이 작품은 NIH (R01NS064288)와 크레이그 H. Neilsen 재단 FZ의 보조금에 의해 지원되었다.

1. Coverslips, 문화 매체, 및 소화 효소의 작성 <ol><li> 12-mm 라운드 # 1 유리 coverslips이의 연결을 문화를 위해 사용됩니다. 10 % HCL은 하룻밤 사이에 3 회 (20 분 / 시간)에 증류수와 탈이온수와 초음파 세척을 다음과 coverslips가 청소됩니다. 청소 coverslips는 향후 사용을위한 70 %의 에탄올에 저장됩니다. 각 실험 전에 coverslips는 공기가 문화 판으로 건조와 배치됩니다. </li><li> 코트에 마른 coverslips, 100 μg / ML 폴리-D-라이신 및 10 μg / ML Laminin 작업 솔루션을 포함하는 코팅 용액을 100 μl은 각 coverslip 위에 추가되고 문화 판은 37 ° C 배양기로 전송됩니다. 1-2 시간 후에 코팅 용액이 제거되고 coverslips는 무균 1X PBS로 3 회 씻어하고 있습니다. </li><li> 문화 매체, 최소 필수 중간 (MEM)를 준비하는 것은 5퍼센트 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 1X-스트렙토 마이신 솔루션 (penicil 500 단위로 보충된다린 및 스트렙토 마이신 500 μg), 1X GlutaMAX - 나 보충 및 antimitotic의 시약은 20 μm의를 포함하는 5 - 플루오로 -2 - deoxyuridine 및 20 μm의 유리딘 (FDU / R). 혈청이없는 배지의 경우 FBS가 보충 B27로 바뀝니다. </li><li> collagenase이 솔루션은 1 밀리그램 / ML의 작동 농도를 만들기 위해 collagenase에게 MEM과 분말을 해소하여 준비가되어 있습니다. 트립신은 1X TrypLE 익스프레스가 사용됩니다. </li></ol> 2. 성인 마우스 DRG의 신경의 해부와 수확 <ol><li> 6 euthanizing 후 - 10 주 된 성인 마우스로, 지느러미 피부를 제거하고 전체 척추를 잘라. 1 X PBS ~ 3 배로 제거된 척추 씻으십시오. </li><li> 복부 측면까지와 해부 접시에 제거된 척수 열을 핀과 조심스럽게 해부 현미경으로 감각 신경을 폭로하기 위해 근육을 제거합니다. 목재 수준에서 DRGs에 연결된 신경을 찾아낼 두꺼운하​​고 쉽습니다. 따라서 대부분의 실험을위한 요추에만DRGs가 수확됩니다. </li><li> 작은 가위로 중심선을 따라 각 척추골로 잘라 조심스럽게 척추 디스크를 제거합니다. 척수를 노출 각 척추골을 분할하기 위해 집게를 사용하여. </li><li> 목재 DRGs를 해부하려면 포셉 각 목재 용기를 들어 관련 허리 DRGs을 (L1에서 L6까지) 찾습니다 척수쪽으로 추적. </li><li> 첨부 말초 신경, 스프링 가위로 지느러미와 복부 뿌리에서 각 DRG를 자르면 얼음에 위치 MEM 매체와 microfuge 튜브에 저장합니다. 다른 척수 수준 (예 : 흉부 DRGs)에서 더 많은 DRGs는 유사한 방법으로 필요한 경우에 해부를 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 소화와 성인 마우스 DRG의 신경 세포의 분리 <ol><li> 모든 해부 DRGs를 수집 후, 1 ML의 collagenase 솔루션 MEM 미디어를 교체하고 90 분 동안 37 ° C에서 microfuge 튜브를 품어. </li><li> 그래서 500 μl 1X TrypLE 익스프레스와 collagenase 용액 교체37 lution하고 품어 ° C에서 15-20 분. </li><li> TrypLE 익스프레스 솔루션을 제거하고 3 회 1 ML 준비한 배지 (5 % FBS를 포함)로 DRGs 씻는다. </li><li> 600 μl 배지를 추가하고 부드럽게 한 ML 파란색을 사용하여 20-30 회 조직을 씹다 아래로까지 피펫 및 피펫 팁은 졸업했습니다. </li><li> 분쇄 후 비 dissociated 조직은 microfuge 하단으로 정착하고 10 ML 멸균 튜브에 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다. 또 600 μl 배지를 추가하고 대부분의 조직은 dissociated 때까지 분쇄 단계를 반복하십시오. 얻은 세포 현탁액은 뉴런과 비의 연결 세포가 모두 포함되어 있습니다. 