국방부 (국방 고급 연구 프로젝트 기관, 젊은 교수 상, 그랜트 번호 N66001-09-1-2117)과 NINDS (R15NS070734)의 지원을받는 연구.

1. 동물의 외과 준비 1. 실험 과목 대뇌 피질 뉴런에있는 파란색 빛에 민감한 양이온 채널, Channelrhodopsin-2를 표현 잭스 스트레인 # 7612) 또는 기타 마우스, B6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J 유전자 변형 라인 9 마우스를 사용합니다. B6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J 유전자 변형 라인의 대뇌 피질에 푸른 빛의 응용 가능성 9,10를 depolarize하고 조치를 받아야 할 Channelrhodopsin-2을 표현 피라미드 뉴런이 발생합니다. 피라미드 세포 활성화의 결과로서, 지역 interneurons가 활성화되며, 잠재적의 변화는 자극 (10)의 사이트 이외의 뉴런에 전달됩니다. , 핫 구슬은 모든 열 저항성 주입 금속 장치 (cannulas, 나사와 와이어) 소독 압력솥 수술 도구와 softpacks (수술 필드 거즈 패드) : 해당 규제 가이드 라인을 준수의 무균 조건 하에서 수술을 수행30 초에, 에탄올에서 10 초 수영과 열 차별적 인 implantable 장치 (광섬유 케이블, 플라스틱 커넥터) 소독, 통조림 공기의 응용 프로그램이 타격을 에탄올 담궈 둔 항목 건조합니다. 2. 마취 Stereotaxic 위치와 해골의 통관 마우스를 마취하는 IMPAC 6 통합 멀티 환자 (뇌려 장비 주식회사) 시스템을 사용합니다. 5%에게 유도를위한 Isoflurane/95 %의 산소와 수술 동안 유지 보수 3 % Isoflurane/97 %의 산소를 사용합니다. 그것은 이불이 온도에서 보관하는 경우 체온을 모니터링 할 필요가 없습니다 37 C.로 설정 순환 물 담요에 동물을 놓으십시오. 3. 주입을 위해 두개골을 준비 두개골의 상단에서 모든 털을 면도를하여 절개 사이트를 준비합니다. 면도 면적은 귀에서 눈에서 두개골의 뒤쪽 끝으로 귀하고 앞 - 뒤로 옆으로 확장해야합니다. 세 consecutiv로 노출 된 피부를 소독betadine의 전자 면봉은 에탄올이 나타납니다. 눈 사이에서 두개골의 뒷면에, 두개골의 상단에 안쪽 절개를합니다. 과산화수소와 멸균 생리 (0.9 % NaCl)으로 두개골을 청소합니다. cauterizing 도구를 사용하여 피를 흘리고을 관리 할 수​​ 있습니다. stereotaxic 좌표를 결정하기위한 bregma와 람다을 찾아 표시합니다. 우리가 사용했던 전극 / optogenetic 자극 구성을위한 Stereotaxic 좌표는 표 1에서 제시하고 그림 1A에 개략적으로 표시됩니다. 4. 해골에 주입 사이트의 작성 두개골의 각 주입 사이트를 구축하기 위해 0.5mm 볼 버 비트와 고속 치과 드릴을 사용합니다. 나사 삽입을 용이하게하기 위해 0.7 mm 볼 버 비트를 사용하여 각 구멍의 외부 여백을 챔퍼. 5. 삽입 및 Cannulas 확보, EMG는 리드 (lead)와 EEG 리드 EEG 나사를 (길이 0.8mm, 코팅 3 2cm로 삽입0-게이지 주석 도금 - 구리 버스는 구멍에) 머리를 망칠 때와 슬롯 손으로에서 그들을 몰아 사전 납땜 와이어 원하는 깊이를 얻기 위해 약 4-5 회전을 드라이버. 다음 stereotaxic 캐뉼라 홀더 및 부착 그들 아크릴 시멘트로 두개골 및 앵커에와 장소에 안내 cannulas을 잡아. 각 가이​​드 캐뉼라는 명백을 유지하기 위해 실험의 시간 (10~14일)에 수술의 시간에서 더미 캐뉼라 / 탐침을 (플라스틱, 하나, 일부 # C312 DC \ 1)를 포함해야합니다. 6. 외과 사이트를 닫기 일단 EEGs 및 가이드 cannulas는 본드는 치과 아크릴 시멘트 (- 오르토 - 제트 시멘트 랑 치과)와 함께 두개골에 위치하고 있습니다. 시멘트 세트 후, 건조 시멘트 마운드 위의 플라스틱 커넥터 (피나클 기술 부분 # 8402)를 배치. 솔더 EEG 리드에서 플라스틱 커넥터의 주소록에 나오는 와이어의 끝. 와이어가 시멘트에 연결 싸는. 그런 다음 nuchal 근육을 통해 EMG 와이어를 그리s은 (는) 21ga 바늘의 통에 넣어 슬라이드하여 근육을 관통. 그들은 근육을 종료 곳으로 단지 말초이 전선 주위에 5-0 나일론 봉합사의 두 외과 의사의 매듭을 묶게. P-3 바늘과 5-0 나일론 봉합사를 절단 역을 사용하여, 다시 하나의 중단 의사 옹이와 근육 조직을 액세스 할 수 후퇴 한 피부를 봉합 해. 7. 수술 진통제 및 복구 즉시 수술 후 항 염증 등 (0.1 밀리그램 / kg, 피하) 진통제와 flunixin meglumine (0.1 밀리그램 / kg, 피하)로 buprenorphine를 관리하고, 매일 일 1-2 수술에. 동물 실험 전에 최소한 7 일 동안 표준 식민지 주택 조건에서 복구 할 수 있습니다. 표준 식민지 주택 이외의 추가주의, cannulas는 장소에 고정 내재 stylets과 적어도 2 주 동안 특허를 유지 할 것으로 예상 할 수 있습니다. EEG와 EMG 센서는 유지 될 것으로 예상 할 수 있습니다이 기간 동안 기능. 2. 특정 시간 빛 펄스의 생성 1. MC의 자극 단위의 프로그래밍 데스크톱 컴퓨터에 USB 연결을 통해 MC-자극 단위 (멀티 채널 시스템)에 연결합니다. 