저자는 우수한 기술 지원을 위해 기생충과 크리스티나 Holm이의 genotyping을 위해 마이클 Alifrangis과 Ulla Abildtrup 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (보조금 55,005,511), Lundbeck 재단 (부여 R9-A840)와 닐스 Bohr 국제 교류 재단이 지원되었습니다.

1. 갓 선정 감염된 적혈구의 생성 PfEMP1 단백질의 표면 표현 신선한 선택 문화를 사용하는 경우이 분석은 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 특정 실험 3D7 P.에서 falciparum의 일족이 이전에 1 설명한 바와 같이 특정 항체를 사용하여 선정되었습니다. 1 일 <ol><li> P.의 포장 혈액 세포의 수확 200 μl falciparum 문화는 실온에서 8 분 800 XG에서 원심 분리하여 2~5% 늦게 무대 IE를 포함. </li><li> 37 2 ML에서 피 펠렛를 다시 일시 중지 ° C 따뜻한 0.75 % 젤라틴 14 ML 멸균 튜브에 솔루션 및 침전에 감염되지 않은 및 링 단계 IE를 허용하도록 37 ° C 15-20 분에 출발합니다. </li><li> 말기 IE를 수확, 새로운 14 ML 튜브로, 위의 단계를 즉 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어. </li><li> 특정 항 PfEMP의 50 μl를 희석37의 2 ML ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어와 살균 필터 1 항체. </li><li> 37 번 30 분에 14 ML 멸균 튜브와 배양에서 살균 희석 antisera ° 부드러운 교반과 C와 함께 바랜 말기 IE를 섞는다. </li><li> 상온에서 8 분 800 XG에 스핀 다운, 그리고 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어. </li><li> DynaMaq-15 자석을 사용하여 RBC - 세탁 미디어와 중지 두 번 Dynabead 단백질의 50 μl를 씻으십시오. </li><li> 300 μl RBC - 세탁 미디어에서 Dynabeads을 Resuspend하고 바랜 말기 IE에 추가​​합니다. 부드러운 교반과 37 ° C에서 30 분에 품다. </li><li> DynaMaq-15 자석에 튜브를 전송합니다. 1-2 분을 위해 남겨 모든 액체를 제거합니다. </li><li> RBC - 세탁 미디어의 4-5의 ML에 Dynabeads을 Resuspend. 자석에 튜브를 다시 전송하고 모든 액체를 제거하기 전에 1-2 분을 위해 출발합니다. 한 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 25cm 두 멸균 문화 F에 씻은 구슬을 전송200 μl 갓 포장 적혈구를 포함하는 lask. 문화에 Albumax 미디어의 5-6 ML을 추가합니다. 37 5 % CO 2에서 하루 아침에 저장 ° C. </li></ol> 2 일 <ol start="12"><li> 선택한 IE는 14 ML 멸균 튜브에 대한 모든 문화를 전달하여 새로운 적혈구를 reinvaded 한 문화에서 Dynabeads를 제거합니다. DynaMaq-15 자석에 튜브를 넣고 1-2 분 동안 둡니다. 그런 다음, 문화 플라스크에 모든 액체를 다시 흘려. </li><li> 와 같은 몇 5~10%의 parasitemia 때까지 가능한 한주기와 기생충에 대한 문화 ringstage 이용하실 수 있습니다. </li><li> IE는 올바른 표면 표현형이 중 PFD1235w의 and/orPF11_0008의 즉, 단백질 표현이 1를 획득되었는지 확인하기 위해 FACS에 의해 분석해야합니다. </li></ol> 2. 프로브의 작성 안티센스 RNA 프로브는 PFD1235w과 PF11_0008 VAR의 가장 변수 지역에서 생성 된 &lt;P.에서 / em&gt;는 유전자 falciparum 3D7의 게놈의 DNA. DNA는 제조업체의 설명 (로슈)에 따라 각각 PCR에 의해 증폭 및 해독을 위해 pSPT18 또는 19 벡터로 복제되었습니다. 프로브 (580 기본 쌍 (BP)와 길이 590 BP)이 각각 파 RNA 라벨 키트 또는 비오틴 RNA 라벨 믹스를 사용하여 Digoxigenin (파) 또는 비오틴으로 표시되었습니다. 우리는 모두 북부 얼룩 분석 의해 단일 레이블 생선 분석 (1)에 의해 프로브의 특이성을 확인했습니다. 3. 현장 하이브리드 화에 얇은 문질러과 이전 기생충 고정 1 일 모든 단계는 RNase없는 환경에서 수행하고 모든 시약은 RNase 무료 또는 디 에틸 pyrocarbonate (DEPC) 또는 RNase 해치 (Invitrogen)로 사전 처리 있습니다. 슬라이드와 커버 용지는 잔여 제조 그리스를 제거하려면 알코올로 세척해야합니다. 이 단계들 사이에서 일시 정지하지 않고 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다nuclease 오염의 위험을 최소화하기 위해 인치 <ol><li> 표준 확산 방법 3 얇은 혈액 필름을합니다. 현미경의 100x 오일 목적 렌즈를 사용 IE를 계산하고 문화 IE의 비율을 계산합니다. 기생충 단계는 링과 IE주기의 초기 trophozoite 단계에서, 대략 synchrony에 있는지 확인합니다. 