리 단계 등의 오염 행위의 다양한 소스를 방지하려면. 샘플은 없습니다 산 세척 또는 연소 된 모든 항목과 접촉하지합니다. 마지막으로, 휘발성 유기 물질을 함유하지 않는 시료 전용 스토리지 냉동기를 지정하는 데는 긴 저장 기간 동안 샘플의 무결성을 보장한다. 샘플을 농축 HCl로 DOC 샘플의 출장 기간 산성화 중에 냉동 보존 될 수없는 경우 (38-41 바와 같은) 적용 가능한 대안 일 수있다. 측정 정확도 DOC 컨센서스 참고 자료가 레지 표기 확인하려면DOC 측정시 ularly 실행됩니다. 그것 DOC 함량 42 매우 안정적이므로 특히 해양 심층수 (&gt; 2,000m) 참조는 분석 시스템의 성능을 평가하는 데 가치가있다. 입자상 유기 물질 유기 탄소 오염을 방지하는 것 외에도, POM 샘플링은 필터링 된 볼륨의 정확도를 보장하기 위해 특별한주의를 필요로한다. 500 ㎖가 타겟 볼륨 잠재적 이유로 이탈해야한다면 이는 파생의 여액에 필터에 포획 POM의 양을 관련시키기 주목해야한다. 무기 영양소 유기 탄소 샘플링과 마찬가지로,주의 보트 또는 폐수 배출 (12)와 같은 다양한 소스에서 생성 가능한 영양 샘플 오염에 지불해야합니다. 0.8 ㎛의 공칭 기공 크기와 유기 탄소 샘플링에 사용되는 필터는, 모든 미생물 바이오 매스와 쉬를 제외하지 않을 수 있습니다울드 따라서 이러한 여과 공정에 대해 0.2 ㎛의 필터로 변경. 또한, 검출 한계는 영양 샘플 문제를 제기; 특히 많은 산호초 위치 (예를 들면, 코너를 등. 43) 주변의 빈 영양면 물. 검출 한계는 대략 약 0.1, 0.2, 암모늄, 질산과 아질산염 및 오르토 - 인산 0.1 μmol / L 각각 (36,12,37 참조)입니다 현미경 사용 현미경 슬라이드에서 샘플 이미지 분석의 농도의 변화 옆에 추가 오류 가능성을 산출한다. 예를 들어, 이미지가 시야의 일부 영역에 초점이, 그리고 다른 사람에 초점을 수 있습니다. 고순도 알루미나 매트릭스 필터는 매우 단단한 필터 타입이기 때문에, 아래의 필터 이물질은 전체 필터 슬라이드 각도에 앉아 발생할 수있다. 결과적으로, 이미지는 다시, 주어진 필터에 대한 시야의 다양한 부분에서 초점이 일관 될 수현미경 정렬와는 상관이없고. 이 관찰되는 경우, 필터의 밑면을 보장 필터 재 마운트 것은 깨끗한,이를 개선 할 수있다. 또한, 어떤 경우에는 바이러스 및 미생물이 발견 될 수있는 두 초점면이있을 수있다. 이것은 장착시에 필터로부터 분리되고, 그리고 카운트 신뢰할 수 커버 슬립의 밑면에 떠 염색 오브젝트의 결과이다. 그러므로, 항상 공정 동안 샘플의 품질을 확인하기 위해 추천된다. 유동 세포 계측법 현미경 샘플에서와 같이 자연적으로 분석 프로세스의 조정을 필요로 샘플 유동 세포 계측법의 차이 발생이있을 수 있습니다. 예를 들어, 기기의 감도에 따라 희미 형광 Prochlorococcus 셀은 잡음 레벨 이하로 할 수 있고, 정량 않을 것이다. 비즈 확인하기 위해, 예를 들어, 내부 샘플 제어 (역할을하는 악기의 RESP형광 신호 온세는 날마다 일치 (및 실행 자체 동안 안정적으로 유지). 공지 된 농도에서 시료에 첨가하는 경우, 그들은 또한 샘플 량 실행을 검증하는 내부 제어로서 역할을 할 수있다. 그러나, 항상 해동하고 96 웰 플레이트 사이 실행 처리 샘플에 대한 추가적인 생물학적 제어를 제공하기 위해 관심의 샘플과 함께 얼룩이 이전 동결 &quot;표준&quot;해수 샘플의 분취 량을 실행하도록 권장한다. 위치에 따라, 해수 샘플은 서로 매우 다를 수 있습니다. &quot;대표&quot;인구를 정렬하고 epifluorescent 현미경 (EM)에서보기를 신속 하나 Synechococcus SP. 또는 광합성 진핵 생물로 식물 플랑크톤의 개체수를 확인하는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 그들은 너무 빨리 퇴색하기 때문에 Prochlorococcus 세포가 EM에서 일반적으로 볼 수 없습니다. 또한, Synechococcus SP는 클로로필. 또한 pH를 포함엽록소 A (660-700 ㎚)보다 단파장 (540-630 ㎚)로 발광 otopigment phycoeurythrin (PE). Synechococcus 세포 블루 / 그린 빛 (470-490 nm의) 흥분 할 때 510 nm의 아래 빛의 모든 파장을 제거하는 배기 필터에서 볼 경우, 그들은 황금 나타납니다. 빛의 같은 파장으로 흥분 할 때 비교함으로써, 진핵 부분은 빨간색 볼 것이다. 바이러스 성 메타 지노믹스 그것은 VLP 농도 및 저장 과정을 회수 사회에 영향을 유의하는 것이 중요하다. 바이러스 성 입자 손실이 프로세스의 모든 단계에서 발생할 수 있고, 따라서, 바이러스 농축 및 정제 프로토콜의 선택은 궁극적으로 생성 된 바이러스 metagenomes 44,45,18의 분류 학적 관찰과 조성의 다양성에 영향을 미칠 수있다. 샘플을 농축 TFF 19 또는 화학적 응집 계 (20)를 사용하여 수행 할 수있다. 화학 기반의 접근 방식, 멋 부리다에서ively 철 이온 용액으로부터 응집 8 μm의 필터를 사용하여 복구 될 수있다 큰 (&gt; 8 μm의) 철 - 바이러스 성 복합체를 형성하는 천연 음전하 바이러스 입자를 바인딩 청구. 이어서 철 바이러스 입자를 킬레이트 핵산 추출 20 농축 바이러스 입자를 떠나, 마그네슘, 아스코르브 산, 및 EDTA를 사용하여 다시 용해된다. 이러한 두 가지 현재의 방법과 비교 한 후, 우리는 염화철 방법은 TFF 바이러스 농도보다 적은 시간 소모적이지만, 몇 가지주의를 산출 할 수 있다는 결론을 내렸다. 우리는 철 바이러스의 분리 및 용해를 발견 필요로하는 두 배 용해 아스 코르 빈산이 저하되기 전에 진행하기 위해서는보고 (20)보다 더 농축 된 마그네슘 아스 코르 빈산-EDTA 솔루션을. 이와는 문제로부터, 프로토콜은 0.2 μm의 여과를 이용하여 미생물 오염 물질을 제거 단독 크기 분별하여 바이러스 입자를 정화한다. 대형 바이러스는 여과 및 통과하지 않습니다어 (예를 들어, 양 등. 46) 따라서 metagenome에서 검출되지 않습니다, 일부 박테리아는 않지만 (McDole, 게시되지 않은 데이터). 큰 바이러스 차별 동안이 박테리아 오염을 초래한다. 즉, 특정 문제 그러나 또한 TFF 농도와 관련 미생물의 제거에 적합하다. 클로로포름 처리 외부 지질막 (47)과 클로로포름 민감성 바이러스를 제거하기 위해 도시 한 바와 같이 일부 연구는 0.22 μm의 여과 박테리아의 대부분을 제거하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 제시된 방법은 주로 박테리오파지, 해양 환경에서 유전 물질의 가장 풍부한 캐리어를 대상으로 주목해야한다. 파지가 일반적으로 생각하기 때문에하지 일반적으로 그들은 클로로포름 처리에 더 저항성 지질 (48)를 포함한다. 우리의 지식에있는 &quot;포괄적 인&quot;방법은 지금까지 존재하지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 OU에서 적응북극 시스템에 열대에 걸쳐 다양한 해양 환경에서 지난 10 년 동안 연구 현장 경험. 미생물 메타 지노믹스 미생물 (즉, 박테리아 및 고세균) 미국 metagenomic 라이브러리의 구성은 라이브러리 제조를 위해 필요한 최소한의 DNA 농도를 생성하기 쉽다 바이러스 성 metagenomes보다 더 간단하다. 다중 변위 증폭 (MDA)에 기초 링커 증폭 산탄 라이브러리 (LASLs) 17,49,50 및 전체 게놈 증폭 시퀀싱 충분한 DNA를 생성하는 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 미생물 metagenomes 더 높은 DNA 농도를 얻기 MDA의 사용은 때때로 필요하다. 그러나 이것은 같은 와편 모 조류의 minicircles의 overamplification과 시퀀스 데이터 아티팩트가 발생할 수 있습니다. MDA 방법은 비 - 정량적 결과 51,52 결과, 우선적으로 단일 가닥 및 원형의 DNA를 증폭하는 것으로 알려진. 최적화 된 LASLs (50)은 이렇게 미생물 및 시퀀싱 바이러스 성 metagenomic DNA를 모두 증폭에 더 나은 대안 역할을 할 수있다 접근. 그것은 LASLs 방식은 여러 단계가 복잡한 장비가 필요하고, dsDNA 템플릿에 한정된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 또한, 조직 DNA 추출 키트 그람 양성 및 그람 문 (門) 모두에서 DNA를 추출하기 위해 도시되었지만, 효과적으로를 Lyse 분해성 미생물 분류군 또는 연관된 구조체에 검증되지 않은 (예를 들면, 특정 고세균, 내생 포자, 진균 포자) . 따라서 비드 비팅 단계 특정 미생물로부터 DNA를 얻기 위해 필요할 수있다. 이러한 종합적인 평가는 바이러스와 미생물 생태계의 기능을 더 잘 이해 될 것입니다. 몇몇 연구는 제안 된 모든 매개 변수를 평가하는 노력을 수행하고 있지만, 많은 사람들이 선택한 사람을 조사하고있다. 넬슨 등. 53 betw 연결 제안근해를 기준으로 모두 DOC와 bacterioplankton 농도 EEN 특정 산호초 서식지 및 고갈. 이러한 농도 변화는 bacterioplankton 지역 사회의 뚜렷한 차별화를 동반했다. 딘즈 데일 등. 5는 증가 인위적 영향은 미생물 세포와 바이러스 입자의 10 배 이상 풍부함을 동반 한 것으로 나타났다. 이 거주하는 섬 주변 해수의 미생물 군집은 종속 영양 미생물과 잠재적 인 병원균 5의 큰 분수를했다. 마지막 McDole 등. 4는 인간 활동 macrobes의 비용으로 미생물에 에너지를 전환하고 있다는 microbialization 점수를 도입함으로써, 보였다. 특정 미생물과 물 화학 매개 변수에 초점을 맞춘이 연구는 해양 생태계의 생화학 적 구조에 새로운 통찰력을 제공합니다. 온도와 산도 값, 생선, 바이오 매스 및 diversi처럼 - 생태계 모니터링 노력의 기존의 데이터를 결합타이, 저서 커버, 또는 인간에 미치는 영향에 노출 - 물 화학 및 미생물 평가와 함께, 가능성이 더 구체적으로 대상 보존 노력으로 이어질 수 더 민감한 환경 모니터링 활동, 발생합니다.

