이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 자금 지원에 의해 가능하게되었다. JM (080964)와 SCW (080948)는 말라위 리버풀 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에 재학 의해 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 장학금 및 DT에 의해 지원되었다.

1. 시료 채취 혈소판은 쉽게 온도, 교반 또는 스토리지를 통해 활성화 될 수 있으므로 그들은 조심스럽게 취급해야합니다. 혈소판 준비를위한 혈액을 수집 vacutainers의 사용은 대부분의 임상 상황에서 피할 수 있지만, 흡입 가능성이 혈소판 활성화를 일으킬 수 있으므로 신중하게 고려되어야한다. 우리의 연구 병원에서 사용하는 임상 프로토콜로 인해, 우리의 견본을주의 깊게 구연산 나트륨 vacutainers에 수집됩니다. 우리는이 또는 우리의 이전 연구 12 조기 혈소판 활성화에 대한 어떤 문제가 발생하지 않았습니다. 우리는 비특이적 혈액 그룹 항원 응집을 최소화하기 위해 혈액형 O + 개인의 혈소판 준비를위한 혈액을 수집합니다. 기증자는 또한 일부 약물은 혈소판 기능에 영향을 미치는 알려진대로 이전 7-10 일에서 약물을 촬영하지 않았습니다. 혈소판이 풍부한 혈장의 1.1 준비 (PRP) <ol><li> 약 5 mL를 수집CM 심한 말라리아 (SM) 구연산 나트륨 vacutainer 환자 (BD 제품 번호 36276)에서 말라리아 순진 호스트 또는 혈액의 2.5 ML에서 전혈. </li><li> 실온에서 10 분 250 XG에서 전체 혈액을 원심 분리기. 낮은 온도가 집계 혈소판의 원인이 될 수 있습니다 ° C로 4에서 원심 분리하지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 15 ML 튜브에 흐린 뜨는을 전송합니다. 혈소판은 쉽게 온도 변화 및 물리적 충격에 의해 활성화되어 있으므로 취급에주의해야한다. 동요 또는 관의 육포 움직임을 피하십시오. </li><li> &gt; 300 혈소판 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자에 대한 μL와 &lt;150 × 10 3 혈소판 / CM 및 1X 인산염 완충액 (pH가 7.2-7.4, PBS)를 사용하여 SM 환자에서 μL. 혈소판을 완화하고 정확성을 보장하기 위해 높은 희석 배수를 선택해야합니다. </li></ol> 참고 : 말라리아 퍼트의 ients는 건강한 개인 16,17,18에 비해 감소 된 혈소판 수 있습니다. CM 및 UM에 대한 그러므로 혈소판 농도는 각 말라리아 진단 그룹 내에서 환자의 평균 혈소판 수에 따라 조정됩니다. P. falciparum의 응집 표현형 CM 균주에서 흔히 혈소판 농도가 모든 CM의 경우 표준화되어 있기 때문에 덩어리의 크기 나 빈도에 영향을주지 않는 강한 결합력 때문에 감소 된 혈소판 농도를 표시합니다. 혈소판 가난한 플라즈마의 1.2 준비 (PPP) <ol><li> PPP를 얻으려면, 10 분 1,500 XG에서 위에서 얻은 PRP의 일부를 원심 분리기. 혈소판의 대부분은 튜브의 바닥에 침전이다. </li><li> PRP와 PPP 모두 최대 2 주에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이상적으로, 응집 분석을 위해 신선한 혈소판을 사용합니다. 8-10일 후 혈소판의 대부분은 비활성 아마 집계 될 가능성이 있습니다. </li></ol> 2. 항ITE 문화 <ol><li> 5 분 370 XG에서 원심 분리하여 5-10 ML RPMI 1640 펠렛 pRBC 세 번 씻으십시오. 