우리는 매우 원고를 읽기 위해 박사 랜디 Chitwood 감사드립니다. 이 작품은 관청 재단과 HJK 할 수있는 알프레드 P. 슬로안 재단 보조금에 의해 지원되었다.

1. 광 설치 (그림 1) <ol><li> 두 광자 여기 들어 femtosecond 펄스와 적외선 펄스 레이저 시스템이 사용됩니다. 높은 레이저 출력 전력은 (&gt; 2W 890 nm의 파장에서 경우에 따라) 시스템의 광학 구성 요소가 도입 된 대형 손실을 상쇄하기 위해 필요합니다. </li><li> 이 프리즘으로 구성된 prechirper 시스템은 AODs 1 소개 시간적 분산을 보상하기 전에 음향 광학 편 향기 (AODs)에 레이저 펄스에 부정적인 그룹 속도 분산 (GVD)를 부여. </li><li> 큰 구멍이 두 개 AODs (NA 0.8과 40x 물 침지 목표를위한 10mm)는 2 차원 레이저 빔을 편향. </li><li> 100 숲 / mm와 반사 회절 격자는 짧은 레이저 펄스를 사용하는 경우 AODs 뒤 13cm가 AODs에 의해 도입 된 공간 분산을 보상하기 위해 배치됩니다. </li><li> 레이저 빔이 수직 microsco의 카메라 포트에 두 릴레이 윤곽을 지향하는PE. </li><li> 창포는 광학 부품의 정렬을 위해 정기적으로 게재됩니다. </li><li> 목표 앞의 이색 beamsplitter는 표본에 적외선 여기 빛을 전송하고 검출기로 시료의 형광 빛을 반영합니다. </li><li> 에피네프린과 transfluorescence 감지기 (photomultipliers, PMTs)는 객관적으로 형광 신호를 수집하고 - 해당되는 경우 - 콘덴서를 통해. </li><li> 컬러 유리 필터 (BG-39, 3~5mm)은 감지기에 도달 여기 빛을 방지하기 위해 검출기 앞에 위치하게된다. </li><li> AOD 편향 각도는 결과적으로 전압 제어 발진기를 구동 디지털 - 아날로그 컨버터 보드 (156.25 kHz에서 클럭 속도),가 장착 된 컴퓨터에 의해 제어됩니다. </li><li> photomultipliers에서 신호에 저장되기 전에 로우 패스 버터 필터 (100 kHz에서의 컷 - 오프 주파수)를 통해 릴레이와 아날로그 디지털 컨버터 (156.25 kHz에서 클럭 속도)에 의해 디지털화되어분석을 위해 컴퓨터. </li><li> 정렬 및 전기 노이즈뿐만 아니라 함께하고 표시없이 photomultipliers 낮은과 높은 게인에서 레이저 빛과없는 형광 신호의 분포를 기록하여 테스트됩니다. 스캐너가 올바르게 설정과 높은 게인에서와 표시기과 형광 신호의 분포의 폭이 형광 신호의 다른 배포판 (그림 2)의 폭보다 훨씬 큰 경우 차폐되어 있습니다. </li></ol> 2. 실험 절차 <ol><li> 디더링 랜덤 액세스 검색 칼슘이 세포 증가의 감지에 의존하고 있습니다. 뉴런의 큰 숫자는 신경 조직을 5로 칼슘 표시기의 에스테르 양식 (예를 들어, 오레곤 그린 488 Bapta-1 AM)의 bolus 주사를 사용하는 물들 일 수 있습니다. </li><li> 각 뉴런 소마의 여러​​ 위치는 ( &quot;디더링&quot;, 4 위치, 각 위치에 대한 6.4 μs 전자에 = 25.6 μs 녹음 시간, 짧은 시간 동안 각각 기록됩니다각주기에서 ACH 신경, 그림. 3C). 관심 뉴런을 선택하려면 256x256 픽셀로 구성된 풀 프레임 (그림 3A) 획득됩니다. 기록 할 각 뉴런 소마의 중심이 이미지에서 수동으로 선택됩니다. 제어 소프트웨어가 자동으로이 센터 주변 2 μm 거리에서 세 가지 문제점을 추가합니다. </li><li> 각 사이클에서 형광 신호가 40 뉴런 (그림 3B)의 각에서 기록됩니다. 이 과정은 한 기록 (오초 녹음이 = 3,255 사이클, 1 사이클 = 1.536 밀리 초)의 전체 기간 동안 반복됩니다. </li></ol> 3. 스파이크 감지 효율성을 극대화하는 온라인 소프트웨어 도구 <ol><li> 형광 체세포의 칼슘 신호의 스파이크 감지 체세포 형광 칼슘 신호의 높은 신호 대 잡음 (S / N) 비율에 의존하고 있습니다. S / N 고는 여기 강도를 높임으로써 달성 될 수있다. 여기 강도 그러나, 단 한 photodamage의 특정 제한으로 증가 할 수 있습니다. 스파이크 감지는 매우 작은 windo 내에서 높은형광 신호가 높은 S / N하지만이 여기 농도의 w 만있는 매우 작은 photodamage 3을 관찰하고 있습니다. 