이 작품은 잭슨 연구소 암 센터 파일럿 그랜트와 메인 암 재단이 지원됩니다.

1. 프로토콜 <ol><li> 0.1 MG의 케타민과 체중 1g 당 xylazine의 0.01 밀리그램의 복용량에서 케타민과 xylazine으로 마우스를 마취. Carprofen (체중 1g 당 0.005 밀리그램)이 진통제에 사용되며, preoperatively 관리합니다. </li><li> 치과 드릴 비트를 포함하여 수술 도구, 모든 압력솥에 소독 증기 있습니다. 일괄 수술이 수행 할 경우, 수술 계기의 팁은 이후 수술 전에 유리 구슬 살균기 (정밀 과학 도구 FST 250)로 다시 소독해야합니다. </li><li> 마우스가 발가락 핀치에 대한 응답의 부재로 평가 마취의 수술 비행기를 도달되면, 그 다음 ~ 37 ° C.의 체온을 유지하기 위해 온수 패드에 배치되어있는면 패드에 위치 마취의 깊이는 수술 중에 자주 모니터링된다. </li><li> 모피는 대략 삼각 지역의 등쪽 머리 ~ nares에 꼬리 3mm에서 제거 CE에 caudally 연장됩니다rvical 척추. 안과 연고는 탈수와 염증에서 그들을 보호하기 위해 눈에 적용됩니다. </li><li> 마우스는 복부 recumbancy에 배치되고 피부 외과 요오드, 70 % 에탄올 및 멸균 면봉으로 소독합니다. 두개골의 전두엽과 정수리 뼈의 등 측면을 다루는 피부의 0.8 X 1.0 cm 플랩은 고급 가위를 사용하여 제거됩니다. </li><li> 국소 진통제, 0.5 % lidocaine은 상처 주변의 골막과 노출 된 조직에 로컬로 적용됩니다. 골막은 부드럽게 메스 블레이드 두개골을 스크랩에 의해 제거되며이 뼈를 준수 할 수있는 시아 노 아세틸렌 접착제를 도움이 될 것입니다. </li><li> 관심 대뇌 피질의 영역은 마커와 두개골에 설명되어 있습니다. 관심 지역은 기본 대형 선박의 손상을 방지하기 위해, 해골 봉합 라인을 통해 찾을 수 없습니다. </li><li> 시아 노 아세틸렌 접착제의 얇은 층을 제외하고 serosanguinous 유체의 누출을 방지하기 위해, 상처 여백에 적용하고, 두개골에있다관심 지역. </li><li> 라이트 - 활성화 치과 시멘트는 두개골을 봉인 위해 우리 프로토콜에서 사용됩니다. 치과 시멘트의 적용 전에 썼음를위한 지역을 제외한 모든 노출 된 두개골은 프리 머와 함께하고 이후에 빛을 활성화 치과 시멘트 키트에서 접착제로 처리됩니다. 본딩 에이전트가 건조되면, 빛 활성화 치과 시멘트는 두개골을 충당하기 위해 적용됩니다. 이후 수술 및 이미징을위한 마우스의 머리를 고정하려면, 살균 # 00-90 헥스 너트는 얇게 할 지역에서 거리에있는 치과 시멘트에 포함되어 있습니다. 빛 활성 치과 시멘트의 사용은 우리가 전체 절차를 완료하려면 서두를 필요없이 두개골을 준비 할 수 있습니다. 두개골에있는 치과 시멘트 준비가 완료되면, 치과 시멘트는 눈에 보이는 빛으로 치료합니다. </li><li> 치과 시멘트가 완치되면 stereotactic 장치에서 투구 홀더는 # 00-90 나사를 사용하여 마우스 머리에 진수 너트에 장착된다. </li><li> 박사룸 온도의 조합, 0.9 % 멸균 생리는 얇게 할 두개골 지역에 적용됩니다. stereomicroscope의 도움으로 고속 마이크로 드릴은 관심 지역 이상 (직경 일반적으로 ~ 4-5mm) 두개골의 원형 영역을 막을하는 데 사용됩니다. 드릴링 및 교련 지역 생리의 응용 프로그램은 기본 대뇌 조직에 열 손상을 방지하기 위해 썼음 절차를 수행하는 동안 간헐적으로 수행됩니다. 생리는 열을 흡수하고 또한 뼈를 부드럽게하는 데 도움이됩니다. </li><li> 마우스 두개골이 작은 구멍이 많은 뼈의 두꺼운 층을 sandwiching, 소형 뼈의 두 얇은 층을 포함한다. 소형 뼈와 해면질의 뼈 대부분의 외부 층은 드릴을 사용하여 제거됩니다. </li><li> 작은 구멍이 많은 뼈의 대부분이 제거 된 후, 해면질의 뼈 내에 남아있는 구멍이 드릴은 내부 소형 뼈 층을 접근을 나타냅니다, 해부 현미경으로 볼 수 있습니다. 이 단계에서, 두개골의 두께는 아직 50 개 이상의 μm해야합니다. 해골 시닝이 있어야합니다매우 얇은 (~ 20 μm)와 원활한 준비를 얻기 위해주의 깊게 계속했다. </li><li> 두개골의 원하는 두께가 (~ 20 μm) 달성되면 두개골이 먼저 약 10 분 동안 다이아몬드 페이스트로 맞춤 제작 한 실리콘 채찍 (6-15 μm)를 사용하여 연마합니다. 