풀 디자인과 oligo 복구 <ol><li> 첫 번째 단계는 공부하는 사전 mRNA 수영장을 설계하는 것입니다. 이것은 UCSC 게놈 브라우저를 사용하고 특정 유전자, 스플 라이스 분기점, 또는 관심있는 다른 분야를 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> 관심 창문이 선택되고 나면, 그들에 걸쳐 타일이 계산은 다음 조건을 사용하여 읽을 수 길이는 따라서 각 oligo가 이전부터 20 세포핵을 이동하는 10 염기 오버랩, 30 세포핵해야합니다. * Oligo의 중복은 적절한 범위를 보장하기 위해 스플 라이스 사이트에 가까이 증가한다; 10-20 세포핵에서 중복을 증가하면이 작업을 수행할 수 있습니다. </li><li> 수영장의 하류를 증폭하는 데 사용됩니다 보편적인 뇌관 시퀀스, 각 30 염기 oligo 측면. 기와 oligo 주문은 시퀀스가​​ 지정 oligonucleotide microarray의 인쇄됩니다 애질런트에 제출하여야한다. </li><li> microarray 표면에서 DNA를 oligos를 복구하기 위해서는 슬라이드에 배열 하이브 리다이 제이션 챔버의 배열 커버 슬라이드를 삽입하고 부드럽게 DH 2 O 500 μL를 pipetting으로 시작 </li><li> 표지 슬라이드 위에 샌드위치 배열, 프로세스를 중단 할 수 공기 방울을 피하기 위해주의한다. oligos과 측면이 수면에 닿으 있도록 배열 얼굴을 아래로 배치해야합니다. 엄지의 좋은 규칙은 배열에있는 애질런트의 라벨 커버 슬라이드 애질런트 레이블을 직면하는 &quot;애질런트 감동 애질런트&quot;이라는 의미입니다 </li><li> 하이브리드화 챔버를 닫고 하이브 리다이 제이션 오븐에 99 ° C에서 하룻밤 회전 </li><li> 다음날, 조심스럽게 챔버에서 배열을 제거하고 이제 oligos는 배열 표면에서 해방이 들어있는 물을, 빼다. 이것은 oligo 풀 수 있습니다 </li><li> 3~5초 펄스에 대한 1.5 ML Eppendorf 튜브에있는 수영장을 놓고 50 %의 진폭에 수영장 sonicate </li><li> 다음, 끝에 추가 T7 태그와 보편 primers를 사용하여 낮은 사이클 PCR에 의해 증폭 수영장. 에 대한 94에서 첫 라운드, 변성 ° C는 1 분, 20 초 동안 55 ° C에서 어닐링, 72시 1 분 길어지다 ° C. 후속 라운드 들어, 10 초, 20 초 10 초 72로 5 분 최종 신장 단계 ° C.으로 각 각 온도에서 할 수영장을 증폭하는 데 필요한 사이클의 수를는 oligo 복구의 효율성에 달려 있기 때문에, 여러 사이클 번호를 시도해야 할 수 있습니다. 아크릴 아미드 젤에 발랐습 밴드에 의해 의미있는 수영장,여 - 증폭하지 않도록주의하십시오. PCR 증폭 샘플이 필요 ° C까지 4 저장할 수 있습니다. </li><li> oligo 준비의 마지막 단계는 앰비온에서 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 RNA를 녹음하는 것입니다. * 다음과 같은 프로토콜은 앰비온에서 적응되었습니다 <ol class="lalpha"><li> 얼음 T7 효소 믹스를 유지하면서 상온에서 T7 10X 반응 완충액, 넷 ribonucleotide 솔루션 및 물을 녹여 </li><li> 상온에서 RNase 무료 microcentrifuge 관에서 반응 혼합물을 조립. 반응이 얼음에 혼합 경우 반응 버퍼의 구성 요소 촉진하기 위해 템플릿 DNA가 발생할 수 있습니다. </li><li> 다음과 같은 순서로, 피펫 3 μL nuclease - 무료 물, 10X 반응 완충액 2 μL, 각각 75 MM NTP 솔루션 2 μL, 템플릿 DNA 5 μL (PCR 증폭 oligo 수영장)과 T7 효소 2 μL에 대한 20 μL의 최종 부피 </li><li> 튜브 다음 간단히 튜브의 하단에있는 혼합물를 수집하는 microfuge 반응을 섞어 부드럽게 플릭. </li><li> ° C 2 시간 37 thermocycler에 반응을 품어. 