대부분의 경우, 6 DRGs (~ 5 x10 4)에서 세포 하나 electroporation 반응에 사용됩니다. </li></ol> 4. Electroporation을 통한 신경 세포의 유전자 조작 <ol><li> 의 DNA plasmids (~ 10 μg으로 마우스 뉴런에 대한 Amaxa의 nucleofection 솔루션을 혼합하여 transfection 솔루션을 준비) 나 siRNA를 oligos이 (~ 0.2 nmol) 각 transfection 100 μl의 최종 볼륨을 만들 수 있습니다. </li><li> 상온에서 7 분을위한 680 rpm으로 dissociated 세포를 원심 분리기, 그리고 가능한 한 많이 뜨는 버리고. 준비된 transfection 솔루션을 추가하고 부드럽게 다시 중단 전지 200 μl 피펫 팁으로 3-4 회를 아래로 피펫합니다. </li><li> electroporation의 cuvette에 transfection 솔루션과 혼합 세포 현탁액을 전송하고 Amaxa Nucleofector 시스템 프로그램 G-013을 사용하여 세포를 electroporate. </li><li> electroporation 후 즉시 사전 예열 500 μl를 추가 (37 ℃) cuvette하여 원하는 세포 밀도에 코팅된 배양 접시에 모든 솔루션 (~ 600 μl)를 전송에 FBS를 포함한 배지. 다시 정지하고 다시 도금을 필요로 실험 내용은 뉴런은 고밀도 (10000-20000 세포 /도)에서 플라스틱 배양 접시에 직접 배양해 있습니다. 직접 축삭의 성장을 검사 실험 내용은 뉴런은 도금 ont 있습니다낮은 밀도 (3000-5000 세포 / 음)로 코팅된 유리 coverslips을 O. 배양기 (37 ° C에서 5 % CO 2)에 문화 접시를 놓습니다. </li><li> 뉴런은 기판에 부착했을 때 도금 후 네 시간은 부드럽게 500 μl 신선하고 사전 예열 문화 매체와 문화 매체 (Amaxa의 nucleofection 솔루션을 포함) 교체, 그리고 (37 ° C에서 추가적인 문화를 위해 배양기에 플레이트를 반환 , 5 %) 2 공동. FBS를 포함하는 두 문화 매체 또는 혈청이없는 매체는이 단계에서 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 축삭의 성장 분석을위한 Culturing 성인 DRG 뉴런 <ol><li> 의 DNA plasmids으로 transfected 뉴런 들면, 유전자의 - 관심의 표현 (예 EGFP) electroporation 후 몇 시간 일찍 볼 수 있습니다. siRNAs로 transfected 뉴런의 경우, 우리는 일반적으로 내생 단백질의 충분한 파괴를 허용하도록 3~4일 기다립니다. 교양 뉴런은 직접 vario에서 축삭의 성장 분석에 해결할 수 있습니다우리에게 시간은 포인트 (1-4일 electroporation 이후)하거나 다시 중단 및 축삭 regrowth를 (아래) 분석을 다시 도금. </li><li> RNAi - 중재 손실 기능 연구의 경우 교양 뉴런이 다시 정지 수 있으며 axons은 타겟 단백질이 이미 소진되는 뉴런에서 regrow 수 있도록 다시 도금. 이렇게하려면 문화 판에서 연결된 뉴런을 다시 정지를 6-10 번 1 ML 미리 예열 신선한 매체와 피펫 부드럽게 위아래로 고밀도 교양 뉴런의 옛 문화 매체를 교체하십시오. 이외의 연결을 세포 (예 Schwann 세포) 뉴런보다 문화 접시에 많은 어깨를 첨부하기 때문에 다시 중단 전지는 주로 뉴런 있습니다. </li><li> microfuge 튜브로 다시 정지 뉴런을 전송하고 부드럽게 단일 세포 현탁액으로 세포 대단히 짧은 시간을 다시 떼어 놓다하기 10-15 번 씹다. </li><li> 저밀도 (3000-5000 세포 / 음)과 문화를 하루아침에 새롭게 준비 coverslips쪽으로 재 판 다시 dissociated 뉴런 (16-24 시간). </li></ol> 6. 고정, Immuno-염색법과 형광 이미징 <ol><li> 매체를 대기음하고 실온 15-20 분 세포를 해결하기 위해 4 % paraformaldehyde (PFA) (물론 200 μl /)를 추가합니다. 