기록 된 신호는 우리가 광자 속도 (방정식 3.2 참조) 및 온라인 분석을 사용하여 기본 형광의 감소를 모니터링 녹음하는 동안 높은 스파이크 감지의 창 내에되도록하기 위해. </li><li> 뉴런 당 대략 광자 요금은 기준 노이즈의 짧은 시간 창 (100-200 MS)에서 계산됩니다. 광자의 수 (N λ)와 광자 속도 (λ = N λ / Δt)이 다음과 같은 식으로 상대 형광 변화의 분포를 (σ) 맞는하여 형광 값에서 계산됩니다 : </li></ol><img alt="수식 1" src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" /> 이 방정식은 상대적으로 형광 변화에 변수의 변화와 광자 샷 노이즈에 대한 푸 아송 분포를 나타냅니다 : ΔF / F = (G * N λ (t)-G * N &amp; 램BDA,, 0) / G * N λ, G는 광전자 증의 누적 이득과 다른 모든 전자 부품을 나타냅니다 0. 광자 샷 소음과 더불어 소음의 다른 소스 (운동 유물)가 있기 때문에이 수식이 제대로 생체 녹음에 대한 감지 광자의 수를 확인하지 않습니다. 그럼에도 불구하고이 방정식은 소음을 추정하기 위해 생체 녹음에 유용합니다. <ol start="3"><li> 기본 형광은 같은 시간 창에서 계산 시간이나 시험의 함수로 도시된다. 기준의 평균 감소가이 제한을 초과 할 때 스파이크 검색이 빠르게 거부하기 때문에 레이저 파워를 조정하여 0.0002 / s의 아래 보관됩니다. </li><li> 뉴런의 somata 위치마다 10-20 분 다시 전체 프레임 이미지를 획득하여 확인합니다. 필요한 경우, 녹음 위치는 조정됩니다. 위치는 한 번에, 또는 개별 뉴런의 모든 뉴런에 조정할 수 있습니다. </li></ol> 4. ReconstructioN 형광 신호 (deconvolution)에서 스파이크 타이밍의 <ol><li> 칼슘 과도의 부패가 길어서 시간에 자주 summate 신경 활동에서 발생하는 형광 신호 (수백 밀리 초). deconvolution 방법은 형광 신호의 스파이크와 스파이크 타이밍을 reconstructs. </li><li> 기록 된 형광 신호를 근간 가능성이 가장 높은 스파이크 열차를 확인하려면 다른 모델 비교됩니다. 여기 우리는 모델을 결정하기 위해 유전자 알고리즘을 사용 - 그리고 스파이크 열차와 스파이크 타이밍 때문에 - 최대 가능성이 있습니다. </li><li> 뉴런의 inhomogeneous 인구에서 스파이크-evoked 칼슘 신호는 뉴런 사이에 다를 수 있습니다. 데이터의 혼자 가잖 분석 설정을 위해이 계정으로 뉴런에서 뉴런의 스파이크-evoked 칼슘 신호의 변화를 소요하는 알고리즘을 설계했습니다. </li><li> 거짓 긍정적 인 탐지 많은 수의를 피하려면이 m의 상수를 허용 진폭 및 붕괴 시간을 수축하는 데 유용합니다스파이크 - evoked 칼슘 신호의 odel. 단일 스파이크 evoked 칼슘 과도의 상수 진폭 및 부패 시간의 공동 분배 동시 electrophysiological 및 광학 녹음을 사용하여 동일한 실험 조건에서 뉴런의 같은 종류의 실험 별도의 세트에 기록됩니다. </li><li> 느린 기준 변경에 대한 설명과 deconvolving의 전산 비용을 절감하기 위해 더 이상 녹음 1~5초의 여러 짧은 흔적으로 나누어집니다. </li><li> 각 뉴런 각 녹화를 들어, deconvolution 알고리즘은 모델의 큰 번호 (최대 1,000,000 다른 모델 이상) 테스트 할 수 있습니다. deconvolution의 속도를 높이기 위해 하나의 실험은 병렬 10 개 컴퓨터에에 deconvolved 있습니다. </li><li> deconvolution 후, 스파이크 데이터 분석 검사합니다. 아름다운 요정 - 자극 시간 히스토그램, 스파이크 확률, 그리고 발사 속도는 (뉴런 당 평균 스파이크) 자동화 된 방식으로 계산됩니다. </li></ol> 5.대표 결과 기록 된 형광 체세포의 칼슘 신호의 높은 신호 대 노이즈 비에 성공 스파이크 감지 한겁니다. 단순히 높은 여기 속도 (높은 레이저 전원)를 사용하여 생물학적 물질 (photodamage)에 photoeffects의 부정적인 영향이 발생할 수 있습니다. 디더링 랜덤 액세스 스캐닝 photodamage에서 기준 형광의 감소로 명부와 스파이크-evoked 칼슘 형광 신호의 감소. 스파이크 - evoked 신호의 감소가 빠르게 스파이크를 감지 할 수있는 오류가 발생할 수 있습니다. 