다음은 미리 복제, 단일 핵 단계, 표현 VAR 유전자 mRNA와 이런 종류의 단세포 생선 전사 assays에 적합합니다. </li><li> 1.5 ML RNase 무료 Eppendorf 튜브에 5-10 %의 parasitemia에서 기생충 문화의 50 μl를 전송합니다. 상온에서 2,000 rpm으로 1 분에 원심 분리기. </li><li> 미디어를 제거하고 DEPC - 처리 된 물 50 μl PBS의 pH를 7.2을 추가합니다. 부드럽게 튜브를 선동. 미디어 및 세포 잔해에서 무료로 세포를 씻어 두 번 원심 침강 단계를 반복합니다. </li><li> 넷 품질 얇은 얼룩을합니다. 각 비방를 들어,에 한 도말 표본을잘 RNase-자유 후드에서 4도 슬라이드, 총 즉, 네 유리 슬라이드 (중요한 단계) 중 하나에 11mm 직경. 파도가 건조 할 수있는 공중으로 간단히 슬라이드. 특정 프로브, RNase 처리 및 관심 유전자를 표현하지 IE 포함 삼분의 일 슬라이드의 또 다른 슬라이드를 사용하여 다른 관련이없는 유전자에 대한 단일 프로브 착색을위한 컨트롤 - 하나의 제외 슬라이드하기위한 세 가지 여분의 슬라이드를 확인합니다. 10-20 분 동안 벤치에 건조 할 수있는 슬라이드를 둡니다. </li><li> 우물에 4 % paraformaldehyde 5 % 빙하 아세트산을 포함하는 고정 솔루션을 60 μl를 추가하여 박막을 수정합니다. 실온에서 벤치에 10 분 동안 둡니다. </li><li> 실온에서 부드럽게 교반 5 분 동안 2 배 SSPE 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. 간단히 종이 휴지로 부드럽게 세포를 포함하는 우물을 터치하여 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 37 ° C (매우 중요한 단계에서 2 분에 0.01 M HCL에 0.01 %의 펩신과 함께 슬라이드를 커버). 상온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 μg / ML의 최종 농도에 RNase 솔루션을 희석. RNase 솔루션의 60 μl로 대조군의 얼룩을 다룹니다. 37 ° C에서 30 분 동안 배양 한 후 실온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻어. </li><li> 하이브 리다이 제이션 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 4. 고정 슬라이드로 RNA 프로브의 하이브리드 1 일 <ol><li> 이러한 ThermoStar 100 HC4 또는 RNase 해치와 함께 분사하고 종이 휴지로 깨끗이 닦고하여 깨끗한 오븐에 넣어 빈 피펫 팁 상자 하이브 리다이 제이션 챔버을 준비합니다. 하이브 리다이 제이션 챔버 또는 슬라이드가 하이브리드 동안 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 DEPC - 처리 물 상자 하단의 채널을 입력합니다. 48 챔버 및 예열을 닫으 ° C. </li><li> 12 NG / μl의 최종 농도에 하이브 리다이 제이션 용액에 프로브를 희석. 가열 블록의 5 분에 65에서 프로브 솔루션 ° C를 변성. 즉시 얼음에 진정 하라구. </li><li> 간단히 공기는 2 배 SSPE 세척 후 슬라이드를 건조. 조심스럽게 종이 휴지로 우물 주변에 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 챔버를 열고 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 하나 또는 잘 60 μl의 총 볼륨의 두 프로브를 적용 할 수 있습니다. 조심스럽게 무균 집게를 사용하여 RNase 무료 커버 슬립이있는 액체 방울을 다룹니다. </li><li> 챔버를 닫고 밤 동안 적어도 16 시간 48 ° C에서 슬라이드를 잡종을 만들다. </li></ol> 5. 항체 활용 및 형광 증폭 2 일 다음 단계는 Perkin 엘머에서 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템을 기반으로합니다. 모든 단계는 실온에서 이루어집니다. <ol><li> 부드러운 교반 5 분 동안 TNT 버퍼에 슬라이드에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 30 분에 TNB 버퍼 150 μl에 우물을 차단. </li><li> 1:500의 비율로, TNB 버퍼에 1:100의 비율과 HRP-복합 α-비오틴 항체에 TNB 버퍼에 HRP-복합 α-파의 항체를 희석. 종이 조직과 슬라이드에서 초과 TNB 버퍼를 제거합니다. 동시에 두 스크립트를 감지하면, 두 항체는 한 번에 이동할 수 있습니다. 물론 당 항체 - TNB 솔루션 100 μl의 총 금액을 적용하고 신중하게 커버 슬립을 다룹니다. 2 시간에 슬라이드를 품다. </li><li> 조심스럽게 커버 용지를 제거합니다. 5 분에 3 회 TNT 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 1:500의 비율에 tyramide 증폭 시약에 FITC-형광을 희석하여 각도에 대한 해결책의 100 μl를 적용 할 수 있습니다. