우리는 기술 지원에 대 한 제시카 Goldshteyn 감사합니다. 노래 랩에서 일 NIH 그랜트 R00NS088211, 그리고 지적 및 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 새로운 프로그램 개발 수상에 의해 자금이 다.

1입니다. 문화 접시와 병의 준비
<ol><li>포도 주스 한 천 배지 준비<ol>
<li>비 커와 일시적으로 agar 완전히 녹아 때까지 저 어 약 4-5 분 동안 전자 레인지에 한 천 분말, 200ml 포도 주스와 192 mL ddH2O 10 g를 추가 합니다.</li>
		<li>약 60 ° c 솔루션 진정 연기 후드, 4.2 mL 95% 에탄올과 4.0 mL 빙 초 산을 추가 합니다. 잘 ddH2오 믹스 400 mL에 솔루션의 전체 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>각 35 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 약 2-3 mL를 추가 합니다. 400 mL 포도 주스 한 천 해결책의 총 약 120-150 번호판을 확인 합니다.</li>
		<li>진정 하 판이 고 공고히 한 솔루션 10 분 기다립니다. 한 천 배지 각자 밀봉된 애 가방에 포도 주스를 포장 하 고 나중에 사용할 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drosophila 문화 병의 준비<ol>
<li>블레이드를 사용 하 여 초파리 문화 병의 1 개의 벽에 1.5 c m 측면 길이 삼각 구멍 펀치와 환기에 대 한 면의 2-2.5 cm 직경 공 구멍을 채우십시오.</li>
		<li>효 모 반죽의 0.5 c m3 에 대 한 보충 포도 주스 한 천 배지와 병을 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 초파리 애벌레의 수집
<ol><li>성인 파리의 십자가를 설정합니다<ol>
<li>장소 10 처녀 암컷과 5 남성 성인 문화 병 포도 주스 한 천 배지와 연결에 함께 난다.</li>
		<li>병 바닥까지 25 ° C에서 되도록 놓습니다 포도 주스 한 접시에 알을 낳는 것 이다 파리. 하루에 적어도 한 번 효 모 반죽과 접시를 변경 합니다. 균질 성 발달 단계의 애벌레의 수확을 허용, 2-h 컬렉션 기간에 대 한 20 개 이상의 처녀 여성 및 10 남성 2.1.1 단계에서 시작 합니다.</li>
		<li>0.5% 프로 산 성 솔루션에 배어와 젖은 조직, 예를 들어 60 mm 페 트리 접시에 25 ° C에서 격판덮개 문화. 산소 흐름을 차단 하지 않습니다 있도록 조직 정렬. 참고: 프로 산 솔루션 접시에 습도 유지 하 고 곰 팡이의 성장을 피하기 위해 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>특정 나이의 애벌레를 수확<ol>
<li>효 모 반죽 없이 새로운 포도 주스 한 접시에 원하는 단계, 예를 들어 2nd 3rd 탈피 애벌레 (AEL) 누워 계란 후 48-72 h에 애벌레를 전송 집게의 쌍을 사용 합니다.</li>
		<li>누 룩에서에서 제거 애벌레의 피부 하 여 레이저 axotomy 및 이미징 효 잠재적인 방해에서 방지 하기 위해 새로운 접시에 주변 탐색 합니다. 또는, PBS의 접시에 그들을 세척 하 고 티슈 페이퍼의 조각에 잠시 건조 하 여 애벌레 청소 철저 하 게.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 2-광자 부상과 Confocal 영상
<ol><li>현미경 설치 참고: 두 광자 레이저 스캔 현미경 confocal 레이저는이 실험을 위해 사용 되었다 하지만 해당 설치 다른 시스템도 충분 합니다. 두 광자 레이저 (930 nm) 부상과 아르곤 레이저를 전달 하기 위해 사용 되었다 (488 nm) GFP의 confocal 영상을 위해 사용 되었다.<ol>
<li>각 세션의 시작 부분에서 2 광자 레이저 / confocal laser(s)와 현미경 설정. 이미징 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>930에서 2 광자 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 2 광자 부상, nm (1950 mW).<ol>
<li>라인 스캔 모드를 선택 합니다. 줄곧 pinhole을 엽니다. ~ 20%에 레이저 강도 증가 (390 mW).</li>
			<li>프레임 스캔으로 512 x 512를 선택 합니다. 최대 스캐닝 속도 (일반적으로 0.77 µs에 픽셀 유지 시간)를 사용 합니다. 평균 수는 1 비트 깊이 8 비트 확인 합니다.</li>
			<li>하 ~ 750, 고 0 오프셋 설정된 얻을.</li>