배양 시간은 템플릿에 의존되며, 따라서 그것은 최대한의 수확량에 대한 최적의 배양 시간을 결정하는 시간 코스 실험을 사용해야 할 수도 있습니다 </li><li> 2 시간 후에, 추가 15 분 37 반응과 부화 터보 DNase 1 μL를 추가 ° C를하여 템플릿 DNA를 제거 </li><li> 반응을 종료하고 페놀 / 클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 RNA를 복구합니다. <ol class="lalpha"><li> 20 μL 반응 볼륨, DH 2 O의 115 μL와 반응 3 M의 아세트산 나트륨 15 μL를 추가합니다. </li><li> 클로로포름의 산성 페놀 75 μL의 75 μL를 추가 철저 다음 섞는다. 실온에서 13,000 rpm으로 일분 후 microfuge, vortexing하여 솔루션을 섞는다. 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송하고 추출을 반복 </li><li> 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송하고 클로로포름 150 μL를 추가합니다. 소용돌이 이전으로 혼합하고 원심 분리기. 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다. </li></ol></li><li> 수성 계층 100 % 차가운 에탄올의 두 볼륨을 추가하고 잘 혼합하여 RNA를 복구합니다. -20 15 분 최소 혼합물을 냉각 ° C 다음 4 원심 분리기 ° 펠렛 RNA 최대 속도로 15 분 C. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 0.1x 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TE) 버퍼 105 μL의 펠렛을 resuspend .. </li></ol></li><li> 그것은 T7 키트 반응에서 무료 세포핵의 모두 제거되므로 가장 정확한 결과를 얻으려면 RiboGreen를 사용하여 RNA를 계량하기가 어렵습니다. <ol class="lalpha"><li> quantitation를 시작하려면 먼저 2300 μL + 50μL/sample 충분한 1X TE를 희석. </li><li> 다음 RiboGreen합니다. 당신이 1000 필요합니다 μL + 50 μL / 샘플. 하이 레인지 샘플 (1 μg / ML 20 NG / ML)은 1X TE에서 RiboGreen 1:200를 섞어, 낮은 범위 샘플 (50 NG / ML 1 NG / ML)는 1X TE에서 RiboGreen 1:2000 믹스 ; 피펫 불투명 판의 각 우물에 RiboGreen 솔루션을 50 μL, A1으로 시작 아래로 이동하지 전체 </li><li> 이 하이 레인지 샘플 또는 100 NG / 낮은 범위의 샘플 μL에 대한 μg / ML하는 RNA 주식 솔루션을 희석 </li><li> 주식 솔루션을 사용하여 원래의 2 μg / ML 또는 100 NG / ML 재고 여섯 이후 1시 2분 dilutions하여 표준 곡선을 작성, PCR 스트립 관에 주식 피펫 240 μL합니다. 나머지 7 튜브에 피펫 1X TE 120 μL. 잘 RNA 재고 120 μL을 가지고, 튜브 2 섞는다. 튜브 2 120 μL를 가지고 튜브 3 섞는다. 튜브 7까지 반복합니다. 튜브 8 단 TE가되고 공란으로 표시됩니다. 불투명 판, A1으로 표준 곡선 솔루션의 피펫 50 μL : H2 (두 번 커브를 실행) </li><li> 새로운 튜브에 oligo 수영장 5 μL와 TE 45 μL를 혼합하고 RiboGreen 50 μL를 포함하는 잘하는 50 μL를 추가합니다. </li><li> 접시 리더를 사용하면 485 나노미터와 530 나노미터의 방출 파장의 여기 파장과 1 분 혼합 후 위로부터 형광 읽고 접시를 읽을 수있는 기계를 설정 </li><li> -20 ° C.에 저장해야합니다 복구된 RNA를 정할 생성된 표준 곡선을 사용 </li></ol></li></ol> 관심 RNP와 oligo 수영장의 공동 immunoprecipitation <ol><li> 이전 공동 immunoprecipitation을 시작하기 위해 A와 Invitrogen에서 단백질 G의 Dynabeads 반응 당 50 μL의 최종 볼륨에 1:1 비율로 그들을 혼합하여 단백질을 준비합니다. 