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다. </li><li> 조심스럽게 커버 미끄러를 제거하고 부드러운 교반에 의한 TNT 버퍼의 5 분의 슬라이드에게 3 번 씻는다. </li><li> 1:500의 비율로 tyramide 증폭 시약의 Cyan3 - 형광을 희석. 100 μl를 추가합니다이 솔루션의 잘. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다. </li><li> 커버를 제거주의 깊게 미끄러 후 TNT 버퍼에 빠져 신속하게 슬라이드를 씻어. </li><li> 5 분을위한 TNT 버퍼로 슬라이드에게 3 번 씻으십시오. </li><li> DEPC - 처리 물에 빠르게 슬라이드를 빠져. </li><li> 건조 방송에 슬라이드를 둡니다. DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약으로 슬라이드를 탑재합니다. 매니큐어와 커버 용지의 모서리를 밀봉합니다. </li><li> 슬라이드 이제 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 계속 4에 알루미늄 호일 및 매장으로 덮여 슬라이드 ° C 실험 다음 날 완료 될 경우. 슬라이드의 측면의 완전한 밀폐는 안티 - 페이드 시약을 적용한 후 24 시간을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜이 완료 된 후 슬라이드가 일주일에 이미징 될 수 있습니다. </li></ol> 6. Hybridized 프로브의 시각화 <ol><li> 현미경을 사용합니다. 표준 immunofluorescence 현미경 suffic입니다당신은 공 촛점 현미경에 대한 액세스 권한이있는 경우 실험이 종류의 ient,하지만 당신은 또한 3D 이미지이를 사용할 수 있습니다 또는 귀하의 스테인드 세포의 비디오를 얻을 수 있습니다. 현미경은 15-30 분에 따뜻하게 할 수 있습니다. 컴퓨터와 소프트웨어에 전환합니다. </li><li> immunofluorescence 현미경에 착색의 품질을 확인합니다. 몇 기생충을 포함하는 장소를 선택합니다. </li><li> 수동으로 각 레이저의 게인을 조정합니다. 픽셀이 4-6m -1의 -1과 512 X 512 픽셀의 단계에 머물러 조정합니다. </li><li> 프레임 람다를 사용하여 테스트 사진을보세요. 레이저 게인을 다시 조정. </li><li> 형광 단일 세포의 20 좋은 사진 최소보십시오. 5-20 기생충을 포함하는 필드의 적어도 2-5 사진은 긍정적 인 기생충의 비율 공정 개요를 얻기 위해 필요합니다. </li></ol>

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	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. 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S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

RNA 물고기 분석 등 북부 blotting과 RT-PCR 등의 방법에 대조적으로, 단일 세포 수준에서 특정 mRNA의 성적 차별을 할 수 있습니다. 이 P.,이 예에서는이 가능 transcriptionally 운영 중 및 운영 중지 세포 구별 할 수 있습니다 falciparum은 기생 인간의 적혈구 내부 원생 동물. 이러한 모든 세포 관찰은 종종 필요하고 중요하고 새로운 전사 패턴에게 1 낼 수 있습니다. ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 아세트산 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> 338826 - 100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax 미디어 : RPMI 1640 글루타민 솔루션 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ML RPMI 1640 5 ML의 글루타민 솔루션 </td></tr><tr><td> Albumax 미디어 : Gentamycin 황산염 Albumax - 솔루션 </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 ML gentamycin 황산염 50 ML Albumax - 솔루션 </td></tr><tr><td> Albumax - 솔루션 : 하이포 잔틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g 하이포 잔틴 </td></tr><tr><td> Albumax - 솔루션 : AlbuMAX II </td><td> 나는nvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax - 솔루션 : RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4리터 RPMI 1640 최대의 자석과 디졸브. 50 ° C. 필터 살균 및 aliquots에서 -20 ° C에 저장합니다. