우리는 그룹 IV 바이러스 게놈호스트 단백질 서열의 짧은 뻗어를 인코딩한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 시퀀스는 바이러스 성 프로테아제 분열 부위 내에서 찾을 수 있습니다. 그(것)들은 숙주 단백질의 표적으로 한 파괴를 위해 이용되고 있습니다, 면역 반응을 생성에 관련시키는 전형적으로 단백질.
프로테아제 스세이스를 사용하는 주요 장점은 세포의 복잡성을 제거하고 바이러스 성 프로테아제가 특정 시퀀스를 갈라둘 수 있는지 여부를 보여줍니다. 따라서 Zika SSHHPS 서열을 분석했을 때, 우리는 프로테아제가 면역 반응을 생성하는 데 관련된 단백질의 서열을 절단할 수 있으며 이러한 단백질 중 일부는 뇌와 눈 발달에 있어 역할을 했다는 것을 발견했습니다. 이 기술을 처음으로 수행할 때, 골짜기가 관찰되지 않으면 프로테아제의 활성과 같은 다양한 요인 때문일 수 있음을 기억해야 한다.
절차를 시연하는 것은 제 실험실의 기술자인 제이미 콤프턴(Jaimee Compton)이 될 것입니다. 단백질 BLAST를 열고 가위 결합과 바이러스 다단백을 둘러싼 20개의 아미노산을 넣고 비중복 단백질 서열을 선택한 다음 숙주 게놈에 입력하여 검색한다. 필요한 경우, 피-블라스트를 선택하고 제곱 괄호가 대괄호 내의 아미노산이 대체 위치에 있을 수 있음을 나타내는 패턴 서열로 입력한 다음 BLAST를 명중시키십시오.
분열 부위 시퀀스와 일치하는 연속 동일하거나 허용된 잔류물의 수를 기준으로 BLAST 히트를 순위를 매깁니다. 목록에서 프로테아제 분석에서 분석을 위해 6개 이상의 동일하거나 유사한 잔류물을 함유하는 단백질을 선택한다. 시안 형광 단백질, 최대 25개의 아미노산의 분열 서열 및 황색 형광 단백질을 코딩하는 플라스미드를 생성한다.
다음으로, 하룻밤 문화의 25 밀리리터와 네 개의 4 리터 플라스크를 접종하여 CFP와 YFP 기판을 준비합니다. 섭씨 37도에서 배양을 흔들고 600 나노미터에서 UV-Vis 분광법에 의해 시간당 성장을 모니터링합니다. 박테리아가 약 하나의 흡수도에 도달하면, 각 플라스크에 하나의 어금니 IPTG의 0.5 밀리리터를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 다음 흔들리는 인큐베이터의 온도를 섭씨 17도로 낮추고 발현이 17~20시간 동안 밤새 계속되도록 한다.
다음 날, 원심분리에 의해 박테리아를 7000 g에서 10 분 동안 4섭씨에서 펠릿. 액체 매체를 제거하고 폐기한 다음 펠릿을 영하 80도에 보관하거나 세포 용해로 진행합니다. 세포를 lyse하려면, 원고 방향에 따라 100 밀리리터의 리시스 버퍼를 준비하고, 완충제내의 펠릿을 재일시 중단하고, 서스펜션의 25~25밀리리터를 50밀리리터 일회용 원추형 튜브로 이송한다.
튜브를 얼음물이 있는 플라스틱 비커에 넣은 다음 초음파 처리기 팁을 튜브에 삽입하여 팁이 튜브 바닥에서 약 1센티미터 떨어져 있고 액체화되고 액화될 때까지 lysate를 10~20회 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 용액을 고속 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30분 동안 20, 500 x g의 원심분리기로 옮긴다. 상체를 깨끗한 병에 옮기고 펠릿을 버리십시오.
니켈 열에 용액을 적재한 다음 2개의 컬럼 부피로 열을 세척한 다음 280나노미터에서 20%버퍼 B.absorbance의 5개의 컬럼 부피가 이어서 세척 중에 오염물질이 열에서 엘루트로 증가한다. A280이 기준값으로 돌아올 때까지 계속 세척합니다. 그런 다음 100% 버퍼 B의 2~3개의 컬럼 부피로 단백질을 엘테하고 10밀리리터 분획을 수집하여 각 분획의 A280을 측정합니다.
원고 방향에 따라 8개의 반응 믹스를 준비하고 각 믹스의 파이펫 45 마이크로리터를 블랙 하프 리전 96웰 플레이트의 각 행의 처음 3개의 우물에 넣습니다. 고정 된 광증 튜브 설정으로 두 파장에서 꽃의 동시 감지를 위해 플레이트 판독기를 설정합니다. 읽기 시간을 분당 한 번 읽으면서 20~30분으로 프로그래밍하고 읽을 우물을 선택합니다.
플레이트를 기계에 삽입하고 읽기를 시작하여 시간이 지남에 따라 배출 비율을 모니터링합니다. 절단되지 않은 기판을 포함하는 플레이트의 끝점 읽기를 실행합니다. 각 우물에 접시와 파이펫 5 마이크로 리터를 제거합니다.
첫 번째 열을 잘라내기 취소 컨트롤로 저장할 수 있습니다. 그런 다음 플레이트를 20~30분 동안 다시 읽고 플레이트 판독기를 절대 값을 출력하도록 설정합니다. 판독이 완료되면, 증발을 방지하기 위해 필름으로 접시를 밀봉하고 효소가 기판을 완전히 절단 할 수 있도록 실온에서 하룻밤 둡니다.