사용 스프레드 시트와 같은 MC 자극 장치를 프로그램 할 MC-자극 사용자 인터페이스를 제공합니다.주세요 의 기간 동안 원하는 TTL (트랜지스터 - 트랜지스터 논리) 전압을 입력 기간 켜고 자극의 기간, 원하는 초당 사이클, 그리고 전체 자극 세션에 대한 반복 사이클의 총 수. 자세한 내용은 내용은 MC-자극 기술 설명서를 참조하십시오 : 3. 광섬유 저얼의 제조 / 조립대뇌 피질에 빛 제공을위한 obes <ol><li> 필요한 용품 및 장비에서 발견된다 : <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li><li> 절단 및 광섬유 케이블로 연마. <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf은</a> </li></ol> 4. 쥐 Optogenetic의 자극 시스템의 조립 1. MC-자극 장치와 레이저의 인터페이스 MC-자극 단위가 프로그램되면, 신호 ON / OFF 5 만 볼트의 이진의 독립 실행 형 신호 생성기로 실행합니다. BNC 커넥터가있는 레이저의 TTL 사용 전원 장치에 MC-자극 장치를 연결합니다. 2. 광섬유 케이블을 통해 레이저 출력을 생산 수동으로 레이저 전원 장치의 디지털 디스플레이 및 가변 전원 출력 다이얼을 사용하여통증은 레이저의 전원 출력을 조정합니다. 리본 케이블을 통해 레이저로 레이저 전원 장치를 연결합니다. 여성 FC (페럴 커넥터) 광섬유 패치 케이블 (200 μm 직경 유리 전도 섬유는 아크릴 레이트 폴리머 cladding을 반영 빛으로 감싼 3m 길이)에있는 남성 FC 커넥터에 레이저 광섬유 어댑터를 연결합니다. 3. 로터리 정류자 : 동물에 레이저를 전달 이 collimating 렌즈 (도리스 식 렌즈)를 encasing 광 회전 이음의 끝을 반대에 발생하는 광섬유 케이블 (길이 3m)와 배달 광섬유 케이블 (길이 45 ㎝)에 연결합니다. 광섬유 로터리 조인트는 정류자 역할 : 동물의 케이지에 대해 이동으로 회전 조인트는 광섬유 케이블의 파손을 방지하기 위해 회전합니다. 금속에 부착 정류자에 플라스틱 케이블 타이를 사용하는 동물이 자리되는 원통형 케이지 위에 배치하라. 4. 배달 광섬유 부착머리를 케이블 cupped 손바닥 아래에 마우스를 핀 한 손을 사용하여 마우스를 구속. 실험의 검지와 중지 사이에 동양의 머리. 광섬유 캐뉼라에 배치 가이드 캐뉼라에서 더미 캐뉼라를 제거합니다. 멸균 25ga 바늘을 사용하여 쓰레기의 가이드 캐뉼라를 삭제합니다. 손으로 광섬유 케이블을 삽입하고 더미 캐뉼라에서인양 나사 캡과 광섬유 가이드 캐뉼라에 고정. 평면 흘리고 끝에서 고정 된 거리에서 광섬유 케이블에 연결된 봉합 매듭으로 뇌의 광섬유 케이블의 삽입의 깊이를 조절합니다. 전체 실험 장치는 그림 1B에 표시됩니다. 5. Optogenetic을 자극하는 동안 EEG 정의 된 절전 모드 및 젖산 농도의 측정 1. 락트산 센서의 Precalibration 락트산 센서의 사전 보정 체외에서 함께 수행됩니다키트 (피나클 기술 부분 # 7000-K1-T). 센서가 인산염의 equilibrated 것은 제조업체 프로토콜 당 stepwise 방식으로 L-락트산의 세 농도에 노출 후, (산도 7.4) 염분 버퍼. 2. 락트산 센서와 EEG 케이블의 삽입 광섬유 케이블 삽입 절차 (섹션 4.4)에 동일한 방식으로 두개골 마운트 락트산 가이드 캐뉼라로 미리 보정 된 센서를 삽입합니다. 양극성 플러그 커넥터가있는 피나클 8400 바이오 센서의 전치 증폭기에 젖산 센서를 연결합니다. 수술 - 주입 headmount에있는 8 핀 커넥터에이 전치 증폭기를 연결합니다. 3. Optogenetic의 자극 강도를 구축 데이터를 수집하기 전에 optogenetic의 자극의 강도를 조정하는 레이저 강도 조절 노브를 사용합니다. EEG 응답의 진폭은, 체계적으로 연구되지 ​​않은 요인으로 인해, 동물에서 다릅니다<html> D는 자극의 발병에 육안 검사에 의해 확인해야합니다. 실제로, 80-120 μWatts의 강도는 일반적으로 자극의 주파수에서 약 50 %의 EEG 진폭 증가를 생산합니다. 후 임시 고속 푸리에 변환 분석 (섹션 5.5 참조) 응답의 절대 크기를 정할 필요가 있습니다. 4. 데이터 수집 : 피나클 8400 시스템 사용하여 데이터 수집 <a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html를</a> . 5. Neuroscore과 데이터 처리 : Neuroscore 인터페이스 (DataSciences, 국제와 EEG와 EMG의 데이터를 시각적으로 검사하여 상태를 잘 분류 <a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp</a> 또는 Sirenia 인터페이스 (피나클 기술) :F = &quot;http://www.pinnaclet.com/sirenia.html&quot;대상 = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). 웨이크, 비 급속 안구 운동 수면, 또는 EEG와 EMG에 따라 빠른 안구 운동 수면과 같은 10 초 epochs에서 프로세스 데이터입니다. 추가 분석 및 통계 테스트를 위해 Microsoft Excel 스프레드 시트로 데이터를 저장합니다.