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> 시그마 </td><td> A5710-110G </td><td> 포름 아미드를 deionize하는 수지. </td></tr><tr><td> 안티 - 비오틴 염소 PAB 퍼 옥시 데이즈의 공액 </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 잘 해봐 항체 </td><td> Novus 생체 </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI와 안티 - 페이드 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> 설치 미디어는 완전히 슬라이드를 씰링까지 24 H에 대한 치료가 있습니다. </td></tr><tr><td> 비오틴 RNA 라벨 믹스 </td><td&gt; 로슈 </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> 카메라 디지털 </td><td> 니콘 디지털 시력 DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Menzel - glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> 문화 플라스크 25cm 2 Nunclon 표면 </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / 시그마 </td><td> 32490-100ml </td><td> 1000 ML deinonized 물 1 ML DEPC. 저어 바 추가 및 12 H에 젓는다. 30 분에 압력솥. </td></tr><tr><td> 디지털 카메라 </td><td> 니콘 디지털 시력 DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads 단백질 </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 마그넷 </td><td> Invitrogen </td><td> 123 01D </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 bioultra 99% </td><td> Fluka/ 시그마 </td><td> 4만7천6백71-1리터-F </td><td> Deionized 포름 아미드 : 포름 아미드의 100 ML 당 이온 교환 수지의 5g. 30 분 저어. 워트 먼지 종이를 필터링 할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> . 젤라틴 0 75 % 솔루션 : 젤라틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G2500 </td><td> 500 ML RPMI 1640에 3.75 g의 젤라틴. 56 열 ° C 분해합니다. 때 56 ° C. 소독 필터 aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. </td></tr><tr><td> . 젤라틴 0 75 % 솔루션 : RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ML RPMI 1640에 3.75 g의 젤라틴. 56 열 ° C 분해합니다. 때 56 ° C. 소독 필터 aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. </td></tr><tr><td> 글루타민 용액 : L-glutamin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G3126 </td><td> 500 ML 0,9 % NaCl에서 14.6 g L의 글루타민. 용해, 필터의terilize과 aliquots에서 -20 ° C에 저장합니다. </td></tr><tr><td> 글루타민 솔루션 : HCL </td><td> 시그마 </td><td> H1758 </td><td> 500 ML 0,9 % NaCl에서 14.6 g L의 글루타민. 용해, 살균 필터링 및 aliquots에서 -20 ° C에 저장합니다. </td></tr><tr><td> 하이브리드 솔루션 : 포름 아미드 바이오 초 99% SSC 20x </td><td> Fluka / 시그마 </td><td> 4만7천6백71-1리터-F </td><td> 총 20 ML, -20에서 냉동 상태로 유지 ° C를 aliquots에 10 ML deionized 포름 아미드 </td></tr><tr><td> 하이브리드 솔루션 : Denhardt의 50x 원액 </td><td> 시그마 </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> 하이브리드 솔루션 : 효모 tRNARoche 차단 시약 </td><td> 시그마 </td><td> R-6750 </td><td> 2 ML 50x Denhardt의 ML 효모 tRNA 당 250 μl 20 밀리그램 </td></tr><tr><td><s연어 정자 DNA :&gt; 하이브 리다이 제이션 솔루션을 trong </td><td> Fluka / 시그마 </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g 로슈는 시약을 차단 ML의 연어 정자 DNA 당 10 밀리그램 (: 변성 연어 spermDNA 96 5 분에 대한 ° C 하이브 리다이 제이션 솔루션에 추가하기 전에 중요) 1 ML </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil 악기 GmbH의 </td><td> 1004-0011 </td><td> 하이브 