저자는 SSGCID 컨소시엄의 모든 구성원을 감사드립니다. SSGCID의 목표 달성은 에메랄드 바이오의 모든 팀 구성원의 엄청난 노력에 의해 가능하게된다. 이 연구는 알레르기와 감염증, 건강 및 보건 복지부의 국립 연구소의 국립 연구소에서 연방 계약 번호 HHSN272200700057C에서 후원했다.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

저자는 에메랄드 바이오 주식 회사의 직원입니다

멀티 타겟 병렬 처리 구조 기반 약물 설계 약물 발견에 중요한 역할을한다. SSGCID는 NIAID 종류 AC 병원균부터 3 차원 단백질 구조와 과학 커뮤니티를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 널리 사용되는 이러한 구조 정보를 만드는 것은 궁극적으로 구조 기반 약물 설계를 가속화하는 역할을합니다. MTPP 방식의 첫 번째 중요한 단계는 구조 디자인입니다. 각 대상 단백질의 여러 구조는 성공적인 구조 결정 및 증가 턴어라운드의 가능성을 증가시킵니다. 그것은 몇 가지 단백질 구조는 파이프 라인의 단계에서 실패 할 불가피하다. PIPE 복제 방법을 구현하는 것은 노동 집약적 인 정제 단계없이 96 - 웰 형식의 여러 구조의 생성을 허용하여 MTPP 방법을 지원합니다. 같은 96 - 웰 형식 (캘리퍼스 실험실에서 단백질 발현을 분석 할 수있는 능력 PIPE 복제 페어링칩 90) 더 전반적인 흐름을 촉진. 이러한 방법의 페어링 대규모 단백질 생산 및 정제의 성공을 보장 수용성 단백질을 생산하는 구조를 빠르게 식별 할 수 있습니다. MTPP 높은 처리량의 성공에 필수적인 측면은 단백질 메이커 (미국 특허 번호 6,818,060, 에메랄드 바이오) 악기입니다. 단백질 메이커 높은 처리량 단백질 생산 및 관련 구조 게놈 파이프 라인 연구 프로그램의 효율성을 향상하기 위해 특별히 개발 된 24 채널 병렬 액체 크로마토 그래피 시스템입니다. 단백질 메이커 앞에서 설명한 프로토콜을 사용하여 장점은 한 줄 FPLC 시스템에 비해 분명합니다. 한 사람은 8 시간 내에 병렬 48 대상을 정화 할 수 있습니다. 반면, 한 줄 FPLC 시스템을 사용하여 한 사람은 같은 시간 내에 네 개의 대상의 최대를 정화 할 수 있습니다. 각 대상에 대한 순도 높은 수준의구조 분석을위한 성장 단백질 결정의 이후 성공에 중요한 요소는 단백질 메이커로 달성했다. 제한 사항 및 문제 해결 X-선 결정학에 의해 입체 구조를 해결하는 것은 수용성 목적 단백질의 다량을 얻을 수 없다는 것입니다 중 하나는 많은 도전과 다단계 노력입니다. 용해도 문제를 극복하기 위해 구현 할 수있는 하나의 전략은 E.와 같은 다른 표현 호스트의 사용 대장균 세포는 몇 가지 중요한 진핵 번역 후 수정을 수행 할 수 없습니다. 이러한 번역 후 수정을 수행 할 수있는 각종 효모 발현, 곤충 및 포유 동물 세포 라인은 종종 적절한 대안이다. 표적 단백질은 종종 표현하지만, 표준 용해 조건에​​서 완전히 용해된다. 단백질 메이커 대체 세포 용해 상태의 신속한 테스트를위한 귀중한 자원이 될 수 있습니다로 스미스 등의 설명. 2011 13. 이 전략은 종종 목표는 파이프 라인을 통해 계속 이동해야합니다. 어떤 구조 유전체학 파이프 라인, 표준화 된 프로토콜은 파이프 라인 및 대상 개별 최적화를해야 할 수도 통해 나오는 모든 대상에 적합하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 모든 동결 방지제에 대해 20 %의 에틸렌 글리콜을 사용하도록 선택했습니다. 이 조건이 적합하지 않습니다 경우에, 대안의 cryoprotectants 또는 농도 테스트해야 할 수도 있습니다. 각각의 단백질 대상의 고유 한 특성으로 인해, 속도 제한 및 구조를 결정하는 예측 단계는 결정됩니다. 최초의 스파 스 매트릭스 화면에서 최적화 단백질 결정화의 MTPP 파이프 라인 오프셋은 일반적으로 낮은 성공률. 상업적으로 이용 가능한 스파 스 매트릭스 화면에서 적중 각각의 초기 결정은 더욱 E-스크린 빌더 (에메랄드 바이오)에 최적화되어 있습니다. 최적화 화면이 AR 설계버퍼 염 및 첨가제의 농도 변화, 초기 크리스탈 히트의 상태를 운드. 성공적인 최적화 화면 회절 연구 및 구조 결정을위한 적합한 결정을 얻을 수 있습니다. 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)가 내다 구조 유전체학 프로그램은 에메랄드 바이오와 함께 SSGCID (에메랄드 바이오, SeattleBiomed, 워싱턴 대학과 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소) 세 가지 다른 태평양 북서부 기관에 자금을 제공 . 컨소시엄의 각 구성원은 NIAID 구조 유전체학 프로그램의 목표를 달성에 필요한 최첨단 기술을 적용하는 전문성을 위해 선택되었다. 지금까지 SSGCID은 세계에서 일곱 번째로 큰 기여자로 PDB 순위 그것으로 461 구조를 기탁했으며, 2011 년, 가장 생산. SSGCID의 프로토콜과 방법론을 혜택의 의도와 함께 제공됩니다사회 과학 및 감염성 질환의 연구를 영속.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