			<li>2 P GFP 930 제거를 쉽게 허용으로 실험 프로토콜 재사용 미래에이 사전 설정 저장 실험.</li>
		</ol>
</li>
		<li>488에 아르곤 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 confocal 영상, 대 한 뉴 멕시코:<ol>
<li>인수 탭 그리고 Z-스택을 선택 합니다.</li>
			<li>"레이저"에서 488 nm의 아르곤 레이저의 전원을 켭니다.</li>
			<li>채널선택 488 m m 레이저, 레이저 파워 5-10%를 증가 이동 합니다. Pinhole에 대 한 1-2 공기 단위 (AU)를 사용 합니다. 650에 이득을 조정 합니다.</li>
			<li>획득 모드에서 프레임 스캔으로 1024 x 1024를 선택, 최대 검색 속도, 2의 평균 수 8 비트의 비트 심도 사용 하 여.</li>
			<li>GFP 이미징이 미리 설정된 실험 프로토콜을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>애벌레 마 취 diethyl 에테르와 장착<ol>
<li>증기 두건에서 15 cm 플라스틱 페 트리 접시에에서 60-m m 유리 접시를 놓습니다. 배 고 누워 유리 접시의 바닥에 휴지 조각 다음 조직에 포도 주스 한 접시를 놓습니다. 유리 그릇에 휴지가 젖 었는 접시에 남아 있는 액체 에테르의 레이어는 포인트 diethyl 에테르를 추가 합니다. 항상 뚜껑을 유지.</li>
		<li>준비 halocarbon의 한 방울을 유리 슬라이드 중앙에 27 오일. 4 관광 명소는 coverslip 지원 슬라이드의 네 모퉁이에 진공 그리스의 추가 합니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 청소 유 충 데리 러와 60 m m 유리 접시에 한 접시에 그것을 배치. 유리 접시의 뚜껑을 커버 하 고 유 충 이동 중지 될 때까지 기다립니다. PNS 부상/이미징, 유 충을 꺼내 꼬리 중지 꿈 틀 자 마자. CNS에 대 한 전체 애벌레 움직이지 않는, 될 때까지 기다릴 특히 머리 세그먼트. 참고: 에테르 노출의 타이밍은 중요 합니다. 토론을 참조 하십시오.</li>
		<li>신중 하 게 마 취 유 충을 선택 하 고 슬라이드에 halocarbon 오일 방울 머리 똑바로 장소. 슬라이드 위에 coverslip을 추가 합니다. 부드러운 압력을 사용 하 여 때까지 유 충 (그림 1A)를만 지는 coverslip에 밀어.</li>
		<li>그는 신경/축 삭/모 수석의 현미경 렌즈에 가까운 위쪽에 왼쪽 이나 오른쪽, 애벌레를 향해 coverslip을 부드럽게 눌러 유 충의 위치를 조정 합니다.</li>
		<li>모두는 tracheas 표시 되도록 PNS 부상, 유 충 등 사이드를 탑재 합니다. 다음 클래스 III 다 신경 축 삭 (그림 1B 및 1 C), 클래스 4 다 신경 축 삭 (그림 1B , 1E), 부상에 대 한 90도 또는 ~ 30 클래스 IV 다 신경 모 수석 (부상도 부상에 대 한 왼쪽 유 충 ~ 30도 롤 그림 2A)입니다.</li>
		<li>CNS 상해에 대 한 관심의 영역이 z-평면에서 현미경 렌즈에 가장 가까운 되도록 완벽 하 게 복 부 쪽 (그림 3A), 수 유 충을 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>두 광자 레이저에 의해 부상<ol>
<li>현미경 애벌레와 슬라이드를 놓고 무대에서 슬라이드 홀더를 가진 장소에서 안전 합니다. 유 충을 찾을 수 (0.3 없음) X 10 사용 하 여 목적.</li>
		<li>coverslip에 객관적인 오일 1 방울을 추가, (1.3 없음) X 40으로 전환 목표는 초점을 조정 하 고.</li>
		<li>스캔 모드를 전환 하 고 실험 프로토콜 2 P GFP 930 절제를 다시 사용 합니다. Pinhole 줄곧 열 다는 것을 확인 하십시오. 참고: 구성 해야 최적화 개별 시스템에 기반으로 합니다.</li>
		<li>(ROI), 관심 영역을 찾으려고 라이브 모드를 시작 하 고 적절 한 확대와 좋은 이미지 품질을 달성 하기 위해 설정을 세부적으로 조정할. 참고:이 단계의 목적은 최고의 품질의 이미지를 복용 하는 것 보다는 신경/축 삭/모 수석, 다치게 하 찾는 것입니다. 따라서, 최소한의 설정 대상 영역을 시각화 하기 위해 충분 한를 사용 하 여 노출 과도 또는 photobleaching를 피하기 위하여.</li>
		<li>자르기 단추를 사용할 수 있게 됩니다 있도록 라이브 검색을 중지 합니다. 스틸 이미지는 로드맵 역할을 하자. 자르기 기능을 선택 하 고 스캔 창 부상 될 대상에 초점을 조정 합니다.</li>