형광 신호의 스파이크 감지가 높은 여기 강도 만 매우 작은 창이 있습니다. 높은 끝에이 창은 낮은 끝에있는 형광 신호가 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지고 photodamage에 의해 제한됩니다. 급성 조각의 대뇌 피질의 뉴런에 우리는 슬라이스 표면 아래 약 100 μm에서 녹음 할 때 400,000-1,500,000에 대한 광자 / s의 광자 속도의 결과로 레이저 전원을 사용합니다. 높은을 사용하는 경우화성 표시기는 - 여기 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 -이 신호는 개별 스파이크를 감지하기에 충분한 것입니다. 그림. 3E는 매우 낮은 여기 속도, 검색 창에서 녹화 중 하나를 예를 들어, 매우 높은 여기 속도로 하나를 기록 형광 신호의 예를 보여줍니다. 단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 신경 활동을 기록하기 위해 다른 기술에 비해 랜덤 액세스 검색이 동일한 지역 인구의 뉴런의 큰 숫자에서 기록 할 수 디더링 및 tetrode / multielectrode 녹음에 비해 예를 들어, 이하 침입입니다 . 따라서 디더링 랜덤 액세스 검사는 suprathreshold 활동 6 (그림 4A), 뉴런 (대뇌 피질의 소성)의 인구의 신경 활동의 변화에 의해 신호를 상호 정보를 측정하는 여러 뉴런의 신경 활동을 기록하고, suprathreshold 활동 전파하는 데 사용할 수 있습니다 뉴런 14 인구 (그림 4B)를 통해 <img<html> ALT = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1. 디더링 - 랜덤 액세스 검사 설정의 광학 설계. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" /> 그림 2 정렬 및 테스트 :. 다른 상황에서 기록 된 형광 신호를 분배. A) 높은 PMT 증가,하지만 레이저 광에서 레이저 광과 낮은 광전자 증 증가, B) 아니오, 배포 때문에 광전자 증 어두운 전류의 넓은 없습니다. C)에서 레이저로 높은 PMT 증가로 기록. B에 표시의 배포판이 배포 사이의 차이는 여기 빛이 PMT 검출기에 도달 나타냅니다. D) 형광 신호의 분포는 신경 somata에서 높은 게인에서 기록했다. 다른 잡음 소스가 기여하지 않으면,이 분포 샷 노이즈 광자에서만 발생합니다. . JPG &quot;/&gt; 그림 3 디더링 원칙 중 하나 사이클의 신경 세포의 somata 위치를 검색하고 선택 A) 전체 프레임 형광 이미지, B) 스캔 경로, C)이 그림,. 각 소마 (원) 여러 장소에서는 다음에 빔을 이동하기 전에 기록됩니다 두 D / A 채널의 출력 소마, D) 그림. 각 뉴런 소마를 들어, 형광 신호는 각 소마의 4 가지 명소 (S1-S4)에서 기록됩니다. 각 지점의 위치는 그 x와 y 위치에 의해 주어진다. x와 모든 장소와 모든 뉴런에 Y 위치는 순차적 방식으로 디지털 - 아날로그 변환기로 전송됩니다. 빔은 두 뉴런의 somata 사이에 이동하는 동안 신호가 (빈) 취득하지 않습니다. E 형광 신호의) 예. 각 예제는합니다 (electrophysiological 셀 - 첨부 된 기록으로 측정) 한 스파이크에 대한 응답을 보여줍니다합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" /> 그림 4. corti 유학칼 기능은 디더링 랜덤 액세스 검색을 사용합니다. A) 뉴런의 인구에 의해 신호를 상호 정보를 측정. 위의 이미지는 급성 뇌 조각과 레이어 4 (L4)에서 동일한 대뇌 피질의 열에서 배치 두 자극의 피펫의 현미경 사진을 보여줍니다. 센터 그래프는 자극의 각 반복에 대해 신경 반응을 보여줍니다. 낮은 그래프는 뉴런의 기록 인구에 의해 신호 섀넌의 상호 정보를 보여줍니다. 대뇌 피질의 뉴런의 인구 사이 suprathreshold 솟고 활동의 B) 측정 전파 (신호 전파). 상단 그래프는 실험 디자인을 보여줍니다, 중심 이미지는 형광 이미지를 보여줍니다, 점선은 배럴 국경을 나타냅니다, 낮은 그래프 thalamocortical 섬유 (삼각형)의 전기 자극에 대한 응답으로 검색 스파이크를 보여줍니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

