이 작품은 과학의 부에 의해 지원 되었다 및 기술 부여 MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, 국립 건강 연구소 부여 NHRI-EX106-10429NI, 및 추천된 지역 연구 센터 프로그램 부여 뇌 연구 센터, 대만에서 국립 양 밍 대학 교육부의 박사 친목 부여 MOST106-2811-B-010-031 (S. Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 및 MOST106-2811-B-010-030 (헤-영 규 과장).

여기에 설명 된 동물 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회의 국립 양 밍 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 신생아 강아지 Stereotaxic 장치에 대 한 소유자의 준비
<ol><li>머리 트레이 만들기: 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (길이 15 m m)의 하단 튜브의 벽의 1/5를 제거 하 여 신생아 강아지의 머리에 맞는 모양으로 잘라.</li>
	<li>피 펫 팁 상자 stereotaxic 기구의 받침대와 맞는 적당 한 크기와 고 상단 덮개를 제거. 머리 트레이 단계 1.1 및 뜨거운 용 해 접착제로 팁 쟁반의 기지에 조직 포함 카세트에 부착 조직 포함 카세트의 높이 7 m m, 머리 고정 위치에서 강아지의 목과 시체를 지 원하는 데 사용 되는입니다.</li>
	<li>표준 stereotaxic 장치에 전체 설치를 넣습니다.</li>
</ol>2. 30 G 주입 스테인리스 바늘의 준비
<ol><li>전 3 일 동안 클로 프롬에서 그들을 몸을 담글 하 여 30 G 주사기 바늘을 청소.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 신중 하 고 천천히 당겨 바늘 화학 후드에서 폴 리 프로필 렌 그것의 허브에서.</li>
	<li>20 분 50 rpm에서 통에 70% 에탄올 린스 3 × 10 분 뒤 절대 에탄올과 바늘을 씻어. 사용까지 바늘 공기 건조, 그리고 청소 바늘 실 온 (RT)에서 깨끗 한 상자에서 저장을 하자.</li>
</ol>3. Microinjection 튜브 어댑터 준비
<ol><li>PE10 폴 리 에틸렌 튜브 (PE10 튜브) 30g 주사 바늘에 microliter 주사기를 연결 합니다. 브리징 microliter 주사기와 주사 바늘에 대 한 PE20 폴 리 에틸렌 튜브 (PE20 튜브) 어댑터를 준비 합니다. 어댑터의 사용 때문에 필요, PE10 튜브의 직경 26 G microliter 주사기의 바늘의 그것 보다 훨씬 작습니다.</li>
	<li>Microliter 주사기에 대 한 튜브를 준비: PE20 튜브 5 cm와 미리 청소 30g 주사 바늘을 연결 하 고 인스턴트 접착제로 접합 인감. 이 튜브 어댑터는 재사용 가능한. 참고: microinjection 주사기의 바늘 30 G 이면 준비 (3.1 단계) 및이 어댑터의 사용 (단계 3.3) 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>Microliter 주사기 (10 µ L) (3.1 단계에서 준비) 튜브 어댑터를 연결 합니다.</li>
	<li>PE20 튜브 어댑터의 30 G 바늘에 (더 이상 60 cm) PE10 튜브의 한쪽 끝을 연결 합니다. PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 새로운 30 G의 주사 바늘을 탑재 합니다.</li>
</ol>4. 부하 압력가 증류수, 염료와 바이러스 Microinjection 튜브
<ol><li>Microliter 주사기의 플런저를 제거 합니다. 25 G 주사기를 사용 하 여 로드 microliter 주사기 및 압력가 증류수는 배관에서 공기를 제거 하는 연결 된 PE 튜브.</li>
	<li>플런저 microliter 주사기를 다시 놓고 배럴에 증류수 남아 2 µ L까지 플런저를 밀어. 양의 증류수 2 µ L 보다 낮은 되 게 하지 마십시오.</li>
	<li>신중 하 게 마이크로 흐름 속도 주사기 펌프에 microliter 주사기를 탑재 합니다.</li>
	<li>적은 양의 0.1% 빠른 녹색 염료 (0.9% 식 염 수에 준비와 0.22 μ m 필터 필터링)와 parafilm 조각에 바이러스 액체 플라스틱</li>
	<li>Microinjection 튜브에 체액의 흐름을 테스트 하려면 30 G 주입 바늘과 튜브에 필터링 된 빠른 그린의 0.7 µ L을 로드 하 여 다음 PE10 튜브 사이 공기 방울이 볼 수 있도록 공기의 작은 금액을 철회 한다.</li>
	<li>또 다른 작은 양의 바이러스 액체 microinjection 튜브에 로드 하 여 다음 두 번째 공기 거품을 만들기 위해 공기를 철회 한다.</li>
	<li>연결 하 고 30 G microinjection 바늘 stereotaxic 기구의 팔을 확보.</li>
</ol>5입니다. 저체온증에 의해 신생아 쥐의 마 취
<ol><li>라텍스 장갑 소매에 강아지를 놓고 5 분 목까지 얼음에 몰두 합니다.</li>
	<li>되도록 그의 철수 응답 집게로 강아지의 발을 꼬집어.</li>