예를 들어, 두 반응에 대해 50 μL 각 비드를 각각 추가합니다. </li><li> 당신은 차가운 1X PBS의 동일한 볼륨 두 번 뜨는을 제거하고 구슬을 씻어 동안 자리에 비즈를 잡아 Novagen에서이 같은 자성 분리 스탠드를 사용하여 </li><li> 두 번째 세척 후, 차가운 1X PBS의 동일한 볼륨에있는 구슬을 resuspend과 반응 당 항체 2 NG를 추가합니다. 이 금액은 항체에 따라 달라질 수 있습니다, 실험의 최적 조건을 찾을 필요가 있도록. </li><li> 4 항체 / 비드 혼합물은 밤새 품어 회전 플랫폼에서 ° C </li><li> 아침에 비 특정 바인딩을 차단 sonicated 효모 총 RNA의 반응 당 2 μg을 추가하고, 4 추가 30 분 회전 ° C. </li><li> 비즈를 잡아 자기 랙를 사용하면, 튜브에서 두번째로 세척에서 PBS를 떠나, 차가운 1X PBS로 두 번 뜨는을 제거하고 구슬을 씻으십시오. </li><li> 새로운 튜브, 각 튜브에 각각의 반응과 비드 혼합물의 나누어지는 50 μL에 대해 하나를 가져가라. 마스터 믹스를 준비하는 동안 비즈 앉아서 </li><li> 각각의 반응은 120 볼륨을 가져 200 oligo 수영장의 NG, 보호 primers의 몰 비율 sonicated 효모 총 RNA 2 μg, 헬라 핵 추출물 (이것은 RNP 소스입니다) 20 μL, 그리고 버퍼 E를 추가에 대한 μL. 보호 primers는 범용 primers의 RNA 버전입니다. 끝에 추가 T7 태그와 유니버셜 primers의 주문 전사 템플릿은 다음 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 템플릿에서 RNA를 고쳐 쓰다. </li><li> 마스터 믹스 120 μL의 비드 aliquots과 resuspend 구슬의 표면에 뜨는를 제거합니다. 4 ° C 1~2시간에 대한 반응을 바위. </li><li> 부화 후, 각 반응에 대해, &quot;총&quot;RNA 샘플을위한 작은 나누어지는을 (비즈 포함) 삭제 </li><li> 자성 분리 독립에 대한 반응의 나머지를 삽입하고 표면에 뜨는를 제거합니다. 이 샘플을 통해 하류 흐름이 분석하는 데 필요한 것은 아니지만, 그것은 저장하는 것이 유용할 수 있습니다. </li><li> 차가운 1X PBS 50 μL와 비즈 1-2 번 씻으십시오. 비즈에 대한 항체에 바인딩된 RNA는 &quot;IP&quot;예제입니다. </li><li> 0.1x TE 버퍼에 1% SDS 50 μL의 &quot;총&quot;과 &quot;IP&quot;구슬을 Resuspend하고 ° C 15 분 동안 RNA를 elute 65에서 샘플을 가열. </li><li> 이제 이전에 비즈로 바운드되어 에탄올 침전 다음 페놀 / 클로로포름 추출에 의해 깨끗한 RNA를 포함하는 표면에 뜨는를 제거합니다. 펠렛 건조 50 μL 0.1x TE 버퍼에 resuspend. </li></ol> aminoallyl 라벨에 대비하여 역방향 전사와 공동 IP 샘플의 증폭 <ol><li> 다음, RNA 샘플은 역방향 베꼈는데과 PCR은 증폭해야합니다. 반대 전사 반응은 반대로 보편 primers를 사용합니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 1 μL를 혼합하여 시작반대 범용 템플릿 RNA 1 μL와 뇌관 (immunoprecipitation 반응에서)와 DH 2 O를 10 μL ° 5 분 C는 다음 얼음에 진정 또는 4에서 보관 ° C. 70 반응 히트 </li><li> 샘플 냉각하는 동안 다음과 같은 마스터 믹스를 확인하십시오. 각각의 반응을위한 10 MM dNTPs 4 μL, 10X Arrayscript 버퍼 ​​2 μL, 1 μL RNase 억제제, 1 μL 역방향 전사 효소를 결합. 