디더링 랜덤 액세스 검사는 간접적으로 신경 세포의 somata의 각 스파이크와 관련된 세포 체세포 칼슘의 증가에서 suprathreshold 솟고 활동을 감지합니다. 세포 내 칼슘의 증가는 형광 칼슘 염료에 의해 감지됩니다. 디더링 랜덤 액세스 검색의 한계는 칼슘 형광 신호의 제한된 신호 대 잡음 비율에서 크게 발생한다. 신호 대 잡음 비율이 높은 여기 요금을 사용하실 수 없습니다 photodamage에 의해 제한 차...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 광학 구성 요소는 레이저부터, 순서대로 나열되어 있습니다 </td></tr><tr><td> 타이탄 : 사파이어 레이저 </td><td> 일관된 주식회사 </td><td> 카멜레온 울트라 2 </td><td> 높은 전력 출력을 권장 (900 나노 미터에서&gt; 2W) </td></tr><tr><td> 비 염색성의 렌즈 F = 30mm </td><td> 토르 실험실 </td><td> AC254-030-B </td><td> 650-1050 nm의에 대한 반사 방지 (AR) 코팅 </td></tr><tr><td> 비 염색성의 렌즈 F = 100mm </td><td> 토르 실험실 </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm의 </td></tr><tr><td> 렌즈 F = 75mm </td><td> 토르 실험실 </td><td> LA1608-B </td><td> AR 650-1050 nm의 </td></tr><tr><td> 렌즈 F = 175mm</td><td> 토르 실험실 </td><td> LA1229-B </td><td> AR 650-1050 nm의 </td></tr><tr><td> 비 염색성의 렌즈 F = 300mm </td><td> 토르 실험실 </td><td> AC254-300-B </td><td> AR 650-1050 nm의 </td></tr><tr><td> 비 염색성의 렌즈 F = 100mm </td><td> 토르 실험실 </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm의 </td></tr><tr><td> 비 염색성의 렌즈 F = 100mm </td><td> 토르 실험실 </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm의 </td></tr><tr><td> 음향 광학 편 향기 </td><td> Intraaction 사 </td><td> ATD 6510CD2 </td><td></td></tr><tr><td> 반사 회절 격자 </td><td> 뉴 포트 (Newport) </td><td> 53-011R </td><td> 65 MHz의 대역폭 45 mrad의 스캔 각도 AODs 100 홈 / mm </td></tr><tr><td> 21.6 mm Brewster 프리즘 </td><td> 람다 리서치 옵틱스 주식회사 </td><td> IBP21.6SF10 </td><td></td></tr><tr><td> 컬러 유리 </td><td> SCHOTT </td&gt; <td> BG-39 </td><td></td></tr><tr><td> 이색 성 거울 </td><td> 크로마 기술 주식회사 </td><td> Z532RDC </td><td></td></tr><tr><td> 광전자 증 모듈 </td><td> 하마 마츠 </td><td> H9305-03 </td><td></td></tr><tr><td> DAC-ADC 보드 </td><td> 내쇼날 인스트루먼트 </td><td> PCI-6115 </td><td></td></tr><tr><td> 오레곤 그린 488 Bapta - 오전 1시 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6807 </td><td></td></tr></tbody></table>