참고 :이 프로토콜의 모든 문화가 약​​ 1 ML 포장 세포 볼륨 (PCV)에서 시작하고 5 %의 용적률로 유지. 문화는 pRBC의 PCV 시작하고 원하는 혈소판에 도달하는 감염되지 않은 RBC와 미디어를 적절하게 조정할 수 있습니다. </li><li> 25 MM의 HEPES, 5 % Albumax II 또는 10 %의 혈청 및 40 ㎍ / 5 % 용적률을 달성하기 위해 ML의 젠타 마이신과 보충 RPMI 1640 표준 말라리아 배지와 배양 플라스크 보충 pRBC를 놓습니다. </li><li> 씰링 및 배양하기 전에 92.5 %의 질소, 2.5 % 산소와 5 % 이산화탄소의 혼합과 문화 플라스크를 침투. 또한, Trager-젠슨의 빵빵한 촛불 항아리 방법을 사용할 수 있습니다. </li><li> pRBC 환자로부터 직접 획득을 위해, 성숙한 기생충을 얻기 위해 5 % CO 2에서 37 ° C 배양기에서 24-36 시간 동안 그들의 문화 플라스크를 품어. 참고 : MOST 실험실과 문화 적응 라인은 표준 조건 하에서 문화를 유지하는 것은 매우 쉽습니다. 성장률을 유지하기 위해 다른 기생충 단계를 동기화하는 데 사용할 수있는 아래에 설명 된 간단한 기술이 있습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로가는 혈액 얼룩을 준비하고 광학 현미경으로 기생충 성숙을 검사합니다. </li></ol> 3. 얇은 피 필름 슬라이드 준비 <ol><li> 평평한 표면에 쉬고 젖빛 유리 슬라이드의 한쪽 끝에서 혈액의 약 10 ~ 15 μl를 놓습니다. </li><li> 혈액이 균등하게 두 번째 슬라이드의 가장자리에 분산 될 때까지 두 번째 슬라이드의 가장자리 혈액의 드롭을 누릅니다. </li><li> 첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 발휘하지 않고, 신속하게 조심스럽게, 각도 45 °에서 두 번째 슬라이드를 누른 상태에서 균일하게 분산되어 혈액의 박막을 만드는 첫 번째 슬라이드에 걸쳐 혈액을 밀어 넣습니다. 건조한 공기. </li><li> 10 초 동안 메탄올에 슬라이드를 찍어. 건조한 공기. </li><li> 2 % Giemsa 성에서 슬라이드를 찍어적어도 10 분 동안 아인. 물이 나올 때까지 광범위하게 씻어 낸다. 건조한 공기. </li><li> 가벼운 현미경 90 100X 오일 에멀젼 렌즈를 사용하여 슬라이드를 검사 </li></ol> 4. 성별이 단계의 정제 및 동기화 성숙한 P.의 정화 falciparum의 pRBC는 응집 분석에 필요한 단계입니다. 실제로, 단지 성숙 기생충은 해당 리간드가 표현 감염된 적혈구의 표면에서 돌출되는이 수명주기 단계에로 혈소판 수용체에 결합 할 수있다. P.의 무성 단계를 정화하고 동기화하는 방법은 여러 가지가 있습니다 원충 : 늦은 무성 단계가 Percoll 기울기 19을 충실 할 수 있으며, 20 정렬 또는 젤라틴 침전 21 프로토콜을 사용하여 자기 세포는 여기에 설명.. 소르비톨 동기화는 (아무 N에 고리가 성숙 단계를 얻기 위해 24 ~ 26 시간 동안 배양 한 후, 링 단계 22으로 선택) 젤라틴 부양을 수행 할 EED. 4.1 Plasmagel의 부상 Plasmagel 부양은 밀도가 링 형태와 근엽이 바닥으로 가라 동안 낮은 무게 용액에 남아있는 적혈구를 혹 모양은 선택할 수있는 젤라틴과 같은 솔루션을 사용합니다. 이 기술은 성숙 단계에 감염된 적혈구의 90 % 순도를 포기하고 필드와 실험실 균주 모두에 사용할 수 있습니다. 그러나, 앞서 언급 plasmagel 부양은 rosetting pRBC뿐만 아니라 높은 rosetting 주파수와 그 샘플에서 감소 응집 주파수에서 발생할 수 미성숙 단​​계를 제거합니다. 