세포 및 세포 내 분해능에서 3D 체외 모델을 특성화하는 것은 완전한 활용을 위해 중요하지만 어려울 수 있습니다. 따라서 우리는 100 마이크로 미터에서 수 밀리미터에 이르는 고정 3D 시험관 내 모델의 염색 및 세포 내 해상도 이미징을위한 무료 프로토콜을 제공했습니다. 3D 구조는 방사형이므로 신중하게 조작해야 합니다.
파이펫팅하기 전에 튜브 내에서 3D 구조물의 위치를 확인하여 흡인을 피하십시오. 오가노이드 또는 스페로이드와 같은 작은 구조의 임베딩을 위해 고전적인 기술을 적용했기 때문에 시각화된 지침은 처음 사용자가 작업을 보다 쉽게 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 병리학 연구 플랫폼의 실험실 기술자 인 Laura Francols가 될 것입니다.
3D 전체 마운트 염색을 위한 샘플을 준비하려면 BSA로 사전 코딩된 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 500마이크로리터 PBS 튜브에 1밀리리터 3D 구조 현탁액을 추가합니다. 3D 구조가 튜브의 바닥에 정착되면 PBS를 500 마이크로 리터의 투과화 차단 용액으로 조심스럽게 교체하여 분당 30-50 회전의 부드러운 수평 교반으로 실온에서 1 시간 배양합니다. 배양이 끝나면 3D 구조물이 다시 침전되도록 한 후 세척당 3분 동안 BSA가 보충된 0.1%PBS 1밀리리터에 3D 구조물을 2회 조심스럽게 세척합니다.
마지막 세척 후 PBS에서 250마이크로리터의 1차 항체로 3D 구조물을 섭씨 4도에서 부드러운 수평 교반으로 2-3일 동안 라벨링합니다. 인큐베이션의 끝에, 샘플을 세척 당 0.1%PBS BSA의 1 밀리리터에서 5회 3분 및 2회 15분 세척으로 세척한다. 마지막 세척 후, 빛으로부터 보호되는 부드러운 수평 교반으로 섭씨 4도에서 24시간 동안 PBS에 250마이크로리터의 적절한 2차 항체로 3D 구조물을 라벨링합니다.
다음날, 3D 구조물에 Hoechst 3342의 적절한 농도 250마이크로리터로 라벨을 붙여서 섭씨 4도에서 부드러운 수평 교반으로 2시간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에, 3D 구조물을 3분 동안 5회 세척하고, 입증된 바와 같이 세척당 1 밀리리터의 PBS로 15분 동안 2회 세척한다. 마지막 세척 후 3D 구조물을 96웰 검정색 폴리스티렌 마이크로플레이트로 옮기고 기포를 피하면서 200마이크로리터의 투명화 용액을 구조물에 부드럽게 추가합니다.
그런 다음 알루미늄 호일로 덮인 판을 섭씨 4도에서 최소 48 시간 동안 놓습니다. 대형 3D 세포 배양 모델을 내장하려면 BSA 코팅 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 3D 구조를 PTFE 라이닝 병 뚜껑이 있는 평평한 바닥 유리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 구조가 침전된 후 PBS를 70% 에탄올로 조심스럽게 교체하여 실온에서 30분 배양합니다.
배양이 끝나면 70 % 에탄올을 1 밀리리터의 에오신 Y 용액으로 교체하십시오. 튜브를 튕기고 적어도 30 분 동안 구조물을 얼룩지게하십시오. 배양이 끝나면 세척 당 100 % 에탄올 1 밀리리터에서 3 회 연속 30 분 세척으로 구조물을 탈수시킵니다.
마지막 탈수 후 화학 후드 아래에서 세척 당 1 밀리리터의 크실렌으로 3 회 연속 30 분 세척하여 3D 구조를 제거합니다. 마지막 크실렌 침지 후 자일렌에 적신 생검 패드 조각을 흰색 마이크로트윈 티슈 카세트의 한 구획에 넣고 BSA 코팅 2밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 3D 구조를 패드로 옮깁니다. 3D 구조물을 다른 크실렌에 적신 생검 패드로 덮어 3D 구조물을 제자리에 고정하고 카세트를 닫습니다.
모든 샘플이 옮겨지면 카세트를 섭씨 65도 파라핀 욕조에 30 분 동안 넣은 다음 카세트를 섭씨 65 도의 신선한 파라핀 욕조에 밤새 두십시오. 다음날 아침, 샘플 당 하나의 섭씨 65도 예열 된 임베딩 몰드에 액체 파라핀을 추가하고 하나의 파라핀 내장 샘플을 각 몰드에 넣습니다. 모든 3D 구조가 바닥으로 떨어질 때까지 금형을 부드럽게 저어주고 섭씨 65도의 예열된 미세 집게를 사용하여 각 금형의 중앙에 3D 구조를 배치합니다.
파라핀이 얇은 고체 층을 형성하여 3D 구조를 제자리에 고정할 때까지 금형을 냉각합니다. 티슈 카세트를 놓고 금형 위에 뜨거운 파라핀을 추가합니다. 파라핀이 완전히 고형화되면 금형을 제거하십시오.
소형 3D 세포 배양 모델을 내장하려면 세척당 1밀리리터의 TBS로 3D 구조를 3회 부드럽게 세척합니다. 마지막 세척 후 구조물을 건드리지 않고 가능한 한 많은 TBS를 제거하고 상업용 파라핀 임베딩 키트에서 시약 2 방울을 추가합니다. 두드려서 부드럽게 섞고 젤이 굳을 때까지 두드려서 시약 두 방울을 추가합니다.
미세한 집게를 사용하여 키트에서 사전 조립된 카세트의 웰에서 겔을 옮기고 표시된 대로 흄 후드에서 30분 오름차순 에탄올 및 크실렌 배양으로 겔 내장 샘플을 탈수합니다. 마지막 크실렌 침지 후 카세트를 섭씨 65도의 파라핀 수조에 밤새 넣은 다음 미세한 집게를 사용하여 파라핀 내장 샘플을 섭씨 65도 예열된 액체 파라핀이 로드된 임베딩 몰드의 중앙으로 옮깁니다. 그런 다음 대형 3D 세포 배양 모델에 대해 입증된 대로 파라핀 층을 하나 더 사용하여 3D 구조를 고정합니다.
3차원 전체 마운트 염색 및 컨포칼 현미경은 최대 200미크론 깊이의 필드까지 3D 배양 모델의 세포 구성 및 공간 위치에 대한 시각적 정보를 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 3D 구조에 대해 얻을 수 있는 고분해능을 통해 세포 수의 정량화와 다양한 세포 하위 유형 내의 다양한 세포 마커 검출을 위한 세포 및 세포하 분할 알고리즘을 적용할 수 있습니다. 3D 전체 마운트 분석은 전체 구조에 관계없이 최대 200미크론 깊이의 시각화된 셀에 적용할 수 있습니다.
반대로 2D 단면 분석은 모든 크기의 세포에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