해양 생태계는 정점 육식 동물의 바이오 매스에 영양 가용성의 변경을 초래할 섭동의 광범위한을 실시한다. 지난 10 년간 여러 연구는 해양 생태계 1-4에서 미생물 군집의 중요성을 증명하고있다. 이는 박테리아 및 바이러스 사회의 변화가 밀접 해양 환경 (5)의 전반적인 분해와 관련된 것을 알 수있다. 이러한 변경 사항은 산소 가용성 또는 탄소 재석 회화 6,7로 물 열에서 변경된 지구 화학에 의해 촉진 될 수있다. 대형 생물, 화학 물 및 미생물 활성 피드백 루프 사이의 상호 의존성의 결과 생태계 열화 (8)의 속도를 가속 할 수있다. 1970 년대와 80 년대 여러 시도는 해양 생태계 9-11에서 생지 화학 순환을 해명 하였다. 이들 초기 연구의 주된 과제 중 하나는 부족했다표준화 된 접근 방식의 평가 생지 화학적 매개 변수를 측정합니다. 주로 해수 영양분 12, 13에 사용 가능한 프로토콜,이 있었지만, 탄소 역학의 평가 및 미생물 군집 구조가 사용할 수있는 도구와 방법으로 제한되었다. JGOFS EqPac 방법의 비교를 통해, 샤프 등. (14)는 처음으로 용존 유기 탄소 (DOC) 농도 평가를위한 안정적이고 표준화 된 프로토콜에 대한 제안했다. 2000 년대 초반으로 분석 과제 따라서 대부분 해결되었다 미생물 지역 사회 가용 자원을 결정하고 (드롱 15 참조)를 설립했다 통제 문화 환경에서 미생물 군집의 특성을 접근합니다. 이 때 기존의 시퀀싱 방법은 크게 재배 클론 배양에 의존. 자연 시료의 초기 환경 유전자 염기 서열은 미생물 생물 다양성의 대부분 cultiv 놓친했다, 그러나, 계시ATION 기반의 방법 (16). 2002 년 Breitbart 등. 17 교양 해양 바이러스 공동체 전체 게놈 시퀀싱하는 방법을 확립 해수 환경 시료에서 바이러스 커뮤니티를 설명하기 위해 처음 샷건 서열 분석을 사용 하였다. 대부분의 문화 어렵다으로 기존의 미생물 평가 내에서 바이러스는 여전히, 특히 아래에 연구 된 유지하고는 16S 리보솜 RNA (rRNA의) 일반적으로 다양성과 지역 사회 프로파일을 평가하기 위해 사용되는 유전자로 보편적으로 보존 된 마커 부족하다. metagenomic 시퀀싱 방법은 복잡한 바이러스 커뮤니티를 분석하기위한 배양 의존적 유전자 타겟팅 방법에 대한 대안을 제공한다. 해수로부터 생성 제 바이러스 metagenomes는 생거 시퀀싱 (17)를 사용하여 서열화 동안, 차세대 시퀀싱 기술 및 향상된 분자 기술의 개발이 연구 metagenomic 18가 급증하게되었다 </s&gt;까지. 바이러스 메타 지노믹스 대한 현재 실험실 작업 흐름은 핵산 (DNA 또는 RNA) 추출, 도서관 준비, 시퀀싱 19-21 이어 바이러스 입자의 분리, 농축, 및 / 또는 농축을 포함한다. 세계가 필수적입니다 주위에 다양한 시스템에서 데이터 세트를 비교, 수중 생태계에서 바이러스, 미생물, 생화학 적 기능에 대한 기존 지식을 발전합니다. 그러나, 기존 프로토콜은 대부분 쉽게 접근 실험실 시설과 가까운 해안 환경을 위해 개발되었다. 따라서, 표준화 된 필드 방법의 부족이 교차 생태계 비교를 방해한다. 여기에서 우리는 철저한 테스트를 소개하고 잘 원격 현장에서 사용할 수 있도록 기술 연구 프로토콜의 상태에서 적응을 표준화. 이러한 방법은 지난 십 5,22에 걸쳐 여러 연구에서 성공적으로 입증 된 현재 NOAA뿐 아니라 다양한 해양 실험실에서 사용하는리프 평가 및 태평양 4 전반에 걸쳐 모니터링 프로그램 (RAMP). 샘플링 프로토콜은 물 화학 매개 변수 (무기 및 유기 탄소 농도, 무기 영양소 농도), 바이러스 및 미생물 풍부하게 포함 (직접 세균 수, 직접 바이러스 수를하고, 종속 영양 비율 대 독립 영양 생물을 평가하기 위해 유동 세포 계측법), 바이러스 성 및 미생물 군집 구조와 metagenomic 분석을 통해 대사 전위 (개요는 그림 1 참조). 여기에 기술 된 방법에서 얻은 결과를 종합적 생태계를 특성화하는 데 필요한 키 생지 배경 파라미터를 규명하기 위해 요구된다.

