이 작품은 나중에이 predoctoral 교제 (EDK), NARSAD 젊은 탐정 수상 (디케이)와 NIMH의 두뇌 보너스 (R01MH087495) (디케이)가 CIRM 지원되었다.

마취 및 진통제 : 마취하기 전에 30 분 거리에 있으며, 진통제에 대한 0.05 밀리그램 / kg 피하 buprenorphine와 쥐 투입. 30-40 MG / kg intraperitoneal 나트륨 pentobarbital로 마취를 시작하라. 이 시점에서, 또한 (2 밀리그램 / kg 피하) 추가로 진통제로서 호흡 (0.4 밀리그램 / kg, 피하)와 meloxicam을 방지하기 위해 아트로 핀을 주사. 오분 후, 쥐 여전히 모바일 또는 발가락이 핀치에 반응하는 경우 쥐의 고통에 응답하지 않는 밀리그램 / kg (intraperitoneal)까지, 5시 pentobarbital 나트륨의 후속 투입을 제공합니다. 첫 절개를 수행하기 전에 국소 마취를 위해 절개 사이트에서 lidocaine을 (5 밀리그램 / kg, intradermal) 주사. 여섯 시간에서 여덟 시간 초기 주입 후 진통제를위한 0.05 밀리그램 / kg 피하 buprenorphine와 쥐 투입. 필요한 경우이 일반적으로 필요하지 않습니다하지만 Buprenorphine는 이후 모든 6~8시간을 주입 수 있습니다. 그것은주의하는 것이 중요하다 그 마취를 C 다른 형태의이 excitotoxic 병변을 방해. 케타민을은 설치류 동물의 마취 중 일반적으로 사용되는 형태입니다 비록 그것이 NMDA 수용체 길항제이기 때문에 예를 들어, 그것은 NMDA로 유도된 병변을 방해할 수 있습니다. 그것은 병변 크기를 줄일하지 않습니다 유도 마취의 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 가스 마취가 원하는 경우, 여기에 설명된 내용을 포함하여 대부분의 stereotaxic 장치는 방독면 어댑터를 수용할 수 있습니다. 참고 : 재료는 특정 시약 아래 장비의 테이블에 추가로 설명되어 있습니다. 1. 펌프 및 Stereotax의 작성 <ol><li> 멸균 물을 10 μl 해밀턴 주사기를 작성하고 6 주사기 프로그래머블 펌프의 캐디에 그 파일을 탑재합니다. 펌프에 채워 홀더에 주사기 플런저의 끝을 고정합니다. </li><li> 미리 기입은 바늘 1 개 ML의 주사기를 사용하여 멸균 물을 PE20 튜브를 가스 소독. 치료되고, 해밀턴 주사기에 튜브의 열린 끝을 슬라이드튜브에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 ful. </li><li> 배럴 스타일의 전극을 사용하여 조작하는 사람 stereotaxic 장치의 팔에에 튜브의 30ga, 플랫 컷, 1 인치 주입 바늘 끝을 고정. 클램프 및 홈 붙이 총신 사이에 주입 바늘을 삽입합니다. 튜빙을 평평화 및 유체 흐름을 제한하지 않도록 그 안에서 금속 바늘이 들어있는 튜브의 조각 이상 클램프를 고정합니다. </li><li> &gt; 5 μl / 분으로 펌프 속도를 조절하고 펌프를 켜십시오. 물의 구슬은 주입 바늘의 끝에 나타납니다. 전혀 누수가 없는지 확인하기 위해 튜브와 관절의 길이를 확인합니다. </li><li> 멸균 면봉으로 비드 물을 닦아하고 인출할 수있는 펌프를 설정합니다. 2 μl 공기 방울을 철회. 거품의 상단은 튜브에 표시해야합니다. </li><li> 멸균 0.1M PBS에서 NMDA의 20 밀리그램 / ML 솔루션 주입 바늘 팁을 담가와 4-5 μl를 철회. 공기 방울은 멸균 물 NMDA 용액 사이에 볼 수 있어야팁 인치 그것은 NMDA가 적정량 neurotoxin이며,주의는이 솔루션의 준비와 처리에 사용되어야한다는 것을 유의하는 것이 중요합니다. 장갑 및 눈 보호는 항상 좋습니다. </li></ol> 2. Stereotaxic 장치에 생쥐를 탑재 <ol><li> 그림 1은 stereotaxic 장치의 기본적인 부분을 묘사. 귀를로 눈의 라인에서 쥐의 머리를 면도 후, 쥐의 시체가 중간에 설정 손난로에서 휴식과 함께 물린 바 위에 쥐의 앞니를로드합니다. 혀가 아래턱과 함께 물린 표시줄 아래 교수형한다. 가능한 경우, 온도 피드백 가열 패드 바람직 것입니다. 직장 온도를 모니터링하면 이상적인 것입니다. </li><li> 엄지와 집게손가락으로 쥐의 목을 잡고 오른쪽 귀에 표시줄에 오른쪽 수평 외이도를 이동합니다. 