당사의 프로토콜은 오르가노이드의 구조적 복잡성을 시각화하는 데 사용할 수 있으며, 단일 셀 해상도에서 이러한 3D 구조에서 정체성, 황산염 및 분포를 매핑할 수 있습니다. 당사의 빠른 3일 프로토콜은 다양한 기원의 오르가노이드에 완전히 최적화되어 있으며 무독성 광학 클리어링 단계와 실리콘 기반 장착 방법을 포함하는 간단한 샘플 준비를 사용합니다. 프로토콜은 간단하지만 일부 프로토콜은 조직된 처리 또는 슬라이드 준비와 같은 중요한 단계로 텍스트를 통해보다 시각적 데모를 통해 더 잘 설명할 수 있습니다.
지하 멤브레인 추출물에서 재배된 100~500마이크로미터 직경의 오르가노이드를 24개의 웰 플레이트로 회수하려면 3D 행렬을 방해하지 않고 PBS로 수확할 수 있는 각 용접을 세척하고 접시를 얼음 위에 놓습니다. 각 우물에 얼음 차가운 복구 용액 1 밀리리터를 추가하고 30~60분 동안 수평 셰이커에 플레이트를 4°C의 수평 셰이커에 놓습니다. 1밀리리터 파이펫 팁을 PBS 솔루션의 1%BSA에 넣고 파이펫을 두 번 위아래로 찍어 각 팁을 BSA로 코팅합니다.
다음으로, 1%PBS BSA의 5밀리리터를 조건당 15밀리리터 튜브에 추가하고, 튜브를 폐기하기 전에 튜브를 2~3회 반전하여 튜브 내부를 코팅합니다. 오르가노이드를 수집하려면 코팅 된 팁을 사용하여 우물 내용물을 5 ~10 번 부드럽게 다시 중단하고 코팅 된 단일 15 밀리리터 튜브에서 각 조건에서 모든 오르가노이드를 당깁니다. 모든 오르가노이드가 수집되었는지 확인하기 위해 얼음 차가운 1 % PBS BSA의 1 밀리리터로 각각 잘 헹구고 세정을 적절한 튜브로 옮춥시다.
차가운 PBS를 사용하여 각 튜브의 최종 부피를 최대 10 밀리리터로 가져오고, 원심분리에 의한 오르가노이드를 퇴적시켜 3D 매트릭스의 가시층 없이 단단한 팔레트를 얻습니다. 오르가노이드를 고치려면 코팅된 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 각 펠릿을 얼음 차가운 파라 포름알데히드 1밀리리터로 조심스럽게 다시 중단하고 45분 동안 섭씨 4도에서 수정합니다. 고정 시간을 통해 중간에 유기체를 부드럽게 다시 중단합니다.
45분 후, 각 튜브에 얼음 차가운 PBS 10 밀리리터와 트위넨 20개를 넣고 반전으로 부드럽게 섞은 후 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 배치합니다. 오가노이드를 차단하기 위해, 배양의 끝에, 샘플을 회전하고 도금될 우물 당 얼음 차가운 오르간 세척 버퍼의 적어도 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 오가노이드를 24개의 웰 서스펜션 플레이트의 개별 우물로 4°C에서 15분 간 배양합니다.
면역 라벨링을 위해 200 마이크로리터의 오가노이드 세척 버퍼를 빈 참조에 잘 추가하고 오르가노이드가 플레이트 의 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 오르가노이드가 정착되면, 마지막 200 마이크로리터를 제외한 모든 세척 버퍼를 제거할 수 있도록 접시를 45도 각도로 기울입니다. 다음으로, 관심있는 1 차 항체를 포함하는 오르가노이드 세척 버퍼200 마이크로 리터를 추가하고, 가벼운 흔들림과 분당 40 회전에서 흔들리는 섭씨 4도에서 하룻밤 접시를 놓습니다.
다음 날 아침, 각 우물에 오르가노이드 세척 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 오르가노이드가 3 분 동안 접시의 바닥에 정착 할 수 있도록합니다. 오르가노이드가 정착되면, 각 우물에서 마지막 200 마이크로 리터를 제외한 모든 제거하고 신선한 오르가노이드 세척 버퍼의 1 밀리리터와 부드러운 흔들고 세척 당 흔들리는 세 개의 2 시간 세척으로 오르가노이드를 씻으세요. 세 번째 세척 후, 오르가노이드가 접시 바닥에 3 분 동안 정착한 후 각 우물에서 장기 세척 버퍼의 마지막 200 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 제거하십시오.