높은 악성 인플루엔자 변종 유행성 독감 발생은 전 세계적으로 인간의 인구의 대폭적인 병적 상태와 사망률의 원인이 될 수 있습니다. 혼자 미국에서 41,400 사망자와 1,860,000 입원의 평균은 매년 1 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생합니다. 효소의 기본적인 단백질이 소단위 (PB2)의 점 돌연변이는 인간 2 바이러스 감염의 적응에 연결되어있다. 이러한 연구의 결과는 따라서 항 바이러스 약물 표적으로서의 가능성을 강조, 독성 요인으로 PB2의 생물학적 중요성을 공개했다. 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)가 내다 구조 유전체학 프로그램은 에메랄드 바이오와 함께 감염증 (SSGCID)의 시애틀 구조 유전체학 센터를 구성하는 세 가지 다른 태평양 북서부 기관에 자금을 제공한다. SSGCID는 thre에 함께 과학계를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다NIAID 종류 AC 병원균의 전자 차원 단백질 구조. 과학계에서 사용할 수 같은 구조 정보를 만드는 것은 구조 기반 약물 설계를 가속화하는 역할을한다. 구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 통로 또는 전체 단백질 가족을 대상으로 새로운 리드 발견을위한 성공의 기회를 증가합니다. 에메랄드 바이오 컨소시엄을 지원하는 유전자에 대한 구조 결정을위한 높은 처리량, 멀티 타겟 병렬 처리 파이프 라인 (MTPP)를 개발했다. 여기에서 우리는 네 가지 독감 변종에서 PB2 단위체의 구조를 결정하는 데 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

