이 프로토콜은 사용자가 이주, 침략 및 증식과 같은 종양 세포 행동에 진료소에서 사용된 침략적인 외과 적 절차의 충격을 연구할 수 있게 합니다. 이 방법은 침습적 인 절차 전후에 동일한 종양의 시각화를 고유하게 허용하여 비 세로 접근법에서 놓칠 수있는 통찰력을 제공합니다. 마취 된 성인 마우스에서 발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인 한 후, 입체 프레임에 마우스를 장착하고 코 클램프와 두 개의 이어 바머리를 고정.
가열 램프를 사용하여 체온을 보존하고 동물의 눈에 연고를 바치세요. 날카로운 가위를 사용하여 눈에서 두개골 의 바닥까지 두개골의 털을 면도하고 70 %의 에탄올을 사용하여 노출된 피부를 살균하십시오. 피부를 원형으로 자르고 면봉을 사용하여 노출된 음절을 긁어냅니다.
수술 부위를 1%리도카인을 1%로, 면봉으로 여분의 용액을 제거하기 전에 5분 동안 1:100, 000 농도의 에피네프린을 치료한다. 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 피부의 가장자리를 두개골에 부착하고 4배 배율로 해부 스테레오 현미경 아래에 고정 프레임을 배치합니다. 다음으로, 피상적 인 직경 5 밀리미터, 오른쪽 정수리 뼈 위에 원형 홈을 조심스럽게 드릴.
그리고 홈에 피질 버퍼의 방울을 적용합니다. 얇은 집게를 사용하여 뼈 플랩을 들어 올려 뇌 표면을 시각화하고 곡선, 테이퍼, 매우 미세한 포인트 포셉을 사용하여 듀라 메이트를 제거하십시오. 출혈이 발생하면 흡수성 젤라틴 스폰지를 사용하여 hemostasis를 달성하십시오.
종양 세포 주입의 경우, 포인트 스타일의 2 바늘을 장착 한 5 개의 마이크로 리터 가스 꽉 주사기에 세포의 약 3 마이크로 리터를 적재합니다. 스테레오탁스 조작기 암에 바늘을 고정하고 노출된 조직에서 피질 버퍼를 제거합니다. 주사기의 끝을 두개골 절제술 의 중간에 놓고 두개골 표면에서 0.5 밀리미터 깊이로 바늘을 삽입합니다.
그런 다음, 두개골 절제술에 피질 버퍼한 방울을 추가하고, 미세 사기 펌프 인젝터를 사용하여 분당 250 내지 400 나노리터로 세포를 전달한다. 두개골 이미징 창을 준비하려면 피질 버퍼를 두개 내술 부위에 실리콘 오일 한 방울로 교체하여 창 아래기포를 피하십시오. 노출된 뇌를 6mm 커버슬립으로 밀봉하고, 커버슬립과 두개골 사이에 시아노아크라일트 접착제를 적용합니다.
그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 두개골에 대한 커버 슬립을 부드럽게 누릅니다. 적절한 실험 적 시점에서 마우스 를 이미징 상자에 배치하고 25 배 물 목표를 가장 낮은 z 위치로 설정합니다. 목표에 큰 물 방울을 추가하고, 현미경의 섭씨 37도 어두운 기후 챔버로 이미징 상자를 전송합니다.
물 방울이 커버슬립에 닿을 때까지 두개골 이미징 창 덮개 슬립에 목표를 가져옵니다. 그리고 상피형 모드를 사용하여, 세포를 초점으로 가져오기 위하여 안구를 통해 종양을 관찰합니다. 레이저를 올바른 파장에 조정하고 라이브 모드를 선택합니다.
이미징에 대한 관심 있는 여러 위치를 선택한 후 소프트웨어에서 좌표를 기록합니다. 3 마이크로미터로 설정된 이미지 사이의 단계 크기와 함께 종양 세포 분해능을 손상시키지 않고 종양 세포의 최대 볼륨을 획득하기 위해 각 위치에 대한 z-스택을 정의합니다. 그런 다음, 2시간 동안 20분마다 서로 다른 위치에서 종양 부피의 이미지를 획득하여 각 이미지 획득 전에 목표에 물을 추가한다.