그것이 단단한 장소에서 쉬고있는 것처럼 표시줄이 느껴, 그것은 지금까지 머리 속에 침몰 없어 보이 네요. 머리의 오른쪽을 개최하는 것은 꾸준한, 왼쪽 귀에 밀어쥐의 왼쪽 수평 외이도로 바. 그것이 단단한 장소에서 쉬고있는 것처럼 느끼게한다. pinnae는 대칭보고해야하며 귀에 바 드러 거짓말이 나타납니다. 상향 pinnae의 나팔꽃 모양의 것은 귀에 막대의 부적 절한 배치를 나타냅니다. 머리는 목을의 압력에 대한 응답으로 동요해서는 안됩니다. </li><li> 코 막대를 아래로 치고. 진정하세요. 코를 뼈가 섬세하고 코와 막대가 꽉 될 필요가 없습니다. 쥐가하기 전에 아직 anesthetized 있는지 확인합니다. </li></ol> 3. 수술 쥐 준비하기 <ol><li> 멸균 면봉을 사용하여 부드럽게 건조 및 파편으로부터 그들을 보호하기 위해 쥐의 눈 각각에 수의학 안과 윤활 연고의 작은 금액을 넣으십시오. </li><li> 집중적으로 면도 영역의 가장자리에 계획된 절개 사이트에서, 2 % chlorhexidine 솔루션 쥐의 두피를 닦아 70 % 에탄올 세 번 따라갔다. 보다 효과적인 살균제가 원하는 경우 Chlorhexidine 스크럽도 사용할 수 있습니다.10 % povidone의 요오드 용액으로 닦는으로 마침. 준비된 두피 이제 무균이며 전용 살균 재료와 접촉해야합니다. </li><li> 자세한 단계 돈 멸균 장갑 당신이 다음 준비된 외과 사이트를 처리하기 때문입니다. </li><li> fenestration은 외과 사이트를 노출하므로 무균 드레이프를 놓습니다. </li></ol> 4. 외과 창 만들기 <ol><li> # 10 메스 블레이드 사용하여 두피의 종방향 중간선을 따라 절개를 (길이 약 2 ㎝)합니다. 절개는 눈의 라인에 대한 사후 시작합니다. 엄지와 비 지배적인 손의 집게손가락으로 절개의 방향으로 장력 직각으로 두피를 누르고 있습니다. </li><li> 멸균 솜 팁을 사용하여 외과 사이트의 가장자리에 두개골 표면을 overlying 근막을 당겨. 그것을 볼 수 있도록 두개골을 취소한 일부 력을 취할 것입니다. </li><li> 외과 창을 만드는 4 가지 곡선, 멸균 hemostats를 사용하십시오. EA의 클램프 근막 (NOT 피부)다음 채널 절개의 앞부분과 후부 측면 사이드하고이를 오픈 절개를 당기는 완전히 두개골을 노출, 동물과 함께 클램프를 바칩니다. </li></ol> 5. 두개골을 평평하게하고 파일럿 구멍 만들기 <ol><li> bregma, 그림 2에 묘사된대로 두개골의 세 가지 주요 접시가 충족 앞부분 지점을 찾습니다. 바늘 끝 단지 bregma에서 두개골을 감동 있도록 주입 바늘을 이동합니다. 지느러미 - 복부 좌표. 그림 3은 Stoelting stereotaxic 장치의 좌표를 읽는 방법을 설명합니다. 참고이 시점에서, 장갑은 더 이상 무균 없습니다 직접 무균 수술 사이트를 만지지 않습니다. 참고 : nonsterile stereotaxic 장치를 만지 후 외과의가 더 이상 무균이지 않고 수술 현장이나 외과 사이트를 만질 것입 장비의 부품을 만지지 않습니다. </li><li> depicte으로 람다, 두개골의 세 가지 주요 번호판을 충족 후부 포인트를 찾습니다그림 2에서 D. 약간 주입 바늘을 들고 똑바로 다시 람다로 이동합니다. 그냥 람다의 두개골을 감동 때까지 바늘을 낮춥니다. 지느러미 - 복부 좌표를 읽어보십시오. 두개골이 수준이면 bregma 읽는 중 0.1 mm 이내가 될 것입니다. 더 이상 오프 이것보다 경우 (비키) 바늘을 위쪽으로 이동, 다시 측정 후 코 표시줄을 느슨하게 역시 물린 바 플랫폼을 높이거나 낮출 어느 머리 끝이 너무 높은가에 따라합니다. </li><li> bregma 통해 주입 바늘을 이동하고 앞부분 - 후부 및 중간 - 수평 좌표를 기록합니다. 니들이 뇌 아틀라스 12에 따라 관심있는 뇌 영역의 좌표를 기반으로 이동해야합니다 어디서 계산합니다. 즐 내용 앞부분 - 후부 좌표에서 2.8 mm를 뺀것하거나, 추가하거나 왼쪽 또는 오른쪽을 타겟팅할 여부에 따라 중간 - 측면 좌표에서 /로 5.1 mm를 뺍니다. 