		<li>상해의 예비 사이트의 크기를 투자 수익을 줄일 수 있습니다. 예를 들어 그냥 축 삭 또는 상해의 정밀도 보장 하 고 주변 조직에 손상을 줄일 수 있는 모 수석의 폭을 커버. 필요한 경우 확대 투자 수익에 자르기 전에 더 정확한 부상에 대 한 허용 합니다.</li>
		<li>새로운 이미징 창을 엽니다. 스캔 속도 감소 시키고 레이저 강도 증가 한다. 라이브 모드에서 스캔 조직 형광 신호에 따라 레이저 강도 증가 결정 합니다.</li>
		<li>일반적으로, PNS 부상에 대 한 25% 및 VNC 부상에 대 한 50-100%에서 시작 하는 2 광자 레이저 강도 설정 합니다. PNS 축 삭 상해에 대 한 레이저 강도 ~ 480 mW 및 픽셀 인지 확인 유지 시간 8.19 μ s 이다. VNC 축 삭 상해에 대 한 레이저의 강도 및 픽셀 유지 시간은 일반적으로 965-1930 년 mW 8.19 32.77 µs, 각각 확인 합니다.</li>
		<li>연속 스캔을 시작 합니다. 연속 단추를 가리키면 커서를 둡니다. 이미지에 주의깊게 감시 하 고 형광에 있는 급격 한 증가 관찰 하자마자 검사를 중지 합니다. 참고: 형광 스파이크의 모양을 부상 사이트에 자동 형광 때문 이다.</li>
		<li>설정을 다시 사용 하 여 라이브 모드로 다시 전환 합니다. 그냥 초점을 조정 하 여 대상 관심 영역을 찾아. 참고: 성공적인 상해의 좋은 표시는 작은 분화구, 고리 모양의 구조, 또는 부상 사이트에서 지역화 된 파편의 외관 이다.</li>
		<li>다음 뉴런에 이동 하 고 반복 단계 3.3.5, 하나의 동물에 여러 신경 손상에서. 또는 점차적으로 증가 하는 힘 및 초기 부상 충분 하지 않은 경우 검사 속도 줄이는 동안 3.3.5 단계를 반복 합니다. 참고: 경우에는 레이저 파워는 너무 높은, 큰 손상된 영역 표시 됩니다 후 부상 라이브 스캔 이미지에. 너무 많은 부상 유 충의 죽음을 일으킬 수 있습니다.</li>
		<li>신중 하 게 제거 하는 coverslip 고 부상된 유 충 효 모 반죽과 새로운 접시에 전송 유 충을 복구 합니다. 집게;와 한 접시에 여러 동굴을도 랑 또는, 전체 접시 접시 밖으로 크롤 링 하는 유 충의 가능성을 줄이기 위해 사용 하는 대신 접시에 한 천의 섬을 확인 합니다.</li>
		<li>젖은 조직 (0.5% 프로 산 솔루션 젖 었)와 문화 실내 온도 또는 25 ° C에서 60 mm 페 트리 접시에 접시를 넣어 참고: 유 충 약 25 ° c.에에 비해 실 온 (22 ° C)에서 추가 일에 대 한 애벌레 단계에 유지 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이후 부상 confocal 영상<ol>
<li>이미지 마 취와 다음 confocal 레이저 이미징 단계 3.2에서 장착의 동일한 절차를 사용 하 여 유 충을 준비 하 여 원하는 시간 지점에서 부상된 유 충. 참고: 이미지 확인 axonal 상해 상해 (AI) 후 24 시간 및 48 h AI (클래스 4 다 신경) 또는 72 h 재생을 평가 하기 위해 AI (클래스 III 다 신경) 유 충.</li>
		<li>10 X 목표를 사용 하 여 유 충을 찾아 (0.8 없음) X 25로 전환 후 목표. GFP 이미징실험 프로토콜을 다시 사용 합니다.</li>
		<li>라이브 버튼을 클릭 하 고 이전 부상 같은 뉴런을 찾을.</li>
		<li>라이브 검색 창에서 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 설정 합니다. 중지를 Z 스택 이미지를 얻으려고 시작 실험 을 클릭 합니다. 참고: 재생의 정량화가 가능한 이미지를 캡처할 때 정규화 지점 (축 삭 수렴 지점) 포함 되어 있는지 확인 (그림 1D, 1 층)-이 설명 데이터 분석 섹션에서 추가.</li>
		<li>전환 이미지 처리하, 촬영, 이미지를 선택 하 고 최대 강도 투영을 생성. Z-스택 및 최대 강도 프로젝션 이미지를 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>처리 하 고 이미징 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 이미지를 계량.</li>
	<li>PNS에서 축 삭 재생의 정량화<ol>
<li>재생 비율, lesioned 했다 모든 axons 중 축 삭 재생의 %는 계산 합니다. 으로 부상 사이트 넘어 regrows 재생성으로 축 삭을 점수.</li>
		<li>측정 재생 길이, 축 삭 길이 증가입니다. ImageJ로 측정, 세그먼트 선 도구를 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 추적 하 고 분석 메뉴에서 측정값 을 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 대표 하는 라인의 길이.</li>