<table><tbody><tr><td>Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Filtration setup</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>32-36% Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Fisher Sci</td><td>A508-212</td><td></td></tr><tr><td>High-density polyethylene (HDPE) container</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td></tr><tr><td>Combustion oven (550 &amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 ml HDPE vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>02-896-2B</td><td></td></tr><tr><td>25 mm GF/F filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-874-64</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>XX62-000-06</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, non-powdered gloves</td><td>Fisher Sci</td><td>19-170-010B</td><td></td></tr><tr><td>Bilge pump&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Thirsty Mate 124PF</td></tr><tr><td>20 L collapsible low-density polyethylene carboy</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Reliance Fold A Carrier II</td></tr><tr><td>Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td><td>Amersham</td><td>CFP-2-E-9A</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-cured silicon tubing for TFF</td><td>Cole Parmer</td><td>96440-82</td><td></td></tr><tr><td>Hose clamps</td><td>Cole Parmer</td><td>P-68007-23</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-77410-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polycarbonate track-etched membrane filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-300-61</td><td></td></tr><tr><td>8.0 &amp;micro;m Polycarbonate track-etched membrane filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-300-57</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td><td>Fisher Sci</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td><td>Fisher Sci</td><td>SVHV010RS</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-125-37</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Plastic scintillation bottle</td><td>Fisher Sci</td><td>03-341-72C</td><td></td></tr><tr><td>Clean bucket (10-20 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>6809-6002</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring</td><td>Fisher Sci</td><td>6809-6022</td><td></td></tr><tr><td>10,000x SYBR Gold nucleic acid stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>DAPI solution 25 &amp;micro;g/ml</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Molecular grade water</td><td>sigma aldrich</td><td>W-4502</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Fisher Sci</td><td>BP351-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Sci</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Sci</td><td>G31-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Sci</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Sci</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Delicate task wipe&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Slide station with vacuum pump</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DNA extraction kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.1</td><td>Nucleospin tissue kit</td></tr><tr><td>Proteinase K (20 mg/ml)</td><td>Lifetechnologies</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>200-proof Ethanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15058</td><td></td></tr><tr><td>Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45503-88</td><td></td></tr><tr><td>Cesium chloride (CsCl)</td><td>Fisher Sci</td><td>bp1595-500</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Syringe</td><td>Fisher Sci</td><td>13-6898</td><td></td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m Alumina matrix disposable syringe filter</td><td>Fisher Sci</td><td>O992613</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-swinging bucket rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td>SW41 Ti Rotor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNase I (100 units/&amp;micro;l)</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Sci</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>sigma aldrich</td><td>G-1767</td><td></td></tr><tr><td>1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2473-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Sci</td><td>02674-25</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;g/ml Proteinase K</td><td>Fisher Sci</td><td>BP1700-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Sci</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td><td>sigma aldrich</td><td>p3803</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2618-500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Oak Ridge tube</td><td>Fisher Sci</td><td>05-562-16B</td><td></td></tr></tbody></table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