응집은 혈소판에 의해 pRBCs 바인딩 매개하는 동안 rosetting이 pRBC과 감염되지 않은 적혈구의 상호 작용이기 때문에, plasmagel 부양 후 rosetting pRBC의 부재는 응집 분석에 영향을주지 않습니다. 이러한 두 가지 특성에 관련된 리간드는 다른, 주로 rosetting을 매개 감염되지 않은 적혈구의 수용체 CR-1을 보완와 함께.<ol><li> ° C의 물을 욕조에 37 Prewarm Gelofusine 솔루션 및 혈청 / Albumax II - 무료 매체. </li><li> 5 분 370 XG에 실온에서 원심 분리하여 깨끗하고 멸균 15 ML 튜브 및 펠렛 세포에 문화를 전송할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음하는만큼 Gelofusine과 단백질이없는 매체의 동일한 볼륨 펠렛과를 Resuspend 세포를 방해하지. </li><li> 멸균 15 ML 튜브에 혼합물을 전송하고 명확한 경계가 상부와 하부 레벨 사이에 볼 수있을 때까지 37 ° C 배양기에서 15 ~ 20 분 동안이나 방치. </li><li> 조심스럽게 신선한 멸균 15 ML 튜브에 상위 레이어를 전송하고 신선한 RPMI의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 370 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 얇은 혈액 얼룩에 의해 parasitaemia 및 발달 단계를 평가하고 4 장에서 설명한대로 빛을 현미경으로 검사합니다. </li></ol> 참고 : 감염된 적혈구 dependi 60-90 % 범위 성숙한 pRBC 범위문화의 초기 parasitaemia에 NG. 성숙 기생충의 높은 비율을 위해, ≥ 10 %의 초기 parasitaemia와 문화를 사용합니다. 5. 분석을 응집 <ol><li> 1 plasmagel 부상 후 얻은 pRBC 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 8 μL / pRBC. </li><li> 신선한 1.5 ML 튜브에 20 ㎍ / 총 부피의 10 %에 ML 최종 농도와 PRP 5 %의 용적률, 아 크리 딘 오렌지에서를 Resuspend pRBC. 대신 크리 딘 오렌지, 기생충 문화는 사용하기 전에 5 분 동안 25 ㎍ / ㎖ ethidium의 브로마이드 물들 일 수 있습니다. 200 μL 반응 혼합을 위해 예를 들면, 10 μL 성숙한 pRBC, 300 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자 또는 150 × 10 3 혈소판 / SM 환자에서 μL 단백질이없는 배지 170 μL에서 PRP에 대한 μL의 20 μL를 추가합니다. 참고 : 혈소판의 비율 : pRBC 최종 반응에 20:1입니다. 격언이 허용되는이 중요합니다음 시료의 응집 주파수를 결정합니다. 적은 수의 혈소판이 컨트롤에 추가하는 경우 다음 모든 응집 pRBCs는 덩어리로 기회를 가질 수 없습니다. </li><li> pRBCs의 응집에서 혈소판의 역할을 확인하기 위해 감염되지 않은 적혈구 세포와 PRP와 PPP와 pRBC, 같은 방법으로 다음 컨트롤을 준비합니다. </li><li> 1.5-2.0 ML 원뿔 스크류 캡 병에 현탁액을 전송합니다. </li><li> 실온에서 10 ~ 12 rpm으로 회전에 의해 교반에 따라 병을 놓습니다. </li><li> 유리 미끄러 형광의 밑에 검사와 커버 pRBC의 10 μl를 피펫으로 제조 젖은 슬라이드 ± 유리 슬라이드에 혈소판 믹스 덩어리 형성을 확인합니다. </li><li> 샘플링은 120 분의 총 15 ~ 20 분 간격으로 수행 할 수 있습니다. 덩어리가 세 개 이상의 감염된 적혈구의 집계로 간주됩니다. </li></ol>