		<li>정규화 된 축 삭 길이 증가 재생 지를 계산 합니다. 참고: 축 삭 길이 셀 바디와 수렴 하는 지점 (DCAC)-축 삭 길이/DCAC (그림 1D 및 1F) 축 삭 사이의 거리에 의해 정규화 됩니다. 이 값 애벌레 스케일링은 어떤 axonal 성장에 대 한 계정을 수 있습니다. 양수 값 재생, 0 의 값은 아무 재생 나타내고 음수 값은 철회.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모 수석 중생의 정량화<ol>
<li>재생 비율, 다 신경 절단 하는 모든 사람들 사이에서 %는 분명 모 수석 자라나 표시를 계산 합니다. 참고: 모 수석 자라나는 경우 새로운 긍정적인 dendrites 철회 수지상 줄기에서 및 부상 사이트 넘어 밖으로 regrow로 점수입니다. 부상 사이트 결정 랜드마크로 그리고 어떤 경우에, 잔여 상해 유도 autofluorescence 쉽게 표시.</li>
		<li>지 포인트의 증가, 부상 후 새로운 모 수석 분기 포인트의 추가 계산 계산 합니다.</li>
		<li>총 모 수석 길이 증가, 부상 후 추가 된 모든 새로운 모 수석의 누적 길이 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CNS 축 삭 재생의 정량화 참고: 병 변 사이트는 처음으로 지점 몇 군데 (그림 3B)에 변성을 보여줍니다, 그것은 재생 길이 속도의 분석에서 포함 될 것입니다.<ol>
<li>측정 재생 길이regrowing 축 삭의 길이입니다. 참고: 단일 병 변 사이트의 regrowing 축 삭 부상 전에 원래 축 삭 경로 원본으로 식별 됩니다.</li>
		<li>Normalized 재생 길이, 재생 길이 commissure 세그먼트-commissures ("Y" 그림 3A 와 3B) 사이의 경도 거리의 길이를 정규화를 계산 합니다. 참고:이 값 애벌레 크기 차이의 효과 대 한 올바른 수 있습니다.</li>
		<li>재생 속도, 재생 했다 lesioned, 특정 유전자 형의 재생 능력을 반영 하기 위해 모든 세그먼트 사이 세그먼트의 %를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+axon+regeneration+in+Drosophila.">Models of axon regeneration in Drosophila.</a> Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).</li><li>Hao, Y., Collins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+for+axon+regeneration:+insights+from+injured+axons+in+Drosophila.">Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822 (2004).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals.">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy:+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling.">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85, 1244-1256 (2015).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Buss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+and+phosphacan+are+present+in+the+astroglial+scar+after+human+traumatic+spinal+cord+injury.">NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury.</a> BMC Neurol. 9, 32 (2009).</li><li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar.">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Tsai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+low-budget+laser+axotomy+system+to+study+axon+regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans.</a> J Vis Exp. , (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