24시간 후 필름을 제거하고 플레이트의 끝점 판독을 수행합니다. 배출 비율을 평균하고 절단으로 기록합니다. SDS-PAGE를 사용하여 기판의 골짜기를 확인합니다.
분자량 마커를 첫 번째 또는 마지막 차선에 적재하고 절단되지 않은 반응부터 시작하여 각 반응 혼합물의 5마이크로리터를 젤의 차선에 적재합니다. 젤 탱크의 전극을 전원 공급 장치에 부착하고 60 분 동안 110 볼트로 제품을 실행합니다. 크래킹 도구를 사용하여 카세트에서 젤을 제거하고 염색 용액의 5~10밀리리터에 담급하십시오.
1-24시간 후에, 과도한 얼룩을 제거하고 젤을 물에 담급드시면 됩니다. 그런 다음 젤 이미저를 사용하여 젤사진을 찍습니다. 단백질 구조를 준비하려면 단백질 PDB 파일을 MOE에 적재하십시오.
선택 및 용매를 클릭한 다음 용매를 삭제합니다. 컴퓨트 상단 메뉴 모음에서 구조 p준비 패널을 열고 올바른 항목을 클릭하여 모든 구조 항목을 자동으로 수정합니다. 프로토네이트 3D를 클릭하여 구조를 프로토네이트합니다.
부분 충전 패널을 열고 AMBER 99를 선택하고 필요에 따라 수소와 고독한 쌍을 조정하여 단백질에 부분 충전을 추가합니다. 그런 다음 구조 파일을 저장합니다. 기판 펩티드와 TRIM14에 대한 구조를 구축하기 위해, 단백질 빌더 패널을 열고 기판 서열을 입력하고 자동 재포장을 선택합니다.
다음으로 형상을 확장으로 설정하고 빌드를 클릭합니다. 마지막으로 구조를 최소화하고 PDB 파일로 저장합니다. PyRx AudoDock 4.2 소프트웨어를 사용하여 기판 펩티드를 VEEV-nsP2에 도킹합니다.
단백질을 로드하고 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 매크로 분자 만들기를 선택하여 PDBQT 도킹 파일을 준비합니다. 그런 다음 기판 분자를 로드하고 리간드 만들기를 선택하여 리간드 도킹 파일을 준비합니다. 하단의 도킹 패널에서 AutoDock 마법사를 시작하고 준비된 리간드 및 단백질 파일을 선택합니다.
그리드 치수를 수동으로 조정하여 단백질 바인딩 포켓을 정의한 다음 AuotGrid를 실행합니다. 그런 다음 AutoDock을 실행하고 라마르키안 유전 알고리즘 방법을 선택합니다. 도킹 매개 변수를 클릭하고 GA 실행 수를 50으로 설정한 다음 앞으로 클릭하여 도킹 실행을 시작합니다.
자동 도크가 완료되면 결과 분석 패널을 열고 예측된 모든 바인딩 포즈를 검사합니다. 가장 낮은 예측 결합 에너지와 분열 부위의 기판 사이의 합리적인 바인딩 상호 작용을 가진 최상의 모델을 선택한 다음 추가 MD 시뮬레이션을 위한 PDB 파일로 저장합니다. AutoDock에서 바인딩 포즈를 읽은 후 MD 시뮬레이션을 사용하여 구체화할 타당한 바인딩 모델을 식별하기 위해 도킹 후 분석을 수행하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜은 Zika 바이러스 ns2B/3 protease에서 상동성 숙주 병원체 단백질 서열 또는 SSHHPS의 짧은 뻗어를 찾아서 이용되었습니다. 4개의 숙주 단백질 표적은 확인되었습니다. FOXGS, SFRP1, 망막 cDNA 라이브러리에서 Gsalpha 하위 단위, NT5M 미토콘드리아 5'3'nucleotidase.
SSHHPS의 서열 정렬은 분열 부위 서열에서 종별 차이를 허용하였다. SFRP1 서열은 Zika 바이러스가 닭 배아에 있는 사망그리고 microcephaly를 유도할 수 있기 때문에 주목할 만한 인간과 닭에서 동일했습니다. 연속 분석법은 바이러스 다단백 서열 및 불연속 분석에 대한 꾸준한 상태 운동 매개변수 및 억제 상수를 측정하는 데 사용되었으며, 이는 다양한 화합물에 의한 특정 서열의 분열 또는 프로테아제의 억제와 같은 질적 분열 정보를 얻기 위해 사용되었다.
베네수엘라 말 뇌염 nsP1-nsP2 접합의 모델은 실리코 방법으로 사용하였습니다. nsP2 프로테아제의 경우, 기판 서열을 연장하고 완충제의 이온 강도를 감소시킴으로써 셈리키 포리스트 바이러스 서열의 골짜기의 미하니스 상수에 상당한 감소를 초래하였다. 이 절차를 시도할 때는 컨트롤을 실행하는 것이 중요합니다.
바이러스 성 프로테아제 분열 부위 서열을 포함하는 기판은 SSHHPS 서열 분석을 진행하기 전에 테스트되어야 합니다. 숙주 단백질의 분열이 관찰되는 경우 숙주 단백질이 바이러스 복제에 영향을 미치는지 확인하기 위해 후속 실험을 수행해야합니다. 이것은 단백질을 과발 표현하거나 침묵시키고 바이러스성 복제에 대한 효력을 검토해서 행해질 수 있습니다.
그룹 IV에는 많은 수의 신규 및 신흥 병원체가 포함되어 있습니다. SSHHPS 서열은 특정 숙주 단백질 및 경로를 바이러스 성 프로테아제와 매우 예측 가능한 방식으로 연결합니다.