여기에서 우리는 원격 해양 환경에서 사용되도록 철저히 테스트하고 잘 표준화 연구 프로토콜의 시리즈를 소개합니다. 샘플링 프로토콜은 미생물 군집 (용존 유기 탄소, 입자 성 유기 물질, 무기 영양소)에 이용 가능한 자원의 평가, 직접 바이러스와 미생물 카운트를 통해 바이러스 및 세균 지역 사회의 포괄적 인 설명 (autofluorescent 미생물의 열거를 포함하며, 바이러스 및 미생물 metagenomes의 건설). 우리는 이미 확립 된 프로토콜 및 개발 최신 기술의 일부를 포함하는 과학 분야의 분산 필드를 나타내는 방법의 조합을 사용한다. 바이러스 성 및 세균성 커뮤니티 특성화에 사용되는 특히 metagenomic 시퀀싱 기술은 단지 최근에 설립되고, 따라서 여전히 지속적인 개선을 실시한다. 이것은 샘플링 및 시료 처리 절차 CURREN 다양하게되었다TLY 사용. 여기에 제시된 방법의 세트를 수집하고 환경 시료를 처리하는 최신 방법까지를 제공합니다. 이러한 프로토콜 주소 매개 변수 특성 및 바이러스와 미생물 군집 역학의 기본 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 정보의 최소를 얻을 수 있습니다. 그것은 포괄적 인 설문 조사를 수행하는 지침을 따르 쉽게 제공하고 각 기술에 관련된 중요한 단계 및 잠재적주의 사항에 대해 설명합니다.