온화한 동요와 흔들림과 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복에 대 한 각 우물에 적절 한 이차 항체를 포함 하는 오르가노이드 세척 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가 합니다. 다음 날 아침, 시연된 대로, 세차당 신선한 오르가노이드 세척 버퍼 1밀리리터로 3개의 2시간 세척으로 오르가노이드를 씻는다. 마지막 세척 후, 유기체를 우물당 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리로 오르가노이드를 수집합니다.
오르가노이드의 광학 클리어링을 위해, 오르가노이드를 방해하지 않고 가능한 한 각 튜브에서 많은 세척 버퍼를 제거하고 수정 된 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 각 펠릿에 FUnGI의 최소 50 마이크로 리터를 추가하십시오. 실온에서 20분 동안 인큐베이션을 한 후 오르가노이드는 섭씨 4도에서 최대 1주일 또는 영하 20도에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법에 의한 오르가노이드 이미징슬라이드를 준비하려면 실리콘 실란트로 10밀리리터 주사기를 채우고 수정된 200 마이크로리터 파이펫 팁을 주사기에 부착합니다.
주사기를 사용하여 슬라이드 중간에 1x 2cm의 직사각형을 그리고 두 번째 수정된 200 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 클리어된 오르가노이드를 사각형 중앙에 배치합니다. 커버 슬립을 오르가노이드 위에 놓기 위해 커버의 왼쪽을 먼저 내려놓은 후, 덮개를 왼쪽에서 오른쪽으로 천천히 내리면 공기가 갇히지 않도록 합니다. 그런 다음 커버 슬립의 모든 가장자리에 압력을 부드럽게 적용하여 실리콘 실란트에 단단히 부착합니다.
오르가노이드를 이미지화하려면 슬라이드를 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 단계에 배치하고 공초점 이미징을 위한 다중 침지 25 X 목표를 선택합니다. 현미경을 적절한 획득 설정으로 설정하여 낮은 레이저 전력을 선택하여 사진 표백을 줄입니다. Z 스택 모드를 사용하여 하부 끝 상한을 정의하고 Z 단계 크기를 최적으로 설정합니다.
큰 오르간구체 구조 또는 다중 오르가노이드를 함께 이미징할 때 10%가 겹치는 타일링 모드를 사용하여 관심 영역을 나타냅니다. 모든 파라미터가 설정된 경우 이미징 소프트웨어에서 이미징의 3D 렌더링 된 표현을 얻고 밝기, 대비 및 3D 렌더링 속성을 최적화합니다. 그런 다음 결과의 RGB 스냅샷을 TIFF 파일로 내보냅니다.
2D 이미징에 비해 3D 이미징의 강도는 입증된 대로 생성된 마우스 유방 선 동맥 오르가노이드의 이러한 이미지에 의해 설명된다. 이러한 대표적인 오르가노이드의 중앙 층은 기둥 모양의 K8/K18 양성 발광 세포로 구성되며, 외부 층은 긴 K5 양성 바질 세포를 함유하고 있으며, 생체 내에서 유방 선의 형태를 재구성한다. 이 편광 조직은 동일한 오르가노이드의 2D 광학 섹션에서 감사하기가 어렵습니다.
3D 정보 없이 해석할 수 없는 복잡한 구조의 또 다른 예는 인간 간 오르가노이드의 담즙 액의 수집을 용이하게 하는 MRP2 양성 카날리큘리의 네트워크이다. 또한, 얻은 품질과 해상도는 반자동 세분화 및 이미지 분석을 허용합니다. 따라서, 전체 세포 수 와 마커의 존재는 전체 유기체에서 특정 세포 아류형에서 정량화 될 수있다.
140세포를 포함하는 전체 유기체의 핵을 분할함으로써, Ki67 세포 주기 마커에 대해 높은 양성성을 나타내는 3개의 세포를 확인할 수 있다. 광학 클리어링 에이전트, FUnGI, 오르가노이드 내에서 깊은 형광 신호 품질에서 불분명하고 과당 - 글리세롤 클리어링을 능가합니다. FUnGI클리어 오르가노이드는 불분명한 오르가노이드에 비해 전반적인 향상된 형광 강도를 보여줍니다.
샘플에 남은 BME는 항체 침투가 감소될 수 있으며 높은 배경 신호로 이어질 수 있습니다. 또한 낭포성 오르가노이드가 붕괴되면 광학적으로 지워서는 안됩니다. 프로토콜에 약간의 적응을 통해 샘플은 초해상도 공초점, 멀티 광자 및 광판 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.