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Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리가 직접 현장에서 임상 균주에 pRBC을 공부하는 데 사용되는 혈소판 응집 매개 분석을 설명했습니다. 혈소판 매개 응집, P.의 특성 행동 의 falciparum 균주는 CD36 바인딩을 분리 12,23-24에서 자주 별개의 접착제 표현형으로 확인되었습니다. 1) P.의 체외 응집 표현형에 강한 우리는 세 가지 주요 포인트를 확인하기 위해이 분석을 사용했습니다 falciparum의 질병의 심각도 및 진단 2) CD36, 3과 함께 혈소판의 응집 새로운 수용체 P-셀렉틴의 mediaties) CM 환자에 존재하는 혈소판 감소증의 정도와 연관되어 말라위 어린이의 고립은에 pRBC 덩어리의 더 형성을 제한하기에 충분 관내 12. 덩어리 형성 혈소판의 참여는 6 장에 설명 된대로 젖은 슬라이드 준비 검사에 의해 입증된다. 혈소판은 빠른 속도로 원심 분리하여 PRP에서 분리 될 수혈액 그룹 항원 반응을 최소화하기 위해, 그러나, 우리는 무리한에서와 고속 원심 분리에서 조기 혈소판 활성화를 최소화하기 위해 전체 PRP를 사용했습니다. 혈소판 활성이 약한 혈소판 작용제, 에피네프린 또는 26에 설명 된 아데노신이 인산염 (ADP) 25를 사용하여 혈소판 응집 검사로 측정 할 수 있습니다. 이전 저조한 특징 된 분석의 여러 측면, PRP 소스와 분석의 결과에 혈액 항원 그룹의 효과를 선택의 중요성되고 그 중 하나가 있습니다. 우리는 혈액형 O 있었다 개인의 PRP를 준비 + 약간의 제약이 혈소판의 동작에 영향을 미칠 수있는 혈액이 그려지기 전에 지난 7-10 일에서 어떤 약물을 촬영하지 않았다. 성공을 응집에 영향을 줄 수있는 다른 요인 pRBC 헤마토크릿, parasitaemia 수준 및 응집 분석의 길이 있습니다. 높은 적혈구 및 혈소판 공동 사용이 클러스터가 정말 덩어리거나 그들이 밀도 15 포장 때문에 있는지 너무 많은 세포가 단순히 함께 앉아 있는지 여부를 말할 어려울 것 UNT. 응집은 일반적으로 더 긴 배양 시간에 따라 증가한다. 이러한 응집 연구를 설계 할 때 고려해야 할 모든 유용한 지침입니다. 우리는 다른 임상 그룹의 샘플은 그렇게 할 수있는 경우 병렬 같은 기증자로부터 PRP를 사용하여 분석 할 수 있지만, 이러한 필드 사이트와 같은 제한된 리소스 설정에서 수혈 풀은 일반적으로 제한됩니다 찾을 수 있습니다. 그것은 분석을 표준화하는 단일 입출력 + 기증자를 가지고하는 것이 어렵습니다. 따라서 우리는 가능한 혈액형의 호환성을 보장하기 위해 몇 가지 O + 기증자를 발견. 헌혈의 부담은 한 개인에 빠지지 않도록 여러 기증자를 사용하면 큰 샘플 크기의 경우에 도움이됩니다. 단일 PE 경우 15 ~ 20 분의 샘플링 포인트는 훨씬 더 실현 가능rson 젖은 슬라이드 준비를 허용하고 중복 샘플링 시간없이 분석 속도론을 수행 분석을 진행하고 있습니다. 현미경 데이터의 대부분은 시각과 다소 객관적이며, 따라서 세포 계수는 한 사람 이상으로 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우, 한 번에 하나의 샘플을 처리하는 것은 개인의 효율에 따라 3-4 샘플 하루의 완전한 분석을 할 수 있습니다. 혈소판 응집 매개 임상 및 실험 균주 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험실 라인을 위해, 그것은 CD36 바인딩 기생충이 응집 주파수를 극대화하는 데 사용하는 것이 좋습니다. 