계산된 위치로 주입 바늘을 이동합니다. </li><li> 옛 성은 좌우로그것이 위치한 장소에서 추적 후 첨부 멸균 치과 드릴 비트로 Dremel 모토 도구를 사용하여 해당 위치에 직경의 구멍을 약 2mm를 자세히 보려면​​ 돌보는 비키 dle. 드릴이 두개골을 뚫고 나옵 때 같이 신중하게 훈련을 하죠, 그것은 아마도 경질과 아래 뇌 조직을 손상, 풀다운하는 경향이 있습니다. 그것을 확대하기 위해 구멍을 넓히다. </li><li> 멸균 면봉으로 어떤 피를 흡수. </li></ol> 6. Neurotoxin의 주입 <ol><li> 바늘 다시 위치로 돌려. 그것이 두뇌의 표면을 만지는 때까지 바늘을 낮춥니다. 지느러미 - 복부 좌표를 기록합니다. 이것은 경질의 수준입니다. 관심있는 뇌 영역에 도달하기 위해 적절한 값을 뺍니다. basolateral 편도의 경우, 6.7 mm를 뺍니다. </li><li> 천천히 계산된 수준으로 주입 바늘을 낮춥니다. 그런 다음 잘 두개골 위에 그것을 다시 올립니다. 조심하지 t으로되고, 주입 바늘의 팁을 unclog하기 위해 해밀턴 주사기 청소 와이어를 사용비 멸균 장갑과 주입 바늘과 접촉 철사의 끝을 아우. </li><li> &gt; 5 μl / 분에서 펌프를 실행하고 주입 바늘 나올 액체의 비드를 참조해야합니다. 그렇지 않으면 철사로 unclog하고 다시 시도하십시오. </li><li> 천천히 원하는 복부 / 지느러미 수준으로 주입 바늘을 낮춥니다. </li><li> 0.1 μl / 분들에게 주입 펌프의 속도를 설정하고 주입을 시작합니다. 2 분 동안 달이다. </li><li> 주입이 시작되면 검은색 마커가있는 튜브에 공기 방울의 두 끝을 표시합니다. 양쪽으로 이동하지 않으면 바늘가 막혔어요. 주입을 중지, 와이어와 unclog, 바늘을 마련, 다시 낮출 바늘, 높은 유속과 흐름을 확인하고 다시 시도하십시오. </li><li> 주입이 완료되면 펌프를 중지하고 바늘 끝에서 떨어져 주워 NMDA 5 분 정도 기다리십시오. </li><li> 바늘 0.5 mm도 살리고, 1 분 동안 다시 달이다. 바늘 끝에서 떨어져 주워 NMDA 2.5 분 정도 기다립니다. 이 추가 주입 사람lps은 즐의 모든 주입에 의해 덮여 보장합니다. 이것은 다른 뇌 영역에 필요한이든 실험적으로 결정한다. </li><li> 천천히 뇌 주사 바늘을 들고 길을 stereotaxic 팔을 밖으로 오세요. </li></ol> 7. 절개를 닫기 <ol><li> 던 새로운 멸균 장갑 절개를 닫습니다. </li><li> 멸균 솜 팁으로 두개골에 대한 여분의 피를 닦아 및 근막에서 클램프를 제거합니다. </li><li> 런던 집게를 사용하여 함께 절개의 두 측면을 밀어. 피부의 안쪽 가장자리는 충족해야하며 피부의 바깥쪽 가장자리가 절개로 곱슬 곱슬하는 것은 허용하지 말아야합니다. 절개를 누르면 폐쇄하는 동안 단단히 돌출부를 닫습 상처 클립을 적용합니다. 절개의 길이를 따라 함께 피부와 스테이플을 눌러 계속. 이것은 보통 3-5 상처 클립 걸립니다. </li><li> 모든 상처 클립을 배치 후, 그들이 안전한지 만들기, 다시 스테이플을 공략하기 위해 집게를 사용합니다. 더 안전 t그는 클립 절개가 치유되기 전에 적은 확률 쥐 그들을 당겨 것입니다. </li><li> 면봉 10 % povidone의 요오드 솔루션 및 이동성이 (보통 1~2시간 마취 후, 유도 30-45 분되는 폐쇄까지 총 수술 시간) 복원되기 전까지는 가정 케이지와 모니터로 쥐를 반환로 잘라 절개. 이때 쥐가 식민지 실로 반환될 수 있습니다. 일주일 뒤에, isoflurane 마취하에 스테이플 리무버 도구 스테이플을 제거하십시오. </li><li> 다음 쥐에서 사용하기 전에 모든 계기의 팁 표면이 멸균을 위해 고온 비드 살균기를 사용하십시오. 계측기는 더 이상 15 초 동안 비즈에 열중해야하거나, 그들이 처리하기에는 너무 멋져 될 수 있습니다. 다른 동물에 사용하기 전에 계측기가 완전히 냉각되어야한다. </li></ol> 8. 회복 <ol><li> 그것은 쥐가는 병변에 따라 일 이내에 발작 활동을 나타내는 것이 가능합니다. 두뇌 지역에서 이와 같은 식품 소비 또는 촉진제와 같은 손상된 다른 행동을 따라oming가 영향을받을 수 있습니다. 그것은 동물들이 회복 기간 동안 건강하게 유지되도록하기 위해 매일 모니터링하는 것이 중요합니다. 같은 액체 음식, 높은 칼로리 음식, 또는 추가적인 진통제와 같은지지 치료가 필요할 수 있습니다. 