	<li>라텍스 장갑 소매와 강아지를 머리 트레이에 놓고 저 체온 마 취에 대 한 차가운 유지에 라텍스 슬리브 주위 일부 얼음을 넣어.</li>
	<li>가능 하면 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 강아지의 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
</ol>6입니다. microinjection
<ol><li>70% 에탄올으로 깨끗이 stereotaxic 악기를 닦아 하 여 불 임 수술을 준비 합니다. 70% 에탄올에 그들을 immersing 하 여 외과 기구를 소독.</li>
	<li>70% 에탄올과 강아지의 머리를 제거 하십시오. 두개골에 랜드마크 람다를 찾아서 람다 마커 펜으로 표시 합니다. 람다에 바늘 끝을 조 준 하 고 0으로 이전 후부 (AP) 및 중간 옆 (ML) 좌표를 설정 합니다.</li>
	<li>대상 사이트의 대상 사이트의 X 및 Y 좌표에 따라 주입 팔을 이동 합니다. 출생 후 하루 (P) 2의가 대 한 강아지, 좌표는: AP, 람다; 앞쪽 +2.4 m m ML, ± 1.0 mm; 중간에서 측면 등-복 부 (DV), 두개골에서 −1.7 m m. 펜으로 PE10 관에서 빠른 녹색 염료의 위치를 표시 합니다.</li>
	<li>30g 주사 바늘 아래로 천천히 두개골, 피부를 통해 침투 하 가져오고 두개골의 표면에서 멈출 때까지 다음 바늘 팁을가지고. 0으로 DV 좌표를 설정 합니다.</li>
	<li>내릴 30 G 주입 바늘 천천히 대상 사이트의 DV 좌표에 도달할 때까지. 실질 정상적인 모양을 다시 시작 수 있도록 1 분 기다립니다. Microinjection 프로그램 (100 nL/min)를 실행 합니다.</li>
	<li>빠른 녹색 염료의 마크는 바이러스 액체 두뇌에 주입 되도록 PE 튜브에 움직이는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>Microinjection, 종료 후 1 분 동안 대기 그리고 다음 천천히 그리고 점진적으로 30 DV 깊이의 1/2 높이에 바늘을가지고 s. 30 후 s, 천천히 강아지의 머리에서 바늘을 철회.</li>
	<li>모든 타겟된 사이트의 microinjections는 완료 될 때까지 단계 6.2 6.7를 반복 합니다.</li>
</ol>7. 강아지의 포스트 외과 복구
<ol><li>33 ° C 배양 기에 20 분 동안 강아지를 따뜻한. 강아지 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 저 체온 마 취 매 5 분에서에서 강아지의 복구를 확인 하십시오.</li>
	<li>강아지는 완 치 후에을 다시 강아지를 반환 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice.">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li><li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+development+of+brain+circuits.">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li><li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neurodevelopmental+disease.">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li><li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+circuits,+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders.">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li><li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference.">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo.">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c.">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neostriatal+mosaic:+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia.">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas.">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구에서 신생아 마우스 두뇌가 AAV 바이러스 주입에 대 한 간단 하 고 안정적인 stereotaxic 방법을 보여 줍니다. 우리는 p 2에서 Ai14 기자 쥐가 AAV eGFP Cre 바이러스 microinjected 하 고 P14에서 리포터 유전자 발현 분석. 우리는 AAV 불리고 GFP-긍정적인 세포가 rostrocaudal 수준에 걸쳐 발견. 또한, 거의 모든 GFP-긍정적인 세포 공동 tdTomato 기자 유전자 striatal 셀에 제안 하는 성공적인 Cre loxP DNA 재조합 AAV 중...