현미경 사용 현미경 샘플들은 그들이 원하는 품질의 보장 즉시 분석되어야한다있다. 풍부하고 세균 커뮤니티 크기 분포를 측정하기 위해, DAPI 슬라이드가 표면 형광 현미경으로 검사한다 (도 6A) (여기 / 방출. 461분의 358 nm의 McDole 외 2012 참조). 세포 수 및 치수는 이미징 소프트웨어 (예 ImagePro 또는 ImageJ에)를 사용하여 수집 될 수있다. 모든 셀은 다음의 방정식을 사용하여 반구형 캡과 실린더의 형상을 가질 가정함으로써 유도되는 길이와 폭 측정 셀 볼륨 (V)에서 : V = π / 4 × W 2 (L - / 3 승) L은 길이와 W가 어디 각 셀의 23.4의 폭이다. 미생물 바이오 매스이어서 FO 이전에 설정된 크기 의존 관계를 이용하여 추정 될 수있다R 해양 미생물 군집 (24). 일반적으로 해양 박테리아는 0.1-4 μm의에서 길이 다양하지만, 일부 지역에서는 ~ 8 μm의 최대 이동합니다. DAPI로 염색 필터 (0.2 μm의 참조)은 박테리아가 표시됩니다 동안, SYBR 골드 스테인 (0.02 μm의)에 사용되는 필터는 박테리아와 바이러스를 포함한다. 바이러스 풍부를 측정하는 미생물과 동일한 프로토콜을 따른다 그러나 325-375 nm 인 여기 사용되며 발산 최대 537 nm의 (도 6B)에있다. 정량적 데이터를 생성하기 위해 샘플링 볼륨은 원래 샘플 바이러스 풍부에 따라 조정할 필요가있다. 올바른 볼륨이 가장 좋은 물을 주어 몸 경험적으로 결정되는 필터링합니다. 바이러스의 다양한 농도로 함유하는 샘플을 현미경 사진의 예는도 7에 도시되어있다. 이전의 연구 결과는 미생물에 그 바이러스를 제안비율 (VMR)는 일반적으로 산호초 시스템의 약 6의 평균 (놀즈 게시되지 않은 데이터)와, 수생 시스템 25-29에서 1-50 범위와의 사이에 3, 20. 유동 세포 계측법 직접 카운트 및 미생물 군집의 크기 추정 이외에, 유동 세포 계측법을 통해 종속 영양 세균에 독립 영양의 비의 평가는 상기 수집 된 샘플로부터 (도 8에 주어진 출력 계측법 예시 흐름)를 추출 할 수있다. 전체 박테리아 세포의 수를 결정하기 위해, 샘플은 SYBR 그린 I 염색되고 30분의 530 대역 통과 필터와 광전자 증 배관은 검출을 위해 사용된다. 엽록소 및 phycoerytherin (42분의 585 대역 통과 필터) (다시 675-735 nm의 범위의 결과로 다시 LP 거울에) 채널은 흠 샘플에서 독립 영양 생물의 풍부를 계산하는 데 사용됩니다. 종속 영양 미생물의 풍부, 비에서 독립 영양 수를 확인하려면스테인드 부분은 다음 SYBR 염색 총 수 (McDole 등. 제출)에서 차감된다. 바이러스 성 메타 지노믹스 바이러스 메타 지노믹스 커뮤니티 구조와 기능을 결정하기 위해 전체 게놈 서열 정보를 이용하여, 바이러스의 생태 배양 독립적 분자 접근법을 이용한다. 메타 지노믹스는 글로벌 스케일 (30)에 복잡성과 지방 17에서 바이러스 성 지역 사회의 다양성에 대한 우리의 이해를 증진하고있다. 바이러스 성 metagenomic 데이터의 분석을위한 생물 정보학 도구의 광범위한 배열의 최근 발전은 메타 지노믹스의 렌즈를 통해보다 포괄적 인 뷰 virosphere의 허용, 전산 병목 현상을 감소했다. 여기에 제시된 방법은, 농도를 파편 및 세포 물질을 제거하기 위해 메쉬 큰 기공 크기 나일론 예비 여과의 조합을 이용하여 해수로부터 분리 및 바이러스 입자의 농축을 강조TFF (그림 3)과 이후의 0.45 μm의 여과 시료는 큰 세포를 제거합니다. 이 방법은 대략 우리가 작은 볼륨에서 다운 스트림 프로세스를 수행 할 수있는 100 배 농축 된 샘플 (그림 5B-5E)을 생산하고 있습니다. 바이러스 성 용 해물에 남아있는 미생물 세포의 성장을 방지하고, 따라서 필드 스테이션 및 실험실 사이의 긴 전송 시간 동안 샘플의 바이러스 풍부하게 변경하기 위하여, 클로로포름 종종 수납 2 %의 최종 농도로 첨가된다. 단리 및 정제의 VLP를 따라, 예컨대 금 등의 SYBR 핵산 염료 표면 형광 현미경은 바이러스 입자의 존재 및 순도 (도 5B-5E)을 확인하는 데 사용된다. 여기에, 우리는 남부 라인 섬 산호초에서 두 바이러스 성 metagenomes을 제시, 구체적으로는 스타 벅스 (Star7)과 밀레니엄 (CAR9, 이전 캐롤라인라고도 함) 섬. 120 L 샘의 총 부피섹션 3.7 및 5.2에 설명 된대로 PLE 물 10 미터의 깊이에서 각 사이트에서 수집 및 처리되었습니다. 제 4 (도 5b)에 기재된 방법에 따라 확인 된 바와 같이 염화 세슘 구배 원심 분리로 정제 한 VLPs를는 CAR9 (도 5d) 3.3 × 10 8 입자 / ㎖ 및 Star7 대 1 ㎖ 당 2.9 × 109 입자를 사용했다. 이들 샘플로부터 분리 된 DNA의 총량은 약 400 Nanodrop 측정에 기초 NG였다. DNA는 시퀀스 데이터의 특성은 표 1에 제시되어있다. 기존 데이터베이스를 이용하여 유사성 검색 기준 Phi29 폴리머 라 아제를 사용하여 증폭되고, 2011 년 환경 유전체학 핵심 기능에 의해 서열화하고, 서열의 대부분 (&gt; 70 %)는 종종 끝내 지지 않은, 즉, 알 수없는 기원과 기능. 유사하게, 여기에 제시된 두 viromes 알려지지 않은 서열의 97 % 이상을 제시했다. 그 결과, 비 데이터베이스따라 분석은 분석에 사용 (바이러스 성 메타 지노믹스에서 &quot;암흑 물질&quot;에 대한 연구 기회의 새로운 팔을 연 Seguritan 등. 언론). 미생물 메타 지노믹스 미생물 metagenomes의 분석은 미생물 군집 존재의 특성과 이러한 지역 사회의 기능을 설명 할 수 있습니다. 예 macrobial 사회 구조의 변화 또는 사용 가능한 영양분과 종의 풍부하고 그들의 주된 대사 경로 (; 켈리 등 알 2014. 그림 9) 사이에 병원균 및 독성 5,22 또는 비교의 존재의 추정을 포함한다. 물 화학 화학 물 파라미터는 일반적으로 원하는 데이터를 생성하기 위해 광범위한 분석 처리를 수행; DOC 분석을위한 시료는 고온 산화 촉매 31,3 통해 측정 될2, 흐름 주입 분석 36,12,37 의한 원소 분석기 33-35 및 무기 양분 결합 동위 원소 비율 질량 분석을 통해 입자상 유기물 (POM). 모든 분석을 성공적으로 완료 한 후, 표 1에 나타내는 정보는 미생물 및 바이러스 사회의 특성을 보완하는 데 이용할 수있을 것이다. 이 정보는 유기 탄소와 질소 샘플의 안정 동위 원소 비율 칭찬 할 수 있고 독립 영양 생물과 종속 영양 미생물 사이의 비율 (McDole 등. 제출) (하스 등. 35 참조). <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> 프로토콜 절에서 설명하는 방법 그림 1. 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>다시. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> 그림 2. 샘플 처리 장비 설치. 여기에서 소개 여과 설정은 (개략도는, 실제 사진 오른쪽 패널 왼쪽) 반드시 샘플을 생성하는 데 필요하지 않지만 상당히 과정을 촉진합니다. 설정 (1) 하타 Niskin 채 장치가 탑재되는 백 플레이트로 구성되어 있습니다. 