마취로 인한 사망률은 5 %보다 일반적으로 더 적은 쥐의 낮은 비율로 발생합니다. 다른 원인에 의한 사망률은 (감염, 출혈) 극히 드뭅니다. 마취 회복 후 조난당한 흔적은 향후 연구에서 제외할 원인이 있지만, 극히 드문 있습니다. 그것이 예상대로 그림 4는 수술 다음 처음 며칠 동안 체중 감소를 묘사 수 있습니다. 체중은 1 주일 이내에 반동한다. </li></ol> 9. 대표 결과 일주일 이상 NMDA 주입 후 병변은 cresyl-보라색 counterstain 및 brightfield 현미경을 사용하여 시각이 될 수 있습니다. 두뇌는 0.1M PBS와 froz 30 %의 자당에 equilibrated 얼음 차가운 4 % paraformaldehyde로 perfused한다ko 페이지를 참조하십시오. 그들은 그때 1시 6분부터 1시 12분까지 일련의에 30-60 μm의에서 슬라이스와 표준 cresyl 바이올렛 counterstain을 진행하기 전에 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 장착해야합니다. 병변은 &quot;대머리&quot;또는 병변에 따라 세포 사망으로 인한 얼룩을 감소 cresyl 보라색의 영역에 해당한다. 인물 5A와 B가 어쩌구와 CEA의 대표 병변을 보여줍니다. 이 영상은 고해상도 스캔 (1200 DPI)와 평판 스캐너를 사용하여 얻은 것입니다. 병변을 시각화하기 위해서는 잃어버린 병변을 찾을 수 있도록 대상 지역을 둘러싸고있는 조직의 많은 부분을 통해 일련의 counterstain하는 데 도움이됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> 1 그림. Stereotaxic 설정.이 그림은 분류와 관련된 부분의 쥐 stereotaxic를 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> 그림 2. 쥐 SKU에 Bregma와 람다하겠습니다.이 그림은 bregma와 람다의 위치를 묘사. 모든 좌표는 bregma에 상대적으로 측정합니다. 람다는 두개골 수준인지 확인하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> 그림 3. stereotaxic 좌표를 읽음으로써.이 그림은 표준 stereotaxic 반응을 보이는 모습. 소수점 자리의 왼쪽에 자리를 얻으려면 오른쪽에있는 마커를 사용합니다. 표시된 숫자는 수만 장소 (= 10, 2 = 20 즉, 1)에 해당합니다. 표시된 숫자 사이의 해시 자국은 하나의 단위 (1-9)에 해당합니다. 제로 라인 stereotax가 설정되는 정수로 나타냅니다. 여기 제로 라인 읽기 10과 11 사이에 나타내는, 10 및 11 마커 사이입니다. 소수점 자리의 오른쪽에있는 숫자를 확인하려면 왼쪽에있는 마커를 사용합니다. 왼쪽의 해쉬 표식이에서 한 단위 차이를 나타내는 각각의 레이블이 지정되지 않은 해시와 함께 0으로 10 숫자로 표시되어거기에 그 옆에. 오른쪽 해시 부호 최고 최대의 왼쪽 라인에서 해시 마크의 제일 좌표 판독의 첫 소수점 자리를 나타냅니다. 여기서 숫자 오른쪽 해시 부호 최고 최대 9 줄의 왼쪽 대응에 대한 해시 마크는 소수점 자리는 9하도록합니다. 마지막 독서는 10.9 mm입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> 4 그림. 수술 후 체중 변화.이 그래프는 stereotaxic 수술을 받았습니다 쥐 (N = 17)의 평균 (± SEM)에 무게를 보여주는 또는 (N = 6) 수술을하지 않았습니다. 데이 0 외과 날입니다. 수술 후, 쥐의 무게는 수술 후 2-3 일동안은 감소 후 5-6 일 주위에 증가했다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> 그림 5. Excitotoxic 병변 예제.)이 이미지는 cresyl 보라색가 &quot;대머리와 30 μm의 코로나 슬라이스에 counterstain 보여줍니다basolateral 편도의 NMDA 병변의 자리는 &quot;. 흰색 화살표가 병변을 설명합니다. 그것이 더 병변 중심 핵 편도니다. B)과 유사한 병변이없는 뇌 슬라이스의 contralateral 옆으로 비교할 수 있습니다.