고정된 세포 그러면 3 회 대한 1X PBS로 씻어 있습니다. </li><li> PBS를 대기음하고 실온에서 60 분 대한 고정 뉴런에 차단 솔루션 (1 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100, 및 1X PBS에 2.0 % 정상 염소 혈청)을 추가합니다. </li><li> 라벨 axons에게, 뉴런 안티 neurofilaments 또는 방지 βIII tubulin 항체와 immuno-묻은입니다. 이렇게하려면 각 coverslip에 대한 parafilm에 대한 일차 항체 용액 (-βIII의 tubulin 항체에 대한 1:1200 희석)의 30μl 방울을 넣으십시오. coverslips를 반전하고 실온에서 60 분 동안 일차 항체 용액에 넣어. </li><li> 원래 문화 판에 coverslips 반환하고 3 번을 1X PBS로 그들을 씻는다. </li><li> 보조에 대해 동일한 절차를 반복합니다tibody. </li><li> 3 회 동안 증류수로 coverslips 씻어 다음 마운팅 솔루션 (예 : 골드 Antifade을 연장)와 함께 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li><li> 스테인드 뉴런은 디지털 카메라가 설치된 모든 형광 현미경 시스템과 몇 군데하실 수 있습니다. 축삭의 길이는 측정 및 이미징 분석 소프트웨어로 분석된다. </li></ol> 7. 대표 결과 모든 부가 세포 성장 인자의 부재에서, 성인 DRG의 뉴런은 보통 첫번째 도금 후 axons 48 시간 재배를 시작합니다. axons은 종종 측쇄 morphologies를 (그림 1)를 보여줍니다. 대조적으로 다시 도금 뉴런은 도금 후 axons에게 단 몇 시간을 연장하기 시작하고 axons는 훨씬 줄어들 분기 (그림 2)와 함께 연장하다. 이러한 결과는 다시 도금 뉴런은 에어컨 lesioned 뉴런의 사람들에게 유사한 속성을 공유하는 것이 좋습니다. 이 접근법을 사용함으로써, 우리는 최근 수행한 손실에게의 기능은 체외 연구에서 성인 DRG 뉴런의 축삭의 성장에서 축삭 재생 관련된 전사 인자 C-6월의 역할을 검토합니다. 결과는 C-6월의 다른 지역 (ON-TARGETplus) 대상으로 4 개의 siRNAs의 그룹의 electroporation은 현저하게 (그림 3) 삼일 transfection 후 성인 DRG의 뉴런에서 9 C-6월의 단백질 수준을 감소했다. 9 :; C-6월의 최저의 뉴런에서 뉴런들이 다시 도금 및 교양 있었다 하룻밤, 축삭의 성장이 크게 (262.32 ± 15.69 μm의, 그림 3시-C-6월 348.37 ± 16.21mm 제어) 감소했다. 이러한 결과는 그 교양 성인 DRG의 뉴런은 성인 뉴런의 축삭의 성장을 공부하는 유용한 모델 시스템을 제공 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> 그림 1. 성인 마우스 DRG의 뉴런은 3 일 동안 저밀도에서 배양해. 뉴런은 안티 물들일되었습니다 - 식사와 침대ETA, III의 tubulin 항체. 대부분 axons는 측쇄 morphologies 표시합니다. 스케일 바 : 125 μm의. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> 그림 2. 문화 3 일 후에 신경을 DRG 다시 도금 성인 마우스. () 성인 DRG의 뉴런은 3 일 동안 고밀도로 배양해. (B) 재 도금 성인 DRG의 뉴런은 하룻밤을위한 저밀도에서 배양해되었다. 대부분의 축삭은 작은 축삭 분기와 길쭉한 morphologies를 표시합니다. 스케일 바 : B에 A와 125 μm의 250 μm의 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> 그림 3. 체외에서 성인 DRG의 신경 세포의 축삭의 성장에 C-6월의 역할. C-6월 siRNAs의 electroporation 후 뉴런을 DRG 성인 마우스에서 C-6월의 () 서양 얼룩 분석. 그 결과 C-6월의 현저하게 감소 수준을 보여줍니다. (B) EGFP로 transfected 제어 뉴런은 다시 도금 및 야간 문화 후에도 긴 axons 자랐습니다. (C) 공동 트랜스C-6월 siRNAs하고 다시 도금 및 야간 문화가 후에 성인이 DRG 뉴런에서 EGFP 장애의 축삭의 성장 fection. 빨간색 : Tuj-1 염색법, 녹색 : EGFP. 스케일 바 : 125 μm의. 이러한 결과는 Saijilafu 외 년에 출판되었습니다. 9.