아래로 향 배출구에서 하타 Niskin 채 단위는 인라인 필터 홀더 (2)에 실리콘 튜브로 연결된다. 다음은 HDPE 샘플링 유리 병에 각각의 필터를 통해 샘플링 된 물 패스 (3) 바로 아래에 장착 할 수 있습니다. 여과 공정은 압력 게이지 (5)에 의해 조정 및 가압 공기 (4)를 통해 가속된다. 오버 플로우 분지는 HDPE 유리 병 또는 POM 여과의 변화 동안 물을 흘리고 방지 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">하시기 바랍니다</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> . 나일론 (터버 외. (19)로부터 변형)도 3 접선 흐름 필터 라인업 여과 메쉬 샘플 물 접선 흐름 필터에 연동 펌프 (2)를 통하여 리저버 (1)로부터 펌핑된다 (3). 역압이없는 복귀 라인 (4)을 따라 저장조 (1) ~ 시료 물 복귀한다. 배압이 복귀 라인에 호스 클램프 (5)를 통해인가되는 경우, 물이 필터를 통과하여 폐기되거나 여액 저장조 (6)에 전달된다. 모든 샘플 물이 튜브 라인에 집중되어 때까지 여과 라인을 집중으로 샘플 물이 대체됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> 그림 4. 현미경 슬라이드 여과 설정.균등 각 알루미나 매트릭스 필터 DAPI 및 SYBR 골드 염색 시료를 분배하기 (1), 필터 클램프 (4)로 여과 매니 폴드의 필터 탑 (2)와 스템 사이에 배치하고 고정 할 필요가있다. 압력 조절 진공 (5) 여과 과정 (개략도 탑, 실제 사진 하단 패널)을 촉진 할 것이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> 도 5. 정제 및 파지 입자의 농도. 각 염화 세슘 밀도 구배 1 ㎖의 총 전처리 된 샘플 (A)를 이끄는 전에 서로의 상단에 적층된다. 각 층은 초 원심 분리 후 추출을 용이하게하기 위해 튜브의 외부 표시되어야한다. 튜브 EX에 피어싱됩니다 빨간색 화살표 표시VLP 분획 TRACT. Star7 (B) 및 CAR9 (D)의 0.45 μm의 필터 대표적인 바이러스 성 집중의 표면 형광 현미경 : 바이러스 농축의 현미경 사진 (BE). 단지 VLP를 (흰색 화살표) 염화 세슘 구배 초 원심 분리 후 남아있는 반면, 박테리아 세포를 포함한 대형 입자 Star7 (B) 및 CAR9 (D) 샘플 모두로부터 0.45 μm의 여액에서 볼 수 있었다; 스타 7 (C)과 CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> 도 (A) 및 DAPI (B) SYBR 골드 염색 슬라이드 예의 분석 DAPI와 SYBR 골드 현미경 분석. 6. 스크린의 예. (A) 길이와 모든의 폭 (μm의)는 입자를 강조(= 미생물)는 촬상 프로그램의 도움으로 평가 될 수있다. 이미지의 중심에 응집을 참고. 이러한 클러스터는 분석 중에 바이러스 (B). 후속 분석에서 제외 될 필요가 세균은 VLP 및 세포 크기 범위 (적색 VLP, 셀룰러 녹색)로 크기가 임계 비닝 될 필요가있다. 일반적으로 각각의 영상 프로그램에 의해 분류되지 않은 일부 희미한 VLP를가합니다. 같은 희미한 흰색 도트 나타나는 이러한 VLP를 수동으로 계산하고 자동화 된 바이러스 개수에 추가해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> 도 SYBR 금의 농도 7. 염색 표본. SYBR 염색 바이러스 샘플의 다양한 숫자를 포함 0.02 알루미나 매트릭스 필터의 현미경 사진. 패널은 AF를 보여줍니다B에 표시된 필터의 농도가 신뢰할 수가 너무 낮은 너무 높은 C에있는 반면 ilter는, 여과 해수의 적절한 금액을 포함. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> 그림 암초 물 시료의 분석 출력 유동 세포 계측법의 8 결과. 패널 (A)는 본 악기 설정으로 최소한의 배경을 확인하는 데 사용되는 노란색 - 녹색 형광 마이크로 스피어 (0.75 μm의)와 분자 수준의 물을 보여줍니다. 패널 (B)는 비드가 여전히 독립 영양 생물의 여러 집단과 함께 동일한 위치에서 볼 수 있음 A. 주에서와 동일한 설정과 레이아웃 암초 물 샘플 실행의 출력을 도시한다. (C) </stronG&gt; 백 게이트에 흐름을 세포 계수기, SYBR 긍정적 인 이벤트 (독립 영양 + 영양 카운트)을 최소화 배경을 대상으로 사용되는 (B)과 동일한 샘플. (D) SYBR 녹색 I. 사용으로 염색 대표 암초 물 샘플 (C)에 설립 게이팅, 총 미생물 수가가 생성되었고, 엽록소 형광도에 의해 분할 종속과 독립 영양 미생물. (McDole 등. 4 참조) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> 그림 미생물 metagenome 데이터의 9 예. 미생물 metagenomic 시퀀스 데이터 및 사이트 종속 변수 사이의 패턴. Synechococcus의 다음 상대 풍부 </eM&gt; SPP. 긍정적으로 Pelagibacter 종 반면, 산호의 비율이 커버의 상관 관계를 보였다. (패널 왼쪽)되지 않았습니다. DNA의 수리를 위해 대사 경로가 모든 metagenomes (오른쪽 패널) 사이의 일치 동안 공역 전송을위한 대사 경로가 긍정적으로, 질산염 농도와의 상관 관계를 보였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 스타 7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> 총 수의 읽 </td><td> 939311 </td><td> 591600 </td></tr><tr><td> 전처리 수 읽고 </td><td> 579664 </td><td> 360246 </td></tr><tr><td> 시퀀스의 길이를 평균 (BP) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> 주석 시퀀스 (%) </td><td> 42,218 (7.3 %) </td&gt; <td> 9117 (2.5 %) </td></tr><tr><td> 알 수 (%) </td><td> 537,446 (92.7 %) </td><td> 351,129 (97.5 %) </td></tr></tbody></table> 남부 라인 제도, 스타 벅스와 밀레니엄에서 생성 된 두 viromes 표 1. 데이터 특성. 주석의 정도는 MG-RAST 서버를 사용 BLAT을 기반으로합니다. <img alt="표 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> 한 탐험하는 동안 여러 사이트에서 데이터를 보여주는 표 2. 대표 결과. 여기에 평가 매개 변수는 미생물 및 바이러스 중 농도와 결합 물 화학 측정을 포함한다. 표는 추가로 각각의 샘플링 위치에 대한 각각의 metagenomic 데이터를 참조 파일 이름을 포함합니다. 탄소 및 무기 양분 농도는 μmol / L에 제시되어있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">하십시오</a>이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