다이아몬드 붙여 넣기 연마는 두 목적을 제공합니다. 첫째, 더함으로써 기본 뇌 조직의 실수로 손상을 피 얇게 두개골에 압력을 적용하지 않고 두개골을 꺼야. 세밀한 주석 산화물은 더 두개골 연마에 사용되기 전에 둘째, 얇게 두개골에 대한 초기 연마 단계로 제공하고 있습니다. </li><li> 다이아몬드 붙여 넣기 연마 후, 얇게 두개골은 약 10 분에 대한 주석 산화물을 연마하고 있습니다. 두개골은 광택이되면 얇게 두개골은 깨끗 나타날 때까지, 주석 산화물은 식염수 거리에 플러시됩니다. </li><li> 두개골 창 생체 이미징에 세로 방향에 사용하는 경우이 단계에서, 청소 얇은 두개골 지역은 건조하고 있습니다. 맑은의 작은 드롭시아 노 아세틸렌 접착제는 두개의 창을 밀봉에 적용됩니다. 얇게 두개골과 coverslip 사이에 시아 노 아세틸렌 접착제의 층은 가능한 한 얇은해야합니다. </li><li> 주사이 단계에서 포트 두개 창 생성 후 수행 할 경우, 26 게이지 주사기 바늘은 광택이 얇은 두개골 창 한쪽에 작은 구멍을 만드는 데 사용됩니다. 이 오프닝은 GBM 세포 주입에 사용됩니다. </li><li> 직경 약 50 μm을 열 팁과 멸균 유리 피펫은 피펫을 끌어 당기는를 사용하여 당겨 있습니다. 이 피펫은 GBM 세포 주입에 사용되며, micromanipulator에로드됩니다. 피펫은 GBM 세포 주입 사이트가 최종 이미징 사이트에서 떠나있을거야 있도록 30도 각도로로드됩니다. 피펫의 팁은 해부 현미경 아래에서 제거됩니다. GBM 세포 현탁액은 주사기 펌프를 사용하여 흡입하여 피펫으로 전면로드됩니다. </li><li> 주입 피펫은 GBM 세포로로드되면 마우스가 일에서 돌아 이동전자 현미경. 주입 피펫은 두개의 창에있는 작은 오프닝으로 낮아 마지막 micromanipulator를 사용하여 개구를 통해 뇌에 삽입됩니다. GBM 세포 현탁액 1 μl은 뇌 표면의 두뇌 100-200 μm (: 0.1 μl / 분, 소요 시간 : 10 분 속도)에 주입된다. </li><li> 두개골은 건조하고 깨끗한 시아 노 아세틸렌 접착제의 작은 방울은 건조 두개골에 적용되며, 3 mm 크기의 # 1 coverslip의 한 부분이 얇고 광택이 두개골 지역을 준수하고 있습니다. coverslip과 인접한 치과 시멘트 사이의 공간은 시아 노 아세틸렌 접착제로 밀봉되어 있습니다. </li><li> 수술 후, 마우스는 1 ML 따뜻한 멸균 식염수에 피하 주입되어 완전히 마취에서 회복 될 때까지 체온을 유지하기 위해 보충 열을 제공했습니다. </li><li> 이미징를 들어, 마우스는 0.1 MG의 케타민과 체중 1g 당 xylazine의 0.01 밀리그램의 복용량에서 케타민과 xylazine과 anesthetized 있습니다. 마우스는 사용자 정의 stereotactic 프레임을 사용하여 고정 아르현미경으로. 생체 이미징의 반복이 매일 수행되는 경우 쥐의 케타민이 반복적 사용과 의존의 흔적을 보여줍니다로 isofluorane은 더 나은 옵션이 될 것입니다. </li></ol> 2. 대표 결과 성공적으로 포트 두개 창 수술은 두개골 창 개월 주 명확한 유지 할 수 있습니다. backscattered 빛을 사용하여 시각화 그림 1은 포트 두개 창 아래의 vasculature을 보여줍니다. 이 vasculature 이미지는 반복적 인 영상에 대해 동일한 뇌 영역의 위치를​​위한 랜드 마크로서 사용되었습니다. vasculature 내피 세포와 GBM 세포를 모두 시각화하기 위해, 우리는 B6.Cg-GT (로사) 26Sor tm9 (편대의 편대장-tdTomato와 혈관 내피 세포에 이름표를 B6.Cg-TG (테크-cre) 1Ywa / J 마우스, 교차 ) Hze / J 마우스, 그리고 붉은 색 형광 단백질 tdTomato으로 표시 혈관 내피 세포로 생성 마우스. 우리는 이러한 미의 포트 craniotomy 절차를 수행CE, 그리고 두개의 창 옆에있는 작은 오프닝을 통해 뇌에 GFP-라벨 GBM 세포를 주입했다. 우리는 주입 된 쥐에 길이 방향으로 두 광자 이미징 생체에서 수행. 