현대 연구의 구조와 뇌의 기능 일반적으로 신경 세포에 특정 유전자의 유전자 조작이 필요합니다. 다른 유전자, 돌연변이 체 대립 유전자를 포함 하 여 운반 하는 유전자 변형 마우스의 기능을 녹아웃와 대립 노크에서 정기적으로 생성. Stereotaxic 뇌 수술 성인 설치류에 대 한 로컬 설치류 두뇌1,2의 특정 지역에 약물, 바이러스, 추적기 및 다른 시 약을 제공 하는 표준 방법입니다. 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술을 적용 한 유전자 조작 유전자 기능과 마우스 뇌의 특정 신경 인구에 신경 활동을 허용 합니다. 셀 형식 관련 조작 두뇌3,,45의 복잡 한 신경 회로에 신경 기능을 해독 하는 강력한 접근 방식을 제공 합니다.
신 경계의 신경 개발 초기 배아 단계에서 시작 하 고 개발 프로세스 청소년 기간까지 출산 후 계속. 신경 시스템의 출생 후 성숙 뇌6의 생리 및 인지 기능을 위한 필수적인 신경 회로의 정확한 시 냅 스 배선 포함 되어 있습니다. 따라서, 신생아 시간 윈도우에서 발생 하는 개발 이벤트를 공부 뿐만 아니라 정상적인 신경 발달을 이해 하는 데 중요 하지만 neurodevelopmental과7 정신병 무질서의 병 인에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. ,8. 성인 설치류 stereotaxic 뇌 수술의 방법으로는 쉽게 사용할 수 있는2,9, 비록 몇 가지 프로토콜 신생아 쥐10,11stereotaxic 뇌 수술에 대 한 인터넷에서 사용할 수 있습니다. 사실, 신생아 마우스 새끼의 두뇌에 약의 stereotaxic microinjections는 어렵다, 신생아 강아지의 머리는 너무 연약한 표준 stereotaxic 장치에 고정 하기 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술의 응용 프로그램은 신생아 쥐12가능 합니다. 여기, 우리가 만든 설치 신생아 마우스 새끼 stereotaxic 뇌 수술을 수행 하는 간단한 방법 설명. 이 기술은 허용 하나 조건부로 AAV 표현 Cre DNA recombinase 기자 진 마우스와 조건에 따라 floxed 유전자 변형 쥐가 microinjecting floxed 유전자 삭제를 보여 줍니다. 이 기술은 또한 야생-타입 마우스의 신생아가에 시 약을 제공에 적용 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1134">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">30G PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 305106</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:273px;">JT Baker</td>
			<td style="width:199px;">9180-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Hamilton MICROLITER Syringe</td>
			<td style="width:273px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:199px;">80300</td>
			<td style="width:395px;">30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE10</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Micro Flow Rate Syringe Pump</td>
			<td style="width:273px;">Longer Precision Pump Co.</td>
			<td style="width:199px;">TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">25G syringe</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 302105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Fast green</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">F-7252</td>
			<td style="width:395px;">0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Standard Stereotaxic Instruments</td>
			<td style="width:273px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:199px;">68037</td>
			<td style="width:395px;">Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-FOXP2 antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab16046</td>
			<td style="width:395px;">Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-RFP antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab65856</td>
			<td style="width:395px;">Mouse monoclonal to RFP, 1:1K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">BX63 microscope</td>
			<td style="width:273px;">Olympus</td>
			<td style="width:199px;">BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">LSM 880 confocal microscope</td>
			<td style="width:273px;">Zeiss</td>
			<td style="width:199px;">LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594</td>
			<td style="width:273px;">Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:199px;">111-585-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:273px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:199px;">AV-9-PV1848</td>
			<td style="width:395px;">Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.chicken actin-eGFP</td>
			<td style="width:273px;">AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td>
			<td style="width:199px;">N/A</td>
			<td style="width:395px;">1x1014 (GC/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:269px;">B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">007914</td>
			<td>Ai14</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">026259</td>
			<td style="width:395px;">Foxp2fl/fl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:273px;">Corning&#160;cellgro</td>
			<td style="width:199px;">21-030-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains

많은 유전자는 미 발달 머리에 표현 하 고 그들 중 일부는 지속적으로 출생 후 뇌에 표현. 이러한 지속적으로 표현한 유전자에 대 한 그들은 발달 과정 및 신생아 두뇌의 생리 기능을 조절 하 작동 수 있습니다. 두뇌에 있는 특정 유전자의 neurobiological 기능 조사, 두뇌에서 유전자를 비활성화 필수적 이다. 여기, 우리 신생아 시간 창에서 유전자 변형 생쥐의 고가에 유전자 발현을 비활성화 하는 간단한 stereotaxic 방법을 설명 합니다. AAV eGFP Cre 바이러스는 출생 후 하루 (P) stereotaxic 뇌 수술에 의해 2에서 Ai14 기자 유전자 쥐가 microinjected 했다. TdTomato 기자 유전자 발현 P14가, 성공적인 Cre loxP 중재 DNA 재조합 AAV 불리고 striatal 셀에 제안에 발견 되었다. 우리는 더 AAV eGFP Cre 바이러스 P2Foxp2fl/플로리다 쥐로 microinjecting에 의해이 기술을 검증. GFP의 Foxp2 더블 라벨 GFP-긍정적인 세포 Foxp2 immunoreactivity P9가, AAV-eGFP-Cre 불리고 striatal 셀에서 Foxp2 단백질의 손실을 제안에 부족을 보여주었다. 함께 찍은, 이러한 결과 floxed 유전자 변형 생쥐의 신생아 두뇌에 있는 특정 신경 인구에 있는 stereotaxically microinjected AAV eGFP Cre 바이러스에 의해 효과적인 유전자 삭제를 보여 줍니다. 결론적으로, 우리의 stereotaxic 기술 신생아 마우스 두뇌에서 유전자 조작에 대 한는 쉽고 간단한 플랫폼을 제공합니다. 기술만 사용할 수 없는 신생아 두뇌의 특정 지구에 있는 유전자를 삭제 하 하지만 또한 사용할 수 있습니다 약물 약물, 신경 추적기, 유전자 변형된 optogenetics 및 chemogenetics 단백질, 신경 활동 지표를 삽입 하 고 신생아 마우스 두뇌의가에 다른 시 약.

실험의 첫 번째 집합에 대 한 우리 200 microinjected AAV9.hSynapsin.HI.eGFP Cre.WPRE.SV40 바이러스 (AAV-eGFP-Cre, Dulbecco의 버퍼링 인산 염 분에 1/10 희석) Cre DNA recombinase 표현의 nL Ai14 쥐의 P2가 GFP 융합. Ai14 마우스 loxP 형벌 (floxed) 정지 카세트 (그림 2F)의 Cre 중재 삭제 시 tdTomato 취재 원 유전자를 표현 한다. 두뇌는 GFP와 tdTomato의 immunostaining에 대 한 P14에서 수확 했다. ...

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Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

우리는 신생아 마우스 두뇌의가에 microinjecting 시 약에 대 한 수 제 머리 고정 장치 stereotaxic 수술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 신생아 마우스 두뇌의 특정 영역의 신경 세포에서 유전자 조작 가능

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K 조회수.  National Yang-Ming University. 우리는 신생아 마우스 두뇌의가에 microinjecting 시 약에 대 한 수 제 머리 고정 장치 stereotaxic 수술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 신생아 마우스 두뇌의 특정 영역의 신경 세포에서 유전자 조작 가능

비디오: Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

행동 신경 과학에 대한 설치류 Stereotaxic 수술과 동물 복지 성과 향상

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

연구

신경과학

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

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행동 신경 과학에 대한 설치류 Stereotaxic 수술과 동물 복지 성과 향상

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성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

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마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작

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광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