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	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

성인 DRG의 뉴런 이렇게 어른 동물로 축삭 재생을 연구하는 유용한 시스템을 제공 robustly 생체내 및 시험 관내에서 말초 신경 손상 후 자신의 axons을 다시 생성. 성인 DRG의 신경 세포의 체외 배양에서 분자 메커니즘을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이되고있는 작품 축삭 재생이 규제된다. culturing 성인 마우스 DRG 뉴런의 체외 프로 시저에 현재 재생 축삭 성장의 신속하...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> 폴리-D-라이신 브롬화 수 소산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5 - 플루오로 -2 - deoxyuridine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> 유리딘 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 로슈 </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE 익스프레스 </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> GlutaMAX - 나 (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> 유리 coverslips (# 1) </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24도 세포 배양 플레이트 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040 - 이력서 </td></tr><tr><td> 멸균, 증류수 및 탈이온수 </td><td> Mediatech </td><td> 25-055 - 이력서 </td></tr><tr><td> 마우스 뉴런 Nucleofector와 electroporation 키트 </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> C-6월에 대한 ON-TARGETplus siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> 안티 - βIII tubulin 항체 (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> 골드 Antifade 마운팅 솔루션을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

이곳은 중추 신경계 (CNS)에서 성숙한 뉴런이 성숙 CNS의 1,2의 축삭의 성장과 적대적인 환경을 지원하는 줄었 본질적인 기능으로 인해 부상 후 자신의 axons을 다시 생성 수 없다고 알려져있다. 반대로, 말초 신경 계통의 성숙한 뉴런 (PNS)는 부상 3 후 즉시 재생. 성인 지느러미 루트 신경절 (DRG) 뉴런이 잘 말초 신경 부상 후 robustly 재생하는 것으로 알려져 있습니다. 주변 목표 및 척수쪽으로 뻗어 있고 중앙 지점 innervating 말초 지점 : 각 DRG 신경 세포는 세포 소마의 어느 지점이 axonal 가지로 하나 축삭을 자랍니다. 실질적인 축삭 재생의 DRG 주변 axons 결과의 부상은 척수 중앙 axons 반면 부상 이후 저조한 재생. 주변 axonal 부상 척수 부상 (프로세스 조절 장애라고도 함), 중앙 axons의 중생 이전에 발생하는 경우에는 greatl입니다y는 4 개선. 또한, DRG 뉴런의 중심 axons은 척수에 corticospinal의 axons 내림차순 같은 적대적인 환경을 공유할 수 있습니다. 함께, 그것은 성인 DRG의 신경 세포의 축삭 재생을 제어하는​​ 분자 메커니즘은 CNS의 축삭 재생을 향상시키기 위해 무력화 할 수있는 가상있다. 그 결과, 성인 DRG의 뉴런은 현재 폭넓게 재생 축삭의 성장은 5-7 공부를 모델 시스템으로 사용됩니다. 여기에서 우리는 체외에서 축삭 재생의 유전 연구에 사용할 수있는 성인 DRG 신경 세포 문화의 방법을 설명합니다. 이 모델의 성인에서는 DRG의 신경 세포는 유전자 electroporation-매개 유전자 transfection 6,8 통해 조작됩니다. DNA를 플라스미드 또는시 / shRNA, 이러한 방식은 성인 DRG의 뉴런의 축삭의 성장에있는 유전자의 이익의 역할을 조사하기 위해 모두 이득과 손실 함수 실험을 수있는 뉴런을 transfecting함으로써. 뉴런은시 / shRNA으로 transfected 때, 타겟 내생 단백질입니다일반적으로 손실 기능 연구가 덜 효과​​적으로 만드는, 시간 강력한 축삭의 성장 이미 문제가 발생한 기간 동안 문화 3-4일, 후에 고갈. 이 문제를 해결하기 위해서 여기 설명한 방법은 axons가 타겟 단백질의 부재에있는 뉴런에서 다시 성장할 수 있도록 transfection 후 다시 중지하고 다시 도금 단계가 포함되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 성인 DRG 뉴런 9 축삭의 성장을 중재로 축삭 재생 - 관련 유전자, C-6월의 역할을 공부 체외 모델에서 이것을 사용하는 예제를 제공합니다.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

<em&gt; 체외에서</em교양 성인 마우스 지느러미 루트 신경절의 신경 세포를 사용하여 축삭 재생의 유전자 연구&gt; 모델이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 조작을받은 뉴런의 축삭의 재 성장을 허용하는 re-suspension/re-plating 단계를 포함합니다. 이 방법은 RNAi 기반의 단백질 분해를 사용하여 축삭 재생의 손실 기능 연구에 특히 유용합니다.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine.  체외에서 모델이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 조작을받은 뉴런의 축삭의 재 성장을 허용하는 re-suspension/re-plating 단계를 포함합니다. 이 방법은 RNAi 기반의 단백질 분해를 사용하여 축삭 재생의 손실 기능 연구에 특히 유용합니다.

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

연구

신경과학

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomy 허리 지 루트 신경 절의 액세스 및 돼지에 주입

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

등갈 뿌리 신경절 대식세포의 신속한 절연

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...