레이저 여기 파장은 GFP 및 tdTomato 모두 여기에 결과 910 nm의에서 설정되었습니다. 두 광자 이미징은 동시 녹색 / 적색 형광 검출 기능을위한 두 탐지기로 맞춤식 두 광자 레이저 스캐닝 현미경에서 수행되었다. 그림 2는 vasculature 근처에 주입 GBM 세포에서 glioma의 개시의 생체 예에서 보여줍니다. 포트 두개 창은 또한 생체 이미징의 시간 경과 만성위한 훌륭한 선택이 될 것입니다. 그림 3 포트 수술없이 마우스 대뇌 피질의 섹션 GFAP 염색, 포트 수술 후 마우스 7 일 및 마우스 칠일 포트 수술 후 등을 보여줍니다 염분 주입. 이 이미지에서 마우스 해당 POR과 수술 및 마우스없이 드러난다TS 수술은 뇌에 침투하고 생리 주사를 피펫으로 인해, 생리 주사를 다음 반면, gliosis는 마우스의 뇌 세포에서 관찰되며, gliosis가 없습니다. 이러한 결과는 gliosis는 두개의 창은 여기에 설명 된 포트는 일반적으로 &quot;열린 머리&quot;만성 두개골 창에 연결된 gliosis로 연결되지 않는 독립적 인 검증을 제공하는 포트 두개 창에서 발생하지 않습니다 보여줍니다. 그림 4는 높은 해상도를 보여줍니다 포트 창은 또한 생체 영상의 고해상도을위한 훌륭한 선택입니다 시연 수지상 수술 당일에 동일한 마우스 (일 0)에서 쪽과 포트 창 생성 후 32일 (일 32)의 이미지. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig1.jpg" /> 그림 1. backscattered 빛을 사용하여 광택 및 강화 얇게 두개골 두개골 창문 vasculature의 시각화. 일 t를 나타냅니다<html> 수술 후 일 그 번호를, 이미지는 즉시 GBM 세포 주입 완료 후 수술 당일부터 촬영 된 것입니다. 규모 바 :. 0.5 mm가 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig2.jpg" /> 그림 2. 생체에 주입 GBM 셀 및 vasculature의 시각화. 테크 - Cre 및 ROSA26 편대의 편대장-tdTomato 모두를 들고 마우스는 GBM 세포 주입을 위해 사용되었습니다. 혈관 내피 세포는 tdTomato (빨간색)으로 표시했고, GBM 세포가 GFP (녹색)으로 표시되었습니다. 이미지는 GBM 세포 주입 후 24 시간을 시작 인수했다. 보기의 10-12 인접 분야의 총 촬영되었으며, 최종 이미지를 생성하는, 총 필드의 중심에서 확인 주입 GBM 세포와 함께 서로 인접 해 조립했다. 일 수술 후 일 수를 나타냅니다. 규모 바 : 100 μm.HREF = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_blank&quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig3.jpg" /> 그림 3. Gliosis는 포트 두개 창 수술 후 발생하지 않습니다. 상단 패널 : 낮은 배율에 따라 마우스의 뇌 코로나 섹션을 참조하십시오. 왼쪽 패널 : 모든 두개골 창 수술을하지 않으면 마우스, 노 GFAP 활성화는 뇌 세포에서 관찰된다. 중앙 패널 : 뇌의 오른쪽에 생성 된 포트 두개 창에 마우스, 노 GFAP 활성화는 뇌 세포에서 관찰된다. 오른쪽 패널 : 포트 윈도우의 측면에서 포트 두개 창 생리 주사와 마우스. GFAP 활성화는 포트 창 옆에 관찰 있지만 그대로 뇌 조직의 측면에 있습니다. 규모 바 : 1mm. 낮은 패널 : 상단 패널 이미지의 흰색 상자에 표시된대로 영역에서 뇌 조직의 높은 전력 이미지. 규모 바 : 100 μm. <aHREF = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_blank&quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig4.jpg" /> 그림 4. 고해상도 축복-1 YFPH 마우스에서 수지상 쪽의 이미지. 이미지는 포트 수술 당일에 인수하고, 32일 포트 수술 후했다. 그것은 대부분의 쪽은 하루에 제시되는 이미지에서 0 포트 수술 후 명확하게 볼 수 32일 아르 명백합니다. 규모 바 : 2 μm.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