리다이 제이션 오븐과 DEPC 물에 패드를 물렸다 RNase 무료 하이브 리다이 제이션 챔버로 대체 할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 집중 기름 UV 투명 형광 무료 </td><td> 시그마 </td><td> 10976 - 1EA </td><td></td></tr><tr><td> Immunofluorescence 또는 공 촛점 현미경 </td><td> 니콘 D-이클립스 (Eclipse) TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> 모든 약국에서 사용 가능 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x : NaCl KCl NA 2 HPO 4 X 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionized H 2 O </td><td></td><td></td><td> 7.4에 Ajust 피에이치 160g 4g 23g 4g 1리터 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4퍼센트 </td><td> Fluka / chemika </td><td> 76,240 </td><td> 80 ML PBS / DEPC에 4g PFA. PFA는 해체 ° C까지 65 열. 20 ML PBS를 추가 솔루션은 냉각 할 수 있습니다. 7.4로 산도를 조정합니다. 필터링 할 수 있습니다. -20 ° C.에서 aliquots에 저장 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4퍼센트 / 산성 아세트산 5% </td><td></td><td></td><td> 950 μl paraformaldhyde + 50 μl 아세트산 </td></tr><tr><td> 펩신 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> 퍼 옥시 데이즈 - 복합 항비오틴 </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC - 세탁 미디어 : RPMI 1640 글루타민 솔루션 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ML RPMI 1640 5 ML의 글루타민 솔루션 </td></tr><tr><td> RBC - 세탁 미디어 : Gentamycin 황산 </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 ML gentamycin 황산염 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td></td><td> 10 MG / ML 주식 솔루션을합니다. </td></tr><tr><td> RNase 무료 1.5 ML 튜브 </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase 해치 </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> 11mm 4 우물을 슬라이드 </td><td> 열 과학 </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x : NaCl </td><td> 시그마 / 알drich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175g / L) 0.3M 오세영 3 구연산 X H 2 O는 (88 G / L) 1M HCL과 산도 7.0으로 조정 </td></tr><tr><td> SSC 20x : 나트륨 구연산의 탈수 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175g / L) 0.3M 오세영 3 구연산 X H 2 O는 (88 G / L) 1M HCL과 산도 7.0으로 조정 </td></tr><tr><td> SSPE 20x : NaCl </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> S9625 </td><td> 175.3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x : 아뇨 2 PO 4 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> S0751 </td><td> 27.6 g 아뇨 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x : 4 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 분말 </td><td></td><td></td><td> 9.4 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 분말 DEPC 물을 추가 산도 7.4을 조정할 수 있습니다. 자동20 분에 clave </td></tr><tr><td> TNB 버퍼 : TNT 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 10 ML TNT 버퍼 </td></tr><tr><td> TNB 버퍼 : 차단 시약 </td><td></td><td></td><td> 0.05g 차단 시약 차단 시약을 분해하려면, 감동과 하나가 시간 60 ° C에 솔루션을 가열. -20 ° C.