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Research

JoVE Journal

Environment

25.5K 조회수.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

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A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be subsampled throughout the experiment1&#8211;7. Subsampling of large volumes can be problematic for several reasons: 1) it causes variation in the total volume and the surface area:volume ratio of the culture during the experiment; 2) pseudo-replication (i.e., replicate samples from the same treatment flask8) is often employed rather than true replicates (i.e., sampling from replicate treatments); 3) the duration of the experiment is limited by the total volume; and 4) axenic cultures or the usual bacterial microbiota are difficult to maintain during long-term experiments as contamination commonly occurs during subsampling.
The use of microtiter plates enables 1 ml culture volumes to be used for each replicate, with up to 48 separate treatments within a 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plate, thereby decreasing the experimental volume and allowing for extensive replication without subsampling any treatment. Additionally, this technique can be modified to fit a variety of experimental formats including: bacterial-algal co-cultures, algal physiology tests, and toxin screening9&#8211;11. Individual wells with an alga, bacterium and/or co-cultures can be sampled for numerous laboratory procedures including, but not limited to: WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry, microscopy, bacterial colony forming unit (cfu) counts and flow cytometry. The combination of the microtiter plate format and WATER-PAM fluorometry allows for multiple rapid measurements of photochemical yield and other photochemical parameters with low variability between samples, high reproducibility and avoids the many pitfalls of subsampling a carboy or conical flask over the course of an experiment.

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

작은 볼륨 생물 검정은 물 - 펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정을 사용하여 세균 / 식물 플랑크톤의 공동 문화를 평가하는

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

연구

환경과학

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

마이크로 스케일 영양소 레이어에 해양 미생물의 Chemotactic 응답

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

생물학

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, 개선 INEX 방법에 대한<em&gt; 현장에서</em&gt; 미립자의 측정 및 용존 화합물은 액티브 서스펜션 피더에 의해 처리

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal behavior questions. The protocol described here provides a simple, reproducible, and controlled method to manipulate DO to study behavioral response in aquatic organisms resulting from hypoxic and anoxic conditions. While performing degasification of water with nitrogen is commonly used in laboratory settings, no explicit method for ecological (aquatic) application exists in the literature, and this protocol is the first to describe a protocol to degasify water to observe organismal response. This technique and protocol were developed for direct application for aquatic macroinvertebrates; however, small fish, amphibians, and other aquatic vertebrates could be easily substituted. It allows for easy manipulation of DO levels ranging from 2 mg/L to 11 mg/L with stability for up to a 5 min animal-observation period. Beyond a 5 min observation period water temperatures began to rise, and at 10 min DO levels became too unstable to maintain. The protocol is scalable to the study organism, reproducible, and reliable, allowing for rapid implementation into introductory teaching labs and high-level research applications. The expected results of this technique should relate dissolved oxygen changes to behavioral responses of organisms.