성공적으로 포트를 두개 창에 키는 숱이와 연마입니다. 시닝 초기 신속 수행 할 수 있지만,주의 넓은 지역에 걸쳐 두개골의 숱이 동질적인 보장하기 위해주의해야한다. 우리는 일반적으로 생리 식염수가 microdrill 한 번 두개골을 통해 통과 한 직후에 증발하는 등, 두개골에 생리의 얇은 층을 적용하고 얇은 두개골 원 패스 한 번에. 이것은 두개골 우리에게 느리지 만 homogenously 더 얇은 수 있습니다....

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate와 DMEM/F12 (1:1) </td><td> 열 문화 Hyclone </td><td> SH3026101 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 세럼 무료 보충 (50x) </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMax-1 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 </td><td> 열 문화 Hyclone </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Accutase - 효소 셀 부대 매체 </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> T25 플라스크 - 벤트 캡 녹색 </td><td> SARSTEDT </td><td> 83.1810.502 </td><td></td></tr><tr><td> 70 %의 알코올 </td><td> 잭스 LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% povidone-요오드 국소 솔루션 </td><td> 잭스 LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 케타민 HCL </td><td> 버틀러 동물 건강 공급 </td><td> NDC # 11695-0550-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Akorn 주식회사 </td><td> 나다 # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> 잭스 LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 안과 연고 </td><td> Dechra 동물 제품 </td><td> 17033-211-38 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 % Lidocaine HCL </td><td> 리젠트 주식회사 </td><td> NDC 0517-0625-25 </td><td></td></tr><tr><td> 시아 노 아세틸렌 접착제 </td><td> 헨켈 주식회사 </td><td> 46,551 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 스왑 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 23-400-114 </td><td></td></tr><tr><td> 다이아몬드 붙여 넣기 </td><td> 위젯 공급 </td><td> BBE60 </td><td></td></tr><tr><td> 주석 산화물 </td><td> LORTONE 주식회사 </td><td> 591-038 </td><td></td></tr><tr><td> 라이너 본드 2V </td><td> KURARAY 의료 주식회사 </td><td> 1921-KA </td><td></td></tr><tr><td> Clearfil AP-X </td><td> KURARAY 의료 주식회사 </td><td> 1721-KA </td><td></td></tr><tr><td> 함수호 </td><td> 잭스 LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 커버 </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-0720 </td><td></td></tr><tr><td> 헥스 너트 </td><td> 작은 부품 주식회사 </td><td> HNX-0090-C </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> Syringepump.com </td><td> NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 두 광자 이미징 시스템 </td><td> 사용자 정의 내장 (모든 상용 시스템이 겠어일) </td><td></td><td></td></tr></table>

imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window

Glioma은 인간 암의 가장 치명적인 형태의 하나입니다. 날짜 수술에 대한 가장 효과적인 glioma 치료는 방사선에 의해 다음 대부분의 환자가 glioma 재발의 1,2에 의한 진단 후 5 년 이상 생존하지 않는 한, 환자에게 단 겸손한 이익을 치료 - 제공합니다. 인간의 뇌 종양에서 암 줄기 세포의 발견은 glioma 3 소설 치료 전략의 개발에 엄청난 영향을 미치고을위한 약속을 보유하고 있습니다. 암 줄기 세포는 자신의 능력 - 자기를 갱신하고 차별화 모두에 의해 정의되며, 새로운 종양 4 대를 시작하는 능력이 종양에서 유일한 세포가 될 것으로 생각됩니다. Glioma 재발 다음과 방사선 요법은 치료 glioma의 줄기 세포의 저항 (GSCs)에서 발생하는 것으로 생각됩니다 5-10. 생체에서 GSCs들은 줄기 세포와 같은 특성 11-14을 유지하는 것이 중요합니다 perivascular 틈새에 거주하는 표시됩니다 . organi의 핵심GSC 틈새의 zation은 12 혈관 내피 세포 수 있습니다. 기존 증거가 혈관 내피 세포와 GSCs와 상호 작용 종양 개발을 위해 소중하게 생각하고 있으며, glioma에 중요한 치료 목표로 내피 세포와 GSCs과 상호 작용을 확인하는 것이 좋습니다. GSCs의 존재는 orthotopic 이식 15시 새로운 종양를 시작하기 위해 자신의 능력에 의해 실험적으로 결정됩니다. 이것은 일반적으로 인간의 종양에서 심각하게 immuno-결핍 생쥐의 뇌, 또는 congenic 호스트 마우스의 뇌에 마우스 GBM 세포에 고립 GBM 세포의 특정 번호를 주입에 의해 달성된다. 종양 성장을위한 Assays는 다음 주입 GBM 세포 간의 GSCs 새로운 종양 - 일반적으로 몇 주 또는 몇 달을 야기 할 할 수 있도록 충분한 시간에 따라 수행됩니다. 따라서, 기존의 assays는 생체 내 단일 GSCs에서 종양 개시의 중요한 병리 과정의 시험을 허용하지 않습니다. 따라서, 필수 전종양 개시의 초기 단계에서 혈관 내피 세포와 GSCs과 상호 작용의 특정 역할에 nsights이 부족합니다. 이러한 통찰력은 glioma에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기위한 중요한 있으며, 환자 glioma의 재발을 방지하기위한 좋은 영향을 미칠 것입니다. 우리는 여기 포트에게 두개골 창 프로 시저 16 적응하고 생체에 두 광자 현미경은 살아있는 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포에서 종양 개시의 시각화를 허용 할 수 있습니다. 우리 기술은 glioma의 개시시 GSCs와 혈관 내피 세포 사이의 키 신호 메커니즘을 명료하게하다하는 미래의 노력의 길을 열어 것입니다.

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Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

광택 및 강화 된 얇은 두개골 (포트) 두개골 창 glioblastoma (GBM) 세포 주입을 결합함으로써, 우리는 glioma의 개시와 길이 방향 라이브 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포의 성장을 관찰 할 수 있습니다.

이미징 Glioma 개시<em&gt; 생체 내</em&gt; 연마하고 강화 얇은 두개골 두개골 창을 통해

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

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Medicine

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

13.0K 조회수.  The Jackson Laboratory. 광택 및 강화 된 얇은 두개골 (포트) 두개골 창 glioblastoma (GBM) 세포 주입을 결합함으로써, 우리는 glioma의 개시와 길이 방향 라이브 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포의 성장을 관찰 할 수 있습니다.