에 저장 (Perkin 엘머 TSA 프로토콜에서 파생.) </td></tr><tr><td> TNT 버퍼 : 트리스 / HCL </td><td> 시그마 </td><td> T1503 </td><td> 1M 트리스 / HCL, pH를 8.0 </td></tr><tr><td> TNT 버퍼 : NaCl </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S9625 </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> TNT 버퍼 : Tween20 </td><td> 시그마 </td><td> 93,773 </td><td> 5 M NaCl 30 ML 한 ML DEPC DH 2 O869 랑 MI 실온에서 7.5로 산도를 조정합니다. (Perkin 엘머 TSA 프로토콜에서 파생.) </td></tr><tr><td> TSA 플러스 Cyanine3 / Fluorescein 시스템 </td><td> Perkin 엘머 </td><td> NEL753000IKT </td><td> 실험을 시작하기 전에주의 깊게 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템에서 프로토콜을 참조하십시오. </td></tr><tr><td> 멸균 튜브 14 ML </td><td> Almeco - CM LAB APS </td><td> 91,016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

말라리아 감염 동안 인간의 내피 수용체에 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (IE)의 접착은 VAR 유전자에 의해 인코딩 PfEMP1 단백질 변형의 표현에 의해 중재됩니다. haploid P. falciparum 게놈은 하나가 감염 혈액 단계에서 한 번에 셀 당 베꼈 것으로되어있는 약 60 가지 VAR 유전자를 비호. 어떻게 VAR 유전자 전사의 이러한 상호 배타적 인 규제가 달성하는 것은 명확하지 않다, 개별 VAR 유전자 또는 P.의 임상 결과에 대한 서로 다른 수용체 및 차동 바인딩의 결과와 관련된 VAR 유전자의 하위 그룹의 식별이 falciparum 감염. 최근 상호 배타적 인 전사 패러다임은 개별 P.에 따라 전사 assays에 의해 의심을하게되었습니다 단일 INF의 falciparum 대본 확인P.의 개별 핵에있는 기생충에 의한 VAR 유전자 전사의 원위치 하이브리드 화에 RNA 형광을 사용하여 ected erythrocytic 전지 (물고기) 분석 falciparum IE 1. 여기, 우리는 P.의 단일 핵에 VAR 유전자 전사의 분석을 위해 RNA - 물고기 방법론을 수행하기위한 세부 프로토콜을 제시 falciparum은 인간의 적혈구를 감염. 방법의 사용을 기반으로 digoxigenin 및 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템 2 (Perkin 엘머), 미세 분석 갓 선택한 P.를 사용하여 안티센스 RNA 프로브에게 비오틴 - 표시 falciparum IE. 현장 하이브리드 방식의는 P.의 다른 단계에서 표현 전사와 유전자의 다양한 규제를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 falciparum 수명주기와는 다른 말라리아 기생충 종과 다른 생물과 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

그림 1은 주요 단계와 RNA 물고기 방법론의 시간 기간의 순서도를 보여줍니다. 단일 P.를 사용하여 잘하고 제대로 보존 스테인드 mRNA 생선 실험을 대표하는 일련의 이미지 falciparum IE는 그림 2에 표시됩니다. 이 세포 protozoan는 DAPI와 푸른 물들어있는 작은 (1-1.5 μm 직경) 핵이 있습니다. 배란 후 24 시간 P.의 적혈구 침공 후 falciparum?...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

형광성의<em&gt; 현장에서</em개별 셀의 mRNA 성적 증명서를 확인하는&gt; 하이브리드 (물고기) 등의 하나 이상의 회원의 동시 전사로 polygenic 활동의 분석을 할 수 있습니다<em&gt; VAR</em&gt; multigene 가정에서<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; 감염된 적혈구<sup&gt; 1</sup&gt;. 기술은 적응력이 있으며, 유전자, 세포와 생물의 다른 유형에 사용할 수 있습니다.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

15.3K 조회수.  University of Copenhagen. 형광성의 현장에서 하이브리드 (물고기) 등의 하나 이상의 회원의 동시 전사로 polygenic 활동의 분석을 할 수 있습니다 VAR multigene 가정에서 Plasmodium falciparum 감염된 적혈구 1. 기술은 적응력이 있으며, 유전자, 세포와 생물의 다른 유형에 사용할 수 있습니다.

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

연구

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...