플라이를 설정 넘어, 여성 및 남성 사용의 수는 genotypes 및 특정 실험에 필요한 애벌레의 수에 따라 달라질 수 있습니다. WT 파리에 대 한 일반적인 크로스 10 여성 5 남성을 사용합니다. 컬렉션 창 애벌레 나이 요구의 정확도 따라 축소 수 있습니다. 예를 들어 2-h 컬렉션 기간 더 균질 인구의 애벌레를 얻을 것입니다. 이 경우에, 20 또는 더 처녀 여성을 사용 하 여 십자가를 설정 도움이 됩니다 충분 한...

후 중앙 신경 시스템 (CNS)에 부상 환자, 영구 장애 발생할 수 있습니다 및 또한 신경 퇴행 성 질환1,2에에서 돌이킬 수 없는 신경학 상 적자에 역할을 다시 생성 하는 축 삭의 무 능력 ,3,,45. CNS 환경 뿐만 아니라 본질적인 성장 능력 뉴런의 축 삭 외상 후 재생성 수 있습니다 여부를 결정 합니다. 세포 외 요인 oligodendrocyte, astroglial, 및 fibroblastic 소스에서 신경 성장4,6,7,8, 하지만 이러한 분자의 제거를 방해 하 보였다 만 제한5돋 아 수 있습니다. 본질적인 재생 신호 재생 성공5,9 에 영향을 미칠 수 있습니다 잠재적인 치료 목표를 대표 하지만 이러한 프로세스는 분자 수준에서 아직도 분명 하지. 영양 요소 신호 또는10Pten 인산 가수분해 효소 등 생 브레이크의 제거 증가 axonal 재생 특정 상황에서 발생할 수 있습니다. 개별적으로 효과적인 것으로 발견 하는 다른 방법의 조합 또한만11,12,,1314날짜 제한 전체 복구를 제공 합니다. 따라서, 타겟된 치료에 대 한 추가 경로 식별 하는 절망적 인 필요가 있다. 뿐만 아니라 자라나는 축 삭의 개시 여부와 축 삭 다시 올바른 대상, 개혁 시 냅 스 특이성, 와이어 및 달성 하는 방법 기능 복구 중요 한 의문점이 있습니다.
요약에서 기계 지시 된 축 삭 재생의 현재 이해는 매우 단편적인 여전히. 문제의 일부는 축 삭의 기술적인 어려움 포유류 실시간 재생, 소모, 비용과 수행 대규모 유전 스크린에 도전 하는 방식. 초파리 melanogaster, 다른 한편으로, 복잡 한 생물 학적 질문의 연구에 대 한 매우 강력한 시스템을 입증 했다. 과일 파리 유전자를 정의 하 고 신호 통로 기 막히게 인간에서 보존 하는 수단이 되었으며 인간의 조건, 광대 한 분자 유전학 도구를 통해 신경 퇴행 성 질환 등의 연구에 대 한 성공적인 모델 되었습니다. 유전자 기능15조작에 사용할 수 있습니다. 특히, 초파리 신경 상해 및 자라나15,16에 관련 된 유전자의 발견에 대 한 이상적인 도구가 될 여겨진다. 성인 머리 또는 애벌레 복 부 신경 코드 (VNC) 찌르는 바늘, 애벌레 VNC 또는 집게, 애벌레 신경 레이저 axotomy, 후 각 수용 체 신경 제거, 뇌 explants 부상, 신경 호감을 포함 한 몇 가지 비행 신경 상해 모델 개발 되었습니다. 그리고 날개 퇴직금15,17,18,19,20,21,,2223여 주변 신경 병 변. 최근 작품 활용 초파리 부상 모델 excitingly, 세포와 유전자 경로 일부는 포유류24에에서 보존 될 표시 되었습니다 신경 부상에 대응 하는 신 경계에 의해 사용에 대 한 우리의 이해 고급 ,25. 다시,이 신경 선의 소설 메커니즘을 식별에 대 한이 모델 생물의 유틸리티를 강조 한다.
여기에 설명 된 2-광자 초파리 애벌레 감각 신경 상해 레이저 기반 모델이 이다. 두 광자 레이저 zebrafish에서 vivo에서 200326에 축 삭을 처음 사용 되었다. 같은 해, 첫 번째 레이저 dendriotomy 초파리 27펄스 질소 레이저 사용 하 여 수행 했습니다. 잠시 후, 여러 선 충 C. 실험실 축 삭 재생28의 모델을 확립 펨 레이저를 사용 합니다. 2007 년, 우 동료 비교 및 선 충 C. 레이저29의 다양 한 종류에 의해 유도 된에서 레이저 부상 간의 차이점을 보고. 2010 년에 축 삭 재생 레이저 axotomy 후 처음 초파리30에 표시 했다. 이 광범위 한 레이저 부상 문학에 건물, 우리는 개발 조직 이웃의 최소한의 섭 동으로 대상된 사이트에 상해의 정확한 유도 허용, 2-광자 레이저를 사용 하 여 비행 신경 상해 모델 상대적으로 깨끗 한 제공 단일 셀 해상도와 neuroregeneration의 기본 및 외부 속성을 공부 하는 시스템. 특히, 우리 모두는 말 초 신 경계 (PNS)에서 수지상 arborization (다) 감각 신경에 대 한 부상 메서드의 집합 설정한 및 CNS. 다 신경 그들의 모 수석 분기 복잡성에 의해 주로 구별 4 가지 종류로 분류 될 수 있다: 431종류 I. 