비디오: Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

염증성 플라크의 적외선 형광 (NIRF) Intravascular 분자 이미징, Multimodal 접근 가까운 생체내에서 죽상 경화증의 영상을

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

연구

의학

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

엔도 테린-1 유도 중간 뇌 동맥 폐색 동안 중동 뇌동맥을 시각화하기 위해 두개골 창 활용

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration of specific neural processes in the central nervous system. However, information is lacking on the molecular impact of these changes, especially on the endogenous opioid system during migraine headaches, and neuronavigation through these changes has never been done. This study aimed to investigate, using a novel 3D immersive and interactive neuronavigation (3D-IIN) approach, the endogenous &#181;-opioid transmission in the brain during a migraine headache attack in vivo. This is arguably one of the most central neuromechanisms associated with pain regulation, affecting multiple elements of the pain experience and analgesia. A 36 year-old female, who has been suffering with migraine for 10 years, was scanned in the typical headache (ictal) and nonheadache (interictal) migraine phases using Positron Emission Tomography (PET) with the selective radiotracer [11C]carfentanil, which allowed us to measure &#181;-opioid receptor availability in the brain (non-displaceable binding potential - &#181;OR BPND). The short-life radiotracer was produced by a cyclotron and chemical synthesis apparatus on campus located in close proximity to the imaging facility. Both PET scans, interictal and ictal, were scheduled during separate mid-late follicular phases of the patient's menstrual cycle. During the ictal PET session her spontaneous headache attack reached severe intensity levels; progressing to nausea and vomiting at the end of the scan session. There were reductions in &#181;OR BPND in the pain-modulatory regions of the endogenous &#181;-opioid system during the ictal phase, including the cingulate cortex, nucleus accumbens (NAcc), thalamus (Thal), and periaqueductal gray matter (PAG); indicating that &#181;ORs were already occupied by endogenous opioids released in response to the ongoing pain. To our knowledge, this is the first time that changes in &#181;OR BPND during a migraine headache attack have been neuronavigated using a novel 3D approach. This method allows for interactive research and educational exploration of a migraine attack in an actual patient's neuroimaging dataset.

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient&#039;s Brain During a Spontaneous Migraine Headache

In this study, the authors report for the first time a novel 3D-Immersive &#38; Interactive Neuronavigation (3D-IIN) through the impact of a spontaneous migraine headache attack in the &#956;-opioid system of a patient's brain in vivo.

3D-Neuronavigation<em&gt; 생체</em&gt; 자발적인 편두통 두통 동안 환자의 뇌를 통해

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

결합<em&gt; 생체</em&gt; 광학 및 μCT 이미징 마우스의 정형 외과 임플란트 감염에 감염, 염증 및 뼈 해부학을 모니터링

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

State of the Art Cranial Ultrasound Imaging in Neonates

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a patient is unstable. In addition it is radiation-free and allows serial imaging. CUS possibilities have steadily expanded. However, in many neonatal intensive care units, these possibilities are not optimally used. We present a comprehensive approach for neonatal CUS, focusing on optimal settings, different probes, multiple acoustic windows and Doppler techniques. This approach is suited for both routine clinical practice and research purposes. In a live demonstration, we show how this technique is performed in the neonatal intensive care unit. Using optimal settings and probes allows for better imaging quality and improves the diagnostic value of CUS in experienced hands. Traditionally, images are obtained through the anterior fontanel. Use of supplemental acoustic windows (lambdoid, mastoid, and lateral fontanels) improves detection of brain injury. Adding Doppler studies allows screening of patency of large intracranial arteries and veins. Flow velocities and indices can be obtained. Doppler CUS offers the possibility of detecting cerebral sinovenous thrombosis at an early stage, creating a window for therapeutic intervention prior to thrombosis-induced tissue damage. Equipment, data storage and safety aspects are also addressed.

Cranial ultrasound (CUS) is a valuable tool for brain imaging in critically ill neonates. This video shows a comprehensive approach for neonatal (Doppler) CUS for both clinical and research purposes, including a bedside demonstration of the technique.

신생아의 예술 두개골 초음파 이미징의 주

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

자궁 원격 측정은 마우스 수축 압력을 측정하는<em&gt; 생체</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 ​​이미징 및 추적에서

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...