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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+modulation+of+hippocampal+long-term+potentiation+under+stress+and+no-stress+conditions+in+basolateral+amygdala-lesioned+and+intact+rats.">Bidirectional modulation of hippocampal long-term potentiation under stress and no-stress conditions in basolateral amygdala-lesioned and intact rats.</a> J. Neurosci. 25, 7393-7400 (2005).</li><li>Bhatnagar, S., Vining, C., Denski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chronic+stress-induced+changes+in+hypothalamic-pituitary-adrenal+activity+by+basolateral+amygdala.">Regulation of chronic stress-induced changes in hypothalamic-pituitary-adrenal activity by basolateral amygdala.</a> Ann. N.Y. Acad. 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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기서 제시 stereotaxic 방법은 NMDA의 주입을 통해 특정 뇌 영역의 excitotoxic 병변을 허용합니다. 기본 stereotaxic 방법은 사이트에 특정한 방식으로 pharmacological 및 생물 학적 에이전트 다양한 달이다하기 위해 적용할 수 있습니다. 또한 뇌 아틀라스 12 그들 stereotaxic 좌표에 의해 정의된 뇌 영역의 다양을 대상으로 적용할 수 있습니다. 같은 생쥐 등 다른 수종에 대한 적응은 작은 동물을 위해 만...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> N-메틸-D-아스파르트산 98% </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td> 듀얼 랩 표준 Stereotaxic w/45 있길. 귀 바 </td><td> Stoelting </td><td> 51,653 </td><td> 다른 공급 업체 : Kopf주의 *주의 : 여러 공급 업체로부터 구매하는 경우 st​​ereotaxic 액세서리의 호환성을 보장 </td></tr><tr><td> 10μl SYR 특수 (* / * / *) </td><td> 해밀턴 </td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td> Dremel 모토 도구 </td><td> Stoelting </td><td> 58,600 </td><td> 다른 공급 업체 : Kopf </td></tr><tr><td> 초경 burs, handpiece HP, 사이즈 2 </td><td> Schein 치과 </td><td> 2,284,578 </td><td></td></tr><tr><td> 6 주사기 프로그램 Stoeltingmable 펌프 </td><td> Stoelting </td><td> 53,140 </td><td> 다른 공급 업체 : Kopf </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 316의 피하 정기 벽 튜빙 30 게이지 0.0123 &quot;OD X 0.00625&quot;ID X 0.003 &quot;장성 (주입 바늘) </td><td> 소형 부품 </td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20 튜브 (주입 튜브) </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 클립, 9mm, 비 멸균 </td><td> 켄트 과학 주식 회사 </td><td> INS500346 </td><td> 다른 공급 업체 : 파인 과학 도구 </td></tr><tr><td> 9mm 클립 목표 클립 Applier </td><td> 켄트 과학 주식 회사 </td><td> 12031-09 </td><td> 다른 공급 업체 : 파인 과학 도구 </td></tr><tr><td> 곡선 하트맨의 hemostat </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 13003-10 </td><td></td></tr><tr><td> 런던 포셉 </td><td> 파인 Sceince 도구 </td><td> 11080-02 </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> 2 % chlorhexidine 용액 </td><td> Allivet </td><td> 30,159 </td><td> 다른 공급 업체 : PetSolutions </td></tr><tr><td> 10 % povidone의 요오드 용액 </td><td> CVS </td><td> SKU # 739575 </td><td></td></tr><tr><td> 핫 비드 살균기 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 610,183 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비의 표.

stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat

설치류 동물과 인간을 포함한 포유류에서 많은 행동 기능이 이산 뇌 영역에 의해 주로 매개된다. 행동이나 다른 실험 결과에 대한 다양한 뇌 영역의 안목 기능을위한 일반적인 방법은 함수의 지역화된 절제를 구현하는 것입니다. 인간에서 지역화된 뇌 병변과 환자 집단은 종종 손상된 영역의 기본적인 기능을 드러내는 희망으로 결손을 위해 공부하고 있습니다. 설치류에서, 하나는 실험적으로 특정 뇌 영역의 병변을 일으킬 수. 장애는 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 전해 병변은화된 손상을 일으킬 수 있지만 세포 유형의 다양성뿐만 아니라 병변 사이트 가까이 될 일이 다른 뇌 영역에서 선법 섬유를 손상시킬 것이다. 셀 타입의 특정 발기인을 사용하여 유전자 기술은 또한 특정 사이트 타겟팅을 설정할 수 있습니다 Inducible. 이 기술은 대상 뇌의 영역에 따라 복잡하고 항상 실용적 아닙니다. Excitotstereotaxic 수술을 사용 oxic 병변은 대조적으로, 지역 glial 세포를 손상하거나 섬유 선법없이 흥분성의 뉴런을 lesioning 가장 신뢰할 수 있고 실용적인 방법 중 하나입니다. 여기서는 excitotoxin, basolateral 편도의 복합에 N-메틸-D-aspartate (NMDA)의 stereotaxic 주입을위한 프로토콜을 제시한다. 해부 학적 징후를 사용하여, 우리는 타겟 뇌 영역의 위치를​​ 확인하고 바로 목표 위 장소에 주사 바늘을 내리고 stereotaxic 좌표를 적용합니다. 그러면 인근 뉴런의 excitotoxic 죽음 그 결과 두뇌에 우리 excitotoxin을 불어 넣다. 선택이 우리의 실험 대상이 생쥐는 있지만, 같은 방법은 장비와 좌표에서 적절한 조정으로 다른 포유 동물에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 basolateral 편도 1-6, 다른 편도의 핵 6, 7, 해마 8, 엔트 포함한 뇌 영역의 다양한 사용될 수 있습니다orhinal 피질 9 전두엽 피질 10. 그것은 또한 바이러스성 벡터 1, 11와 같은 생물 학적 화합물을 불어 넣다하는 데 사용할 수 있습니다. 기본 stereotaxic 기술은 또한 흥미 화합물에 더 오래 노출되어서 있도록 더 영구적인 삼투 펌프의 주입을 위해 적응 수 있습니다.

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Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

stereotaxic 좌표를 사용하여 excitotoxin의 주입에 의한 특정 뇌 영역의 타겟으로 절제 (들)은 설명되어 있습니다. 이 기술은 또한 쥐의 두뇌로 다른 화학 물질의 주입을 위해 적응 수 있습니다.

성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.2K 조회수.  University of California Berkeley. stereotaxic 좌표를 사용하여 excitotoxin의 주입에 의한 특정 뇌 영역의 타겟으로 절제 (들)은 설명되어 있습니다. 이 기술은 또한 쥐의 두뇌로 다른 화학 물질의 주입을 위해 적응 수 있습니다.

비디오: Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

행동 신경 과학에 대한 설치류 Stereotaxic 수술과 동물 복지 성과 향상

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

연구

신경과학

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).