마지막 이미지를 획득한 후 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하는 가열 패드로 전송합니다. 첫 번째 이미징 세션 후 하루 후, 입증된 바와 같이 스테레오탁틱 프레임에 마취 마우스를 고정하고, 아세톤에 젖은 면봉을 사용하여 접착제가 부드러워질 때까지 커버슬립의 가장자리를 닦아냅니다. 커버슬립 아래에 25 게이지 바늘을 밀어 내고 얇은 포인트 집게를 사용하여 들어 올리고 신선한 피질 버퍼로 두개골 절제술을 수분처리합니다.
25 게이지 바늘로 종양을 1밀리미터 깊이로 뚫고 멸균 젤라틴 스폰지로 출혈을 멈추고 신선한 실리콘 오일로 뇌 표면을 밀봉하십시오. 그런 다음 상처 위에 새로운 6 밀리미터 커버 슬립을 붙입니다. 이미지 분석을 위해 현미경 소프트웨어 프로그램에서 시간 경과 LIF 파일을 열고 탭 프로세스, 프로세스 도구 및 병합을 선택합니다.
시간 시퀀스의 첫 번째 이미지를 선택하고 먼저 클릭합니다. 시간 시퀀스의 두 번째 이미지를 선택하고 두 번째 를 클릭합니다. 차원 병합에서 시간 동안 t를 선택한 다음 적용을 클릭합니다.
두 개의 타임포인트가 있는 새 파일이 생성됩니다. 세 개의 연속 z 스택에 대해 각 타임랩스 시리즈를 별도로 추적한 후 시간 경과 이미지가 포함된 폴더를 ImageJ로 드래그합니다. 탭 플러그인, 추적 및 MtrackJ를 선택합니다.
각 개별 셀을 추적하려면 각 시간지점에서 각 셀 추가를 선택하고 클릭합니다. 그런 다음 측정값을 클릭하고 파일을 저장하여 트랙의 측정값을 추출합니다. 개별 종양 세포의 이동은 z 스택의 다른 xy 평면에서 시간이 지남에 따라 이동 경로를 추적하고 생검을 게시하는 철새 세포의 백분율로 플롯함으로써 결정될 수 있다.
종양 세포 증식율은 미토시스에 대한 H2B 태그형 Dendra2 응축에 기초하여 정량화될 수 있으며 생검 을 전후하는 분할 세포의 백분율로 플롯될 수 있다. 동일한 종양에서 생검 전후의 이주 속도의 분포를 비교하면, 비이민 세포로의 느린 수의 관련 감소와 함께 개입 후 철새 세포의 수가 증가한다는 것을 알 수 있습니다. 종양 당 평균, 생검 과 같은 부상이 수행 될 때 철새 세포의 비율에 있는 1.75 배 증가는 대조군, 비생생물계 마우스에 비해 관찰됩니다.
철새 종양 세포의 백분율은 결국 통제와 생검 마우스 둘 다에서 감소하더라도, 생검 마우스는 아직도 전반적인 통제 마우스 보다는 더 높은 철새 용량을 전시합니다. 종양 세포 증식 행동은 또한 비생생물통제마우스에 비해 시간이 지남에 따라 생검시 미토틱 사건의 수가 1.52배 증가한다는 것을 보여준다. 참고로, 종양 세포 이동 또는 증식의 유도는 생검없이 두개골 이미징 창 교체 후 관찰되지 않으며 종양 세포 증식 및 이주 율의 부스트가 생검과 같은 부상에 의해 특별히 유발된다는 것을 나타냅니다.
두개골 이미징, 이식 및 교체 단계 동안 고정밀 및 외과 기술로 작업하는 것이 중요합니다. 광범위한 연습이 필요할 수 있습니다.