철저하게 혼합하고 각 역방향 전사 반응에 마스터 믹스 8 μL를 추가합니다. </li><li> 95 다음 2 시간 동안 42 ° C에서 샘플을 부화 ° 후 5 분 C, 4 ° C 샘플을 증폭에 필요한 때까지. PCR 기계를 사용 </li><li> 반대로 RNA 샘플을 해독 후, PCR은 T7 태그가 포함된 primers 중 하나의 보편 primers를 사용하여 증폭. 그것이 여러 사이클을 시도해야 할 수 있도록 수영장을 증폭하는 데 필요한 사이클의 개수는 공동 IP의 효율성에 따라 달라집니다. 각 반응은 10X DNA 형성 촉매 반응 버퍼, 각각의 프라이머 (100 ㎜), cDNA 템플릿 1 μL (역 전사 반응에서), 10 MM dNTPs 1 μL, DH 2 O의 42.2 μL의 0.2 μL 5 μL 있어야하고, DNA 형성 촉매 효소 0.4 μL. 3 분 94 ° C에서 샘플을 잠복기로 PCR을 시작합니다. 다음, 94 각 사이클, 변성에 대한 ° 45 초 동안 C는 30 초 동안 55 ° C를 어닐링, 10 분 72 ° C에서 최종 연신율과 일분 72 ° C에서 연장하다. </li><li> 다음 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 다시 샘플을 고쳐 쓰다, 그러나이 시간은 aminoallyl UTP 2 μL를 추가, 대신 T7 UTP니다. aminoallyl UTP는 싸이의 염료와 RNA 레이블을하는 데 사용됩니다. </li><li> 페놀 / 클로로포름과 에탄올의 샘플을 촉진. Glycoblue 또는 암모늄 아세테이트를 사용하지 마십시오, 둘 중 배열에 샘플의 하이브리드화를 방해할 수 있습니다. 0.1 M 나트륨 탄산염 4.5 μL의 펠렛 및 resuspend 건조. </li></ol> 싸이의 염료와 RNA의 아미노 알릴 라벨링 <ol><li> 라벨 프로토콜은 DMSO 45 μL에서, 형광 염료, cy3 및 cy5 각 디졸브 시작합니다. 빛을 피하려면, 어둠 속에 -20 ° C에서 알루미늄 호일과 저장소에있는 튜브를 랩 </li><li> RNA 샘플을 철저히 섞어 nuclease없는 물 2.5 μL 추가 </li><li> 다음, &quot;IP&quot;샘플에있는 &quot;전체&quot;샘플로 Cy3 3 μL와 Cy5 3 μL를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 샘플을 품어, 싸이 - 5은 파란색으로 바뀔 것이다 반면 싸이 - 3 샘플은 빨간색 또는 분홍색으로 바뀔 것이다. </li><li> 반응을 종료하기 위해, 각 샘플 4 M - 히드록 실 아민 HCL 6 UL을 추가 철저하게 혼합하고 짧게 스핀. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 0.1x TE 50 μL의 에탄올 강수량과 resuspend 펠렛 다음 페놀 / 클로로포름 추출에 의해 표시된 샘플을 정화 </li></ol> 애질런트의 배열 하이브 리다이 제이션 키트를 사용하여 microarray에 샘플을 잡종 <ol><li> 부드럽게 10X 차단 버퍼의 μL nuclease 무료 H2 O, Cy3 - 라벨 &quot;총&quot;수영장, Cy5 - 라벨 &quot;IP&quot;수영장의 25 μL의 25 μL, 10 140 μL의 50 μL를 혼합하여 하이브 리다이 제이션을 시작 25x 조각 버퍼와 2X 하이브리드화 버퍼 250 μL은 거품을 소개 않도록주의한다. 간단히 튜브의 바닥에있는 솔루션을 수집하고 또한 거품을 줄이기 위해 샘플을 Microfuge. </li><li> 하이브 리다이 제이션 챔버에 O - 링 커버 슬라이드를 삽입하고 조심스럽게 슬라이드에 솔루션을 피펫. </li><li> &quot;샌드위치&quot;솔루션을 위해 커버 슬라이드 위에 감지 배열을 놓습니다. 배열에있는 애질런트의 라벨 커버 슬라이드 애질런트 레이블을 직면 수 있도록 방향 배열 슬라이드 것을 잊지 마십시오. </li><li> 하이브 리다이 제이션 챔버에서 슬라이드 / 배열 샌드위치를​​ 고정하고 3 시간 동안 50 ° C에서 회전. </li><li> 배열 회전하는 동안, 50 - ML 원뿔 튜브에 다음과 같은 50 ML 솔루션을 하나 원뿔 DH 2 O, 별도의 튜브에 두 1X SCC 버퍼 솔루션, 각 한 2X SCC 버퍼 50 ML 가득. </li><li> 3 시간 배양 후, 신중하게 배열 / 슬라이드 샌드위치를​​ unclamp하고 2X SCC 버퍼를 포함하는 50 ML 원뿔에 놓으십시오. 