다음과 같은 결과를 설명하는 프로토콜의 예상 결과를 설명하고, PB2, 관찰 결과의 경우합니다. 인플루엔자 바이러스 중합 효소의 소단위 PB2 다섯 전체 길이 대상 아미노산 서열 (그림 2) 설계되었습니다, 유전자 작곡가를 사용하여. PB2 시퀀스는 다시 변환 많은 엔지니어링 단계 3 대상, E.의 표현에 최적화 된 코돈 조화 시퀀스의 결과되었습니다 대장균. IPCR 제품 (그림 3B), 서른 넷 구조의 총에서 성공적으로 그림 3A와 같이 파이프 복제 3를 사용하여 그의-Smt을 융합 태그 N-말단 배와 수정 pET28 벡터 시스템 (10)에 클로닝 하였다. 복제 워크 플로우의 개요는 그림 4에 표시됩니다. 성공적으로 복제 한 후 각 구조의 마이크로 스케일의 단백질 발현은 BL21 (DE3) E.에서 테스트되었습니다대장균 세포. 세포는 220 rpm에서 진탕 배양기 세트에 20 ° C에서 48 시간 동안 Novagen 사 익일 인 1 매체 (제조 업체의 프로토콜에 따라)로 보충 TB 배지에서 성장했다. 성장 후, 세포 캘리퍼스 LabChip 90 모세관 electrophoreses를 사용하여 수용성 단백질 발현을위한 수확 및 테스트되었습니다. 수용성 목적 단백질을 주도하고 서른 넷 PB2 구조의 열네 대규모 발효에 들어갔다. 각 구조의 대규모 배양 제조 업체의 프로토콜에 따라 Novagen 사의 하룻밤 익스프레스 1 매체와 보충 TB 배지에서 성장했다. 성장 후, 세포를 원심 분리를 통해 수확되었고, -80에 저장 ° C. 각 문화의 대규모 단백질 발현은 대규모 정화를 진행하기 전에 SDS-PAGE 분석 (그림 5)를 통해 확인 하였다. 단백질 메이커 열네 PB2 구조의 병렬 정제를 수행하는 데 사용되었다. 알의 명확히 해물내가 십사 구조는 니켈 - 킬레이트 칼럼을 통해 실행되었습니다. SDS-PAGE에 의해 표적 단백질을 포함하는 분획 결정한 후, 해당 분수는 각 샘플에 대한 풀링 된 각각의 농도는 280 독서에 의해 결정되었다. 배 그의-Smt 개의 태그 제거는 하룻밤 투석 두 번째 니켈 열 다음에 ULP1의 추가에 의해 실시되었다. 그의-Smt 개의 태그 제거의 확인은 SDS-PAGE (그림 6)에 의해 실시되었다, 각 샘플은 10 kDa의 Amicon 울트라 원심 분리 관에 집중되었다. Amicon 울트라 원심 분리기 튜브를 사용하여 농축 한 후, 각 샘플은 결정학 순도를 달성하기 위해 크기 조정 컬럼을 통해 실행되었습니다. 두 번째 농도는 결정화에 필요한 수준으로 단백질 농도를 높이기 위해 실시되었다. 모든 열네 구조가 성공적으로 정제 및 결정화 실험을 체결 하였다. 결정화 이전에 천을 해동에 의해 시작되었다OZEN 단백질. 결정은 16에서 기후 제어 방에서 수행되었다 ° C 앉아 드롭 증기 확산 (그림 7)를 위해 특별히 디자인 플레이트 (에메랄드 바이오)와 함께. 초기 심사 개의 스파 스 매트릭스 화면으로 실시되었다 JCSG +, 협정, 마법사 전체, 그리고 확장 뉴먼 전략에 따라 CryoFull (에메랄드 바이오). 단백질 용액 0.4 μL는 96 - 웰 컴팩트 주니어 결정 플레이트 (에메랄드 바이오)를 사용하여 해당 저장소에서 crystallant 0.4 μL (또는 저수지 용액)로 혼합 하였다. 열네 정제 시료의 그 아홉은 회절 연구 (그림 8)에 적합한 결정이 나왔고. 사내 회절 데이터 세트는 Osmic VARIMAX HF 광학 및 토성 944 + CCD 검출기가 장착 된 Rigaku SUPERBRIGHT FR-E + 회전 양극 X-선 발생기를 사용하여 구리 Kα 파장에서 결정 구 구조의 오 (그림 9에서 수집 된 ). 각 데이터 세트는 XDS / 엑스 스케일 4로 처리했다 &lt;<html> / 한모금&gt;와 최종 해상도로 확장. 분자 교체하여 구조를 해결하기 위해 시도 CCP4 스위트 7에서 페이저 5를 실시 하였다. 최종 모델은 REFMAC 7 검둥 오리 11의 수동 재 구축에 정제 한 후 하였다. 구조 평가 및 MolProbity 9 형상 및 피트니스에 대해 보정 하였다. PB2 subunit의 네 가지 구조의 총 결정 (그림 10)와 PDB로 입금되었다. 그림 11 MTPP 파이프 라인의 각 단계에서 전체 결과를 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> 그림 1. 에메랄드 바이오시 멀티 타겟 병렬 처리를위한 SSGCID 유전자에 구조 통로의 개요. 내용 &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> 그림 2. 정렬 뷰어 및 단백질 유전자 Composer 소프트웨어의 설계 모듈을 구축합니다. 아미노산베이스 그린 (가운데 창) 및 대체 구문의 구조 유도 잘림이 금 (하단 창)에 표시됩니다에 표시되어 대상의 구성. 여러 독감 바이러스 PB2 서열 정렬이 순서와 이차 구조 요소에 비해 표시됩니다 PDBID 3CW4의 C-말단 도메인의. 도메인 구조 및 이차 구조 요소의 지식은 N-말단 잘림이 원하는 아미노산을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 유전자 작곡가 디자인 모듈 내에서 선택 할 수 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 3A. 