분석은 이러한 rosetting 또는 pRBC 바인딩이 표현형 제대로 이해하고 검토 측면을 중재 할 수 혈소판 수용체의 연구를 가능하게 할 저해 분석을 응집에 사용되는 다른 응집 분석과 결합 할 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum의 심각한 말라리아 감염의 대부분을 발생합니다. 대뇌 말라리아 (CM)를 기본 병태 생리 학적 메커니즘은 완전히 이해되지 않고 여러 가설 P.에 의해 미세 혈관의 기계적 폐색 등, 앞으로 넣어왔다 열대열 - 기생 적혈구 (pRBC). 실제로, 수명주기의 내부 erythrocytic 단계에서, P. 의 falciparum은 적혈구 막에 접착 특성 변화와 표면 항원을 수출하여 감염된 적혈구의 표면을 수정하는 독특한 능력이있다. 이 포스트 모세 혈관 소정맥 1의 미세 혈관을 안감 내피 세포에 부착하여 여러 조직과 장기에 pRBC의 격리를 할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 기생충의 성숙한 형태의 변형 감염된 적혈구의 비장의 허가를 피하기 2 더 유리한 낮은 산소 압력이 3 자신의 환경을 제한합니다. 이 SEQUEST의 결과로배급은, 그것은 단지 미숙 무성 기생충 및 말초 혈액에서 검출 될 수 생식 모세포이다. 미세 혈관 침대에 표현 된 여러 호스트 수용체 성숙 pRBC의 Cytoadherence과 격리는 심각하고 복잡 질환에서 발생합니다. 그러나 여러 가지 증거가 특정 접착제 표현형은 말라리아의 심각한 병리 결과와 연관 될 가능성이하는 것이 좋습니다. 이러한 특정 호스트 - 기생충 상호 작용의 한 예는 특정 접착 특성을 가진 pRBC의 바인딩을 지원하는 세포 간 접착 분자 1의 능력은 4,5 대뇌 말라리아의 발전에 연결되어 있습니다 체외에서 입증되었습니다. 태반은 또한 chondrotin 염, 말라리아에 감염된 임신 여성 우대 pRBC 축적의 사이트로 인식되어왔다 syncytiotrophoblasts에 표현 그 라인의 주요 수용체로 6 태반 intervillous 공간. pRBC t의 Rosetting보완 수용체 1 (CD35) 7,8를 통해 O 감염되지 않은 적혈구는 심각한 질병에 9와 연결되었습니다. 가장 최근에 설명 P. 중 하나 열대열 cytoadherence의 표현형은 체외에서 혈소판 매개 대단히 짧은 시간을 형성하는 pRBC의 능력입니다. 이러한 pRBC 덩어리의 형성은 CD36, 혈소판의 표면에 표현 된 당 단백질을 필요로합니다. 내피 세포 및 혈소판 등 다양한 세포 유형에 표현하는 또 다른 인간의 수용체 gC1qR/HABP1/p32는 또한 수풀이 10을 형성하는 혈소판에 pRBC 접착을 용이하게하기 위해 표시되었습니다. 생체 내에서 발생 응집은 불분명 남아 있지만, CM 11 일부터 사망 말라위 어린이의 뇌 미세 혈관에 설명 된 혈소판의 상당한 축적을 설명 할 수 있는지. 또한, 임상의 능력은 체외에서 덩어리에 문화를 격리 직접 말라위 12 질병의 심각도에 연결되었습니다 </sup&gt;와 모잠비크 환자 13 (아니지만 말리 14). 가난 특징 pRBC 응집 표현형의 여러 측면과 함께,이 주제에 대한 현재의 연구는 표준화 된 절차를 준수하지 않았습니다. 이 때문에 분석 15 고유 알려진 높은 변동성 중요한 문제입니다. 여기, 우리는 P.의 체외 혈소판 매개 응집에 대한 방법을 제시 그것은 다른 그룹에 대한 일관된 방법을위한 플랫폼을 제공하고 미래의 연구에서이 표현형을 조사에 한계에 대한 인식을 제고 할 것으로 기대를 가진 원충. 말라위에 기반이기 때문에, 우리는 새롭게 수집 된 균주는 냉동 보존을위한 필요없이 표현형 검사 할 수 있다는 장점과 함께, 특별히 제한된 리소스 설정을 위해 설계된 프로토콜을 제공합니다.