우리의 출판된 일 다 신경 재생 phenotypic 및 분자 수준에서 포유류 부상 모델 유사한 보여준다: 다 신경 클래스 4와 클래스 특정 재생 속성을 표시 하지만 나 III 다 신경 재생을 전시 하지 클래스는 PNS; 클래스 4 다 신경 축 삭 주변에 견고 하 게 다시 생성 하지만 그들의 재생 잠재력은 따라서 닮은 포유류; 지 루트 신경 절 (DRG) 신경, CNS에서 극적으로 감소 Pten 통해 mTOR 활동 강화 삭제 또는 Akt overexpression 비행19CNS 축 삭 재생 향상. 이 부상 모델을 활용 하 여 우리 유전 스크린을 수행 되 고 있다 식별 RNA 가공 효소 Rtca 축 삭 재생을 위한 진화론 보존된 억제 요인으로 세포 스트레스 및 RNA 수정20 축 삭 상해를 연결 .
제시 패러다임에서 부상 애벌레 클래스 IV 또는 III 다 신경, ppk 권총-CD4-tdGFP 또는 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80에 의해 표시 된 각각의 레이저 axotomy/dendriotomy를 통해 유도 된다. 부상 (h AEL) 누워 계란 후 약 48-72 h에 3rd 탈피 애벌레를 2nd 에 수행 됩니다. PNS에 대 한 axotomy 병 변 세포 체, CNS axotomy ~ 20 µ m 직경, VNC에 commissure에의 지역 및 기본 수지상 브랜치 포인트에 dendriotomy에서 축 삭 ~ 20-50 µ m의 섹션 타겟팅 됩니다. 같은 신경은 부상 (AI) 완전 한 transection, 확인 후 8-24 h 고 48-72 h 재생을 평가 하기 위해 AI에서 몇 군데. 시간 경과 confocal 영상 통해 변성 및 부상 vivo에서 개별 axons/dendrites의 재생 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="919">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:444px;">Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:153px;">AC615080010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:444px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:155px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:153px;">59-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>97062-948&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar powder, Alfa Aesar, 500GM</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>AAA10752-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape juice</td>
			<td>Welch&#8217;s</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:153px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:444px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:444px;">Propionic Acid</td>
			<td style="width:155px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:153px;">U33007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:444px;">Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">12-544-D</td>
			<td>50 mm X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Zeiss LSM 880 laser scanning microscope</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Zen software</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:444px;">Chameleon Ultra II</td>
			<td style="width:155px;">Coherent</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system