파이프 복제는 합성 유전자 삽입 (오렌지)가 앞으로 디자인 (레드 오렌지 선)와 생성 역 (오렌지 블루 라인) 프라이머는 PCR 물질을 삽입하여 증폭되는 것을 특징으로 설명되어 있습니다. 발현 벡터가 반대 (빨강 - 검정 라인 증폭 ) 앞으로 (블루 블랙 라인) 프라이머 벡터 PCR 자료를 생성합니다. 터미널 시퀀스 IPCR 제품은 vPCR 제품 (IPCR의 붉은 IPCR의 vPCR와 블루 vPCR 블루 보완 빨간 보완)의 단자 시퀀스를 보완합니다. 이 IPCR 및 vPCR 제품은 호스트 BL21 (DE3) 화학적 관할 E.으로 변화에 복제되는 플라스미드를 형성 어닐링 할 수 있습니다 대장균 세포. <img alt="그림 3B" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> 그림 3b. IPCR 생산의 영동 분석<html> 성공적인 IPCR 제품은 강력한 밴드로 표현하는 동안 PB2 소단위에서 TS. IPCR 실패는, 희미하거나 더럽혀진 밴드로 볼 수 있습니다. IPCR 제품의 품질은 일반적으로 복제의 성공과 상관 될 수 있습니다. 분자량 마커 kiloDaltons에 있습니다. 그림은 레이몬드 외., 2011 12에서 재생됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> 그림 4. 대상 유전자 공학 단계 PB2 단백질이 유전자 Composer 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 설계 핵산 서열이 각 대상에 대해 설립 후 6-7 다른 단백질 구조는 각 위해 설계되었습니다. 유전자 설계 및 복제의 초기 단계에있는 다중 표적 병렬 처리는 E.에 용해 단백질을 생산 가능한 대상이었다 14 어느 34 구조, 결과 대장균. <html> 다시 10 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 강력한 단백질 발현 (25.76 kDa의의 예상 크기), (레인 7) 용출 된 단백질에서 배 그분-Smt을 (를) 태그의 분열을 약 50 %의 수용성 (레인 4)와 50 %를 보여주는 대규모 발효의 대표 SDS-PAGE 분석. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> 그림 6. 효소의 PB2 subunit의 세 가지 구조에 대한 SDS-PAGE 결과 레인 1, 분자량 마커 (kDa의의 왼쪽에 표시). 레인 2, 6, 10, 니켈 1 열에서 풀링 단백질, 레인 3, 7,과 11 니켈 2에서 버퍼에 쪼개진 단백질의 흐름을 통해, 레인 4, 8, 12, 니켈 2에서 버퍼 B에 배 그의-Smt 개의 태그를 제거. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; 그림 7. 앉아있는 드롭 방법으로 수증기 확산의 개략도. 단백질 결정화 앉아 드롭 방법은 증기 확산의 범주에 속합니다. 이 방법은 단백질과 높은 농도에서 유사한 조건을 포함하는 큰 저수지와 평형하는 침전제의 정제 된 샘플을 수반한다. 물이 단백질 샘플 및 전송에서 저수지 증발로 침전 농도는 단백질 결정화에 대한 최적의 수준으로 증가합니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> 그림 8. 인플루엔자 바이러스의 변형에서 효소의 PB2 소단위 단백질 크리스탈. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> 그림 9. 에서 효소의 PB2 소단위의 X-선 회절 이미지인플루엔자 바이러스의 변형. <img alt="그림 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> 그림 10. 4 PB2 구조 결정학 비대칭 단위 분자의 리본 다이어그램. 해당 PDB 코드에 무지개의 패턴 컬러 차 구조. () 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (B) 3KHW (A / 멕시코 / InDRE4487/2009/H1N1) (C) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (D) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="그림 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> 그림 11. 설명 된 방법에 의한 인플루엔자 PB2 대상에 대한 결과 분석. structur에이전자 측정 파이프 라인은 다섯 단계에 설명되어 있습니다 : 복제, 용해도, 정제, 결정화 및 구조 결정.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

multi-target-parallel-processing-approach-for-gene-to-structure

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K 조회수.  Emerald Bio. 구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

비디오: Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...