족집게 한 켤레를 사용하여 부드럽게 커버 슬라이드에서 배열을 분리하여 커버 슬라이드를 빼낸다. 슬라이드가 꺼내와 같이 배열을 만지지 않도록주의하십시오. 원뿔을 닫고 부드럽게 60 초 동안 반전. </li><li> 족집게를 사용하여 1X SCC 솔루션에 배열을 전송, 튜브를 마개, 그리고 조심스럽게 1X SCC 솔루션에 배열을 전달하고 다시 부드럽게 다른 분에 대한 반전 후 1 분 반전. </li><li> 마지막으로, DH 2 O의 튜브에 배열을 전달하고 부드럽게 30 초 동안 반전. </li><li> Kimwipe에있는 슬라이드의 가장자리를 배치하여 배열을 건조. 의 배열을 회전 계속 oligos를 포함하는 측면을 방해하지 않도록해야 할 닦으십시오. </li><li> 에서 건조 배열을 플레이스Microarray 스캐너와 빈 50 ML 원뿔 튜브 및 검사 </li></ol> Microarray를 해석 <ol><li> microarray 스캐너는 배열의 TIF 이미지를 생성합니다. 특정 수영장에 고유한 그리드 파일 (애질런트가 제공하는)를 사용하여 애질런트 기능 추출 소프트웨어를 통해이 이미지를 실행합니다. </li><li> 애질런트 소프트웨어는 펄 스크립트 구문 분석 파일을 만들고, 각 기능에서 신호를 해석합니다. 각 기능에서 신호가 해당 채널의 총 농도로 정상화됩니다. 녹색 채널에 특정 기능에 예를 들어, 각각의 기능에 대한 녹색 채널의 강도는 모든 기능을 통해 녹색 채널의 총 농도로 나눈 값입니다. 최종 출력은 배열에있는 각 기능의 녹색 채널을 통해 적색 채널의 로그 비율이다. </li><li> microarray에서 oligo 풀 데이터의 사진을 얻을 수있는 게놈으로 다시 매핑하고, 어떻게 강하게, 관심 RNP는 바운드 수 있습니다. </li></ol> 그림 1. 실험 개략도 <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="그림 1A" /> A.이 계획을 기와. 선택한 관심 사전 mRNA 시퀀스를 다운로드 후, 선택 영역은 그 10 뉴클레오 티드 단위로 교대 30 뉴클레오 티드 창문을 통해 타일​​입니다. 윈도우 유니버셜 프라이머 결합 사이트 플랭크 각 측면. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="그림 1B" /> B. 합성 배열입니다. 기와 oligo 주문은 시퀀스가​​ 지정 oligonucleotide microarray의 인쇄됩니다 애질런트에 제출하여야한다. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="그림 1C" /> C. 공동 immunoprecipitation. 배열에서 oligos를 끓는 후, 헬라 핵 추출물에서 부화 후 관심 RNP에 대한 항체와 준비가되어 자기 구슬로 추출을 추가합니다. Cy3와 함께 시작 oligo 수영장과 Cy5와 바운드 IP 수영장을 분류하고 감지 배열 및 스캔에 적용됩니다. 그림 2. 와 게놈 및 농축 데이터의 분석을 주석. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="그림 2" /> A.는 평균 기지 - 텐 로그 배열 데이터에서 각 게놈 조정에 점수와지도를 변환하는 주어진 좌표로 점수. 이 평균 단계의 그림 3은 각 10 NT 윈도우의 평균 농축 점수가 위의 그래프는 2 득점, 4 및 0.5, 30 - NT의 oligos를 중복을 위해 제공됩니다. 선택한 게놈 영역은 USCS의 게놈 브라우저에서 사용자 지정 추적을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 주어진 예제 브라우저 창이 유전자 기능 (exons / introns / 대체 splicing 등) 진한 빨간색 세로 막대로 표시됩니다 PTB - 바운드 oligos에서 아래와 로그 평균 농축 성적 따라 부여됩니다 clta 유전자에있다. PTB 적극 polypyrimidine 트랙트에 불과 상류 엑슨 2 바인딩합니다.