약 70 %에게 P.의 성숙 단계를 사용하여 혈소판 응집 매개 분석의 예 plasmagel 부양하여 농축 한 후 원충는 그림 2에 표시됩니다. 덩어리 세 개 이상의 감염된 적혈구의 집합입니다. 아 크리 딘 오렌지 또는 ethidium의 브로마이드 염색하는 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. ethidium의 브로마이드가 적색 493 nm에서 여기 최대 및 로다 민 염료와 유사한 620 nm에서 방출 최대 (가지고있는 동안 크리 딘 오렌지, 502 nm에서 여기 최대 525 nm의 (녹색)에서 방출, 최대 형광을 스펙트럼과 유사합니다 ). 그들은의 관광 명소로 세포 집합체로 형광 아래에 나타납니다 정상적인 빛 아래로 덩어리는 쉽게 현미경으로 발견되는 그림 2와 같이 (각각 크리 딘 오렌지 또는 ethidium의 브로마이드 염료로 염색 할 때 녹색 또는 빨간색 크리 딘 오렌지를 사용하여 30 분 시점 ). 수풀 클수록 세포 집계 유엔이 나타납니다데르 일반 빛과 녹색 또는 빨간색 아래의 반점 크게는 해당 염료 형광. 염료 대상 DNA 따라서 얼룩 핵, 혈소판 및 감염되지 않은 RBC는 핵 자신의 부족으로 인해 형광 현미경에서 검출되지 않기 때문에. 4.7의 작은 pRBC 덩어리의 임의의 형성 ± 1.6 pRBCs / 덩어리 30 분 후에 발생합니다. 덩어리의 크기는 상당히 많은 pRBC / 시각적으로 간주 할 수없는 덩어리를 포함하는 어떤 덩어리 120 분 동안 배양 한 후&gt; 15 pRBC / 덩어리의 평균 증가합니다. 감염된 세포의 수가 중복 분석의 계산, 수풀 / 1,000 감염된 세포에 선물로 응집 표현형의 빈도가 계산됩니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> 그림 1. 실험을 응집에 대한 흐름을 작동합니다. 혈소판 RICH와 가난한 플라즈마 (A)와 P. 원충에 감염된 적혈구 문화 (B) 응집 분석 (C)를 ​​준비하고 결합됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> 그림 2. P.에 의해 감염된 적혈구의 응집 falciparum의 실험실 격리합니다. 시간 0에서 HB3에 의해 형성된 수풀, 30, 120 혈소판이 풍부한 혈장 분 (A)와 혈소판 빈약 한 플라스마 (B)의 빈약 한 덩어리 형성합니다. 분석 제한 특히 혈소판 기능 또는 영향을 미치는 결과에 영향을 미칠 이들의 대부분은 이미 아르 멘과 로우 (15)에 의해 강조되고 한계가 있습니다. 여기에서 우리는 differe에에서 발생할 수있는 잠재적 인 문제 중 일부를 언급분석의 NT 단계 : <ol><li> 체외 문화에 균주를 적응하는 것은 때로는 더 긴 배양 기간이 덩어리를 형성 할 수 있도록 충분한 parasitaemia을 달성하기 위해 필요한 도전이 될 수 있습니다. P. 높은 항원의 변화 속도로 falciparum의, 문화 적응 기생충의 접착 표현형 문화의 연장 시간 후 원래의 감염 기생충 인구를 반영하지 않을 수 있습니다. </li><li> 혈액 그룹 항원에 의한 비특이적 인 응집을 방지하기 위해, 혈소판 기증자는 같은 분석에 사용 된 균주, 또는 보편적 인 기증자의 혈액 항원 그룹 O-사용과 혈액 그룹 항원 일치해야한다. 그러나 혈액형을 가진 사람들은 말라위 등 아프리카 사이트에서 드문 O-이고 따라서 일반적으로 사용되는 혈소판은 혈액형 O + 기증자로부터 얻은 혈액 그룹과 일치해야합니다. </li><li> 젖은 슬라이드 준비에 대단히 짧은 시간을 계산하면 C와 같은 이미지 캡처에 대한 복잡하고 도전ELL 학생은 지속적인 운동에 있습니다. 보통, pRBC은 커버 슬립의 가장자리에 축적되거나 쉽게 실제 덩어리와 혼동 할 수 있습니다 &quot;false&quot;로 덩어리를 형성 단결하는 경향이있다. 세포의 움직임을 줄이기 위해, 분석하기 전에 상온에서 15 분 동안 침전에 셀 수 있습니다. </li><li> 응집 분석은 시간에 민감하기 때문에 하나의 샘플이 최적의 정확성에 대해 한 번에 사람이별로 분석 할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 샘플 시점 샘플링 쉽게 동시에 하나 이상의 샘플을 처리하는 경우 샘플간에 일치하지 않는 샘플링 시점을 결과 겹칠 수 있습니다. 이러한 상황에서 정교한 양적 소프트웨어 덩어리의 크기를 계산할 수 또는 양자 택일 세포 특정 항체는 덩어리의 구성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석이 사용될 가능성이 곳에 이러한 기술은 크게 자원이 부족한 설정에서, 데이터의 중요성을 향상시킬 수 있지만, 이러한 기술과 장비를 쉽게 사용할 수 없습니다. </li></ol>

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

이 메소드는 혈소판 응집 매개 표현형을 조사<em&gt; 변형체 falciparum의</em균주&gt;에 감염된 적혈구 (pRBC). 이 혈소판이 풍부한 혈장과 pRBC의 현탁액을 분리하고 공동 배양에 의해 수행됩니다.

의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜<em&gt; 변형체 falciparum의</em자원별로 설정에서&gt; - 감염된 적혈구

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K 조회수.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. 이 메소드는 혈소판 응집 매개 표현형을 조사 변형체 falciparum의에 감염된 적혈구 (pRBC). 이 혈소판이 풍부한 혈장과 pRBC의 현탁액을 분리하고 공동 배양에 의해 수행됩니다.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

연구

면역학 및 감염병학

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

의 분리<em&gt; Plasmodium falciparum</em자기 수단으로&gt; 늦은 단계에 감염된 적혈구

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.