손상 된 신경의 재 성장을 용량 신 경계 외상 후 neuroregeneration 및 복구 기능을 제어합니다. 지난 몇 년간 다양 한 내부 및 외부 억제 요인 축 삭 재생의 제한에 관련 된 발견 되었습니다. 그러나,이 금지 신호를 단순히 제거 추가 규제의 존재를 나타내는 성공적인 재생에 대 한 충분 하지 않습니다. 초파리 melanogaster, 과일 파리, 척추 동물, 인간을 포함 한와 진화론 보존된 유전자와 신호 경로 공유 합니다. 파리의 강력한 유전자 도구 상자를 결합 하 여 두 광자 레이저 axotomy/dendriotomy와 함께, 우리는 설명 여기 초파리 감각 신경-체계적으로 소설에 대 한 심사를 위한 플랫폼으로 수지상 arborization (다) 신경 상해 모델 재생 레 귤 레이 터. 간단히,이 패러다임) dendrite(s) 또는 axon(s) 2 광자 레이저, c) 라이브 confocal 영상 포스트 상해 및 d) 데이터 분석을 사용 하 여 애벌레, b) 병 변 유도의 준비를 포함 한다. 우리의 모델에는 단일 레이블된 뉴런, 축 삭, 및 주변 및 중앙 신경 시스템에의 잘 정의 된 신경 하위의 dendrites의 높은 재현성 부상 수 있습니다.