optical recording of suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution

척추 중추 신경계의 정보 신호는 종종 뉴런이 아닌 개별 뉴런의 인구에 의해 수행됩니다. 또한 suprathreshold의 난리 활동의 전파는 뉴런의 인구를 포함합니다. 대뇌 피질의 기능을 해결 경험적 연구는 직접 따라서 고해상도로 뉴런의 인구에서 녹음이 필요합니다. 여기 광학 방법 및 최대 단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 100 뉴런에서까지 신경 활동을 기록 할 수있는 deconvolution 알고리즘을 설명합니다. 이 방법은 대뇌 피질의 뉴런의 suprathreshold 전기 스파이크 (활동 전위)와 관련된 세포 체세포의 칼슘 농도의 일시적 증가 감지에 의존하고 있습니다. 광학 녹음의 높은 시간적 해상도는 음향 광학 편 향기 (AODs) 1을 사용하여 빠른 랜덤 액세스 스캐닝 기술에 의해 달성된다. 불투명 뇌 소유의 높은 공간 해상도의 칼슘에 민감한 염료 결과의 2 광자 여기2 고소 해요. 형광 칼슘 녹음에서 스파이크의 재건은 최고 가능성 방법에 의해 달성된다. 동시 electrophysiological 및 광학 녹음은 우리의 방법은 안정적으로 스파이크를 (&gt; 97% 스파이크 검출 효율) 검색을 나타냅니다, 허위 긍정적 인 스파이크 감지 (&lt;0.003 스파이크 / s)로, 높은 시간적 정밀 (MS 3) 3의 낮은 속도가 있습니다. 스파이크 검출이 광학 방식은 체외과 생체 3,4에 anesthetized 동물의 신경 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

대뇌 피질의 기능이 뉴런의 인구의 수준에 발생하기 때문에 척추 중추 신경계의 기능을 이해하는 것은 많은 뉴런의 녹음이 필요합니다. 다음은 단일 셀 및 단일 스파이크 해상도로 suprathreshold 신경 활동을 기록 할 수있는 광학 방법을 설명, 랜덤 액세스 검사는 디더링. 까지의 높은 시간적 해상도 100 뉴런이 방법을 기록 체세포 형광 칼슘 신호. 최고 확률이 알고리즘은 체세포의 형광 칼슘 신호의 기본 suprathreshold 신경 활동을 deconvolves. 이 방법은 안정적으로 높은 검출 효율과 잘못된 반응의 낮은 속도로 스파이크를 감지하고 신경 인구를 공부하는 데 사용할 수 있습니다<em&gt; 체외에서</em&gt;와<em&gt; 생체 내</em&gt;.

단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 suprathreshold 신경 활동의 광 기록

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K 조회수.  The University of Texas at Austin. 대뇌 피질의 기능이 뉴런의 인구의 수준에 발생하기 때문에 척추 중추 신경계의 기능을 이해하는 것은 많은 뉴런의 녹음이 필요합니다. 다음은 단일 셀 및 단일 스파이크 해상도로 suprathreshold 신경 활동을 기록 할 수있는 광학 방법을 설명, 랜덤 액세스 검사는 디더링. 까지의 높은 시간적 해상도 100 뉴런이 방법을 기록 체세포 형광 칼슘 신호. 최고 확률이 알?...

비디오: Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

단일 유닛 활동과 Electrocorticographic 신호를 녹음하기 위해 만성 신경 전극 외과 이식

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

연구

신경과학

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

녹화 및 자극 애플리케이션을위한 높은 접촉 밀도의 제작, 평면 인터페이스 신경 전극

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

신경 활동과 연결 Intracranial 뇌 파 데이터를 사용 하 여 SPM 소프트웨어 분석

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...