This article describes a simple and reproducible protocol to manipulate dissolved oxygen conditions in a laboratory setting for animal behavior studies. This protocol may be used in both teaching and research laboratory settings to evaluate organismal response of macroinvertebrates, fishes, or amphibians to changes in dissolved oxygen concentration.

간단한 접근 방식은 동물 행동 관찰을위한 용존 산소를 조작하는

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

해양 박테리아와 생태 독성 학적 방법<em&gt; 비브리오 앵 귈라 룸</em&gt; 환경 오염 물질의 급성 독성 평가

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses. For today's demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. An A-frame derrick, with a multi-purpose winch and cable system, is used in combination with Niskin or Go-Flo water sampling bottles. Conductivity, Temperature, and Depth (CTD) sensors are also used to sample the underlying water mass. To minimize outgassing, trace gas samples are collected first.  Then, nutrients, water chemistry, and cell counts are determined. Finally, waters are collected for biomass filtration. The set-up and collection time for a single cast is ~1.5 hours at a maximum depth of 215 meters. Therefore, a total of 6 hours is generally needed to complete the collection series described here.

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses.

해수 샘플링 및 수집

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

대량 연안 해수 샘플 (20L +) 여과

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column. The protocol is an extension of the large volume sampling protocol described earlier, with one major difference: here, there is no pre-filtration step, so all size classes of biomass are collected down to the 0.22 &mu;m filter cut-off. Samples collected this way are ideal for nucleic acid analysis. The set-up, filtration, and clean-up steps each take about 20-30 minutes. If using two peristaltic pumps simultaneously, up to 8 samples may be filtered at the same time. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use.

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column.

연안 해수 샘플을 소량 (1 - 3L)은 여과

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

A Practical and Low-Cost Setup to Measure Methane in Aqueous Samples

Measuring Dissolved Methane in Aquatic Ecosystems Using An Optical Spectroscopy Gas Analyzer

Measuring greenhouse gas (GHG) fluxes and pools in ecosystems are becoming increasingly common in ecological studies due to their relevance to climate change. With it, the need for analytical platforms adaptable to measuring different pools and fluxes within research groups also grows. This study aims to develop a procedure to use portable optical spectroscopy-based gas analyzers, originally designed and marketed for gas flux measurements, to measure GHG concentrations in aqueous samples. The protocol involves the traditional headspace equilibration technique followed by the injection of a headspace gas subsample into a chamber connected through a closed loop to the inlet and outlet ports of the gas analyzer. The chamber is fabricated from a generic mason jar and simple laboratory supplies, and it is an ideal solution for samples that may require pre-injection dilution. Methane concentrations measured with the chamber are tightly correlated (r2 &#62; 0.98) with concentrations determined separately through gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID) on subsamples from the same vials. The procedure is particularly relevant for field studies in remote areas where chromatography equipment and supplies are not readily available, offering a practical, cheaper, and more efficient solution for measuring methane and other dissolved greenhouse gas concentrations in aquatic systems.

This study demonstrates an approach to measure methane gas concentrations in aqueous samples using portable optical analyzers coupled to an injection chamber in a closed loop. The results are similar to conventional gas chromatography, presenting a practical and low-cost alternative particularly suitable for remote field studies.

Measuring greenhouse gas (GHG) fluxes and pools in ecosystems are becoming increasingly common in ecological studies due to their relevance to climate ...

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate immunity. During the early stages of the immune response, hemocytes actively migrate to the site of infection. This inherent motility is a fundamental characteristic of these cells. It represents a key cellular function that integrates multiple processes, such as cell adhesion, cell signaling, cytoskeletal dynamics, and changes in cell volume. Therefore, alterations in cell motility following exposure to drugs or pollutants can serve as a useful toxicological endpoint. Despite the fundamental role of cell motility in cellular physiology, it has been poorly investigated from a toxicological perspective. This work proposes a novel in vitro method for the rapid and sensitive assessment of the toxicity and ecotoxicity of pollutants, based on evaluating the hemocyte motility of Mytilus galloprovincialis. We developed a cell motility assay on hemocytes adhering to the bottom of a 96-well polystyrene microplate. Following exposure to increasing concentrations of drugs, cell trajectories, and velocities were quantified by cell tracking under time-lapse microscopy, allowing us to measure the effects on hemocyte motility. Due to the ease of hemocyte collection from the animals in a relatively non-invasive manner, the proposed method offers an alternative test for screening the effects and mechanisms of action of pollutants and drugs. It aligns with the 3Rs (Replacement, Reduction, and Refinement) criteria, addressing ethical concerns and contributing to the reduction of vertebrate in vivo animal testing.

The article proposes a novel in vitro method for the rapid and sensitive assessment of the toxicity and ecotoxicity of pollutants, based on the motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes. The method aims to contribute to the development of more ethical and sensitive toxicological and ecotoxicological exposure tests.

홍합(Mytilus galloprovincialis) 혈구 운동성을 기반으로 한 독성 및 생태 독성 분석

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate ...

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

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