수영장의 생성을 기억하는이 절차는 중요 할 때하면 RNA 또는 단백질 수준 중 하나에서 유연하고 수정하기 위해 열려 있습니다. RNA 수준에서 orthologous 지역 질병 돌연변이, polymorphisms, 또는 무작위 돌연변이 oligonucleotide 순서에 소개하실 수 있습니다. 단백질 수준에서 RNA 바인딩 요소는 인산화 또는 다른 게시 translational 수정하여 수정할 수 있습니다. 또한 바인딩 환경 중 상호 작용이나 관심의 RNA ?...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

RNA 결합 단백질과 공동 immunoprecipitate (CO - IP)는 해당 바인딩 위치를 입증하여 splicing 우리의 이해를 증가했음을 RNAS를 배열하는 것은 종종 splicing 요소의 기능에 영향을 미칩니다. 그러나, 같은 샘플링 전략 splicing 요소에 바인딩된 RNA를 식별의 기회는 셀룰러 풍요에 비례합니다. 우리는 사전 mRNA 달리 과도에 대한 결합 특이성을 조사에 대한 체외 방식의 소설을 개발했습니다. 이 방법은 특별히 설계된 oligonucleotide 풀을 활용되는 introns, exons, 스플 라이스 분기점 또는 사전 mRNA 기타 전체 타일. 수영장은 분자 선택 어떤 종류의를 받게됩니다. 여기, 우리는 바운드와 언바운드 분수에 oligonucleotide를 분리하여 방법을 설명하고 바운드 분수의 각 oligonucleotide의 강화를 기록 두 색상 배열 전략을 사용합니다. 배열 데이터는 순서 특정 및 구조 사전 mRNA에 대한 구속력을 ribonucleoprotein (RNP)의 determinates 식별하는 능력을 가지고 고해상도지도를 생성합니다. 수영장이 특별히 사전 mRNA 순서에서 설계하고 합성이므로이 방법으로 독특한 장점은, 현재 IP와 S​​ELEX 기법과 관련된 mRNA 대한 샘플링 바이어스를 방지하는 기능입니다. 실험자들이 그들의 개인적인 필요에 수영장을 조정, 전체 연구 기와하는 지역을 선택 이후 oligonucleotide 수영장의 유연성은 또 다른 장점이라고 생각합니다. 이 기법을 사용, 하나는 분석 대규모 구속 또는 기능 splicing 기자로 라이브러리를 복제하고 포함 분수에 농축되는 oligonucleotides를 식별에 polymorphisms이나 돌연변이의 효과를하실 수 있습니다. 체외 고해상도 매핑 스키마에서이 소설은 낮은 풍부한 생체내 기술의 현재와 공부하기 어렵 만드는 과도 사전 mRNA 종과 RNP 상호 작용을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수 있습니다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 여기, 우리는 소설을 제시<em&gt; 체외에서</em합성 oligo 풀을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 조사하기&gt; 접근되는 미리 mRNA의 선택 지역에 걸쳐 타일.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

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Research

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Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K 조회수.  Brown University. 사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수 있습니다 생체내에. 여기, 우리는 소설을 제시 체외에서 접근되는 미리 mRNA의 선택 지역에 걸쳐 타일.

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

연구

생물학

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

색채 금 나노 입자 분석에 적용 구조 전환 앱 타머를 선택하는 방법

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...