다 신경 클래스 특이성 뿐 아니라 주변 및 중앙 신경 조직 사이 잠재적인 차동 재생을 보여줍니다. 이 축 삭 재생 (를 사용 하 여 클래스 IV PNS 부상)로 (클래스 IV CNS 상해와 클래스 III PNS 부상) 재생에 대 한 금지는 그에 필요한 새로운 요소에 대 한 화면에 독특한 기회를 제공 합니다.
PNS에서 축 삭 재생
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A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

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A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

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9.6K 조회수.  The Children's Hospital of Philadelphia. 여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

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An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and physical exam alone, however the clinical presentation can vary greatly depending on the extent of injury, the patient's pain tolerance, etc. In patients with muscle injury or muscle disease, assessment of muscle damage is typically limited to clinical signs, such as tenderness, strength, range of motion, and more recently, imaging studies. Biological markers, such as serum creatine kinase levels, are typically elevated with muscle injury, but their levels do not always correlate with the loss of force production. This is even true of histological findings from animals, which provide a "direct measure" of damage, but do not account for all the loss of function. Some have argued that the most comprehensive measure of the overall health of the muscle in contractile force. Because muscle injury is a random event that occurs under a variety of biomechanical conditions, it is difficult to study. Here, we describe an in vivo animal model to measure torque and to produce a reliable muscle injury. We also describe our model for measurement of force from an isolated muscle in situ. Furthermore, we describe our small animal MRI procedure.

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo animal model of injury is described. The method takes advantage of the subcutaneous position of the fibular nerve. Velocity, timing of muscle activation, and arc of motion are all pre-determined and synchronized using commercial software. Post injury changes are monitored in vivo using MR imaging/spectroscopy.

생체내에</em수축 유도 부상 및 복구의 비침습 모니터링> 쥐 모델

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

연구

의학

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

마우스 Aortocaval 누관의 기술적 측면

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

A Repetitive Concussive Head Injury Model in Mice

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

마우스에 반복적 인 충격 포 헤드 손상 모델

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

마우스에서 가속 죽상 경화증의 유도: "와이어 부상" 모델

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

급성 폐 손상의 열기 기관 절개 위산 흡인 쥐 모델은 최대한 급성 치명적 폐 손상의 결과

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical hurdles such as invasive cell delivery and tracking with low transplantation efficiency remain challenges in translational stem-based therapy. This article describes an emerging technique for stem cell labeling and tracking based on the labeling of the mesenchymal stem cells (MSCs) with superparamagnetic iron oxide (SPIO)&#160;nanoparticles, as well as intranasal delivery of the labeled MSCs. These nanoparticles are fluorescein isothiocyanate (FITC)-embedded and safe to label the MSCs, which are subsequently delivered to the brains of TBI-induced mice by the intranasal route. They are then tracked non-invasively in vivo by real-time magnetic resonance imaging (MRI). Important advantages of this technique that combines SPIO for cell labeling and intranasal delivery include (1) non-invasive, in vivo MSC tracking after delivery for long tracking periods, (2) the possibility of multiple dosing regimens due to the non-invasive route of MSC delivery, and (3) possible applications to humans, owing to the safety of SPIO, non-invasive nature of the cell-tracking method by MRI, and route of administration.

Presented here is a protocol for non-invasive mesenchymal stem cell (MSC) delivery and tracking in a mouse model of traumatic brain injury. Superparamagnetic iron oxide&#160;nanoparticles are employed as a magnetic resonance imaging (MRI) probe for MSC labeling and non-invasive in vivo tracking following intranasal delivery using real-time MRI.

외상성 뇌 손상 뮤린 모델에서 비강 내 전달 후 MRI를 사용하여 수퍼 파라마그네틱 철 산화물 표지 메젠키말 줄기 세포 추적

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...