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cerebral+glucose+metabolic+rate+in+human+sleep+assessed+by+positron+emission+tomography.">Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography.</a> Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).</li><li>Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cerebral+glucose+utilization+in+non-rapid+eye+movement+sleep.">Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep.</a> Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).</li><li>Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

방법은 하나 이전에 불가능 시간 규모 glycolytic 중간 락트산의 두뇌 농도의 수면과 변화 사이의 관계를 측정 할 수 있도록 여기에 소개했다. 동물이 깨어나, NREMS와 REMS 사이의 자발적인 전환을 받고있다. 동물이 전환을 받다 동안 또한, 우리는 optogenetic 자극을 적용 할 수 있습니다. 데이터 락트산 산화 효소 기반 바이오 센서의 판독에 그 자연과 유도 모두 파도에 미치는 영향을 설명 데이트를 모았...

<table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> BASi 마우스 가이드 정맥 </td><td> 피나클 기술 / BASi 주식회사 </td><td> 7032 </td><td></td></tr><tr><td> 락트산 바이오 센서 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 7004 </td><td></td></tr><tr><td> 머리 산 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 8402 </td><td></td></tr><tr><td> 수면 / 바이오 센서 녹화 시스템 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 8400-K1-SL </td><td> 이 EEG 채널, 1 EMG 채널, &amp; 1 바이오 센서 </td></tr><tr><td> 테 더링 마우스 인 체외 보정 키트 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 7000-K1-T </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 가이드 정맥 </td><td> 플라스틱 하나 </td><td> C312G </td><td> 21 게이지 가이드 정맥 </td></tr><tr><td> 더미 정맥 </td><td> 플라스틱 하나 </td><td> C312DC </td><td> 21 게이지 더미 </td></tr><tr><td> 다이아몬드 섬유 스크라이브 </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 커넥터 크림프 도구 </td><td> Thorlabs </td><td> CT042 </td><td></td></tr><tr><td> 분기 관 </td><td> Thorlabs </td><td> FT030 </td><td> 03.0 mm </td></tr><tr><td></td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> 최대 DIA. 0.012 </td></tr><tr><td> 분기 튜브 스트리퍼 </td><td> Thorlabs </td><td> FTS3 </td><td></td></tr><tr><td> 맨 하드 Cladding 멀티 섬유 </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> 200 μm 코어, 0.37 NA </td></tr><tr><td> 와이어 자르는 / 케블라 자르는 가위 </td><td> Thorlabs </td><td> T865 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 에폭시 </td><td> Thorlabs </td><td> F112 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> 섬유 스트리퍼 도구 </td><td> Thorlabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 연마 플레이트 </td><td> Thorlabs </td><td> CTG913 </td><td></td></tr><tr><td> 고무 폴리싱 패드 </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td></td></tr><tr><td> 아이 루페 </td><td> Thorlabs </td><td> JEL10 </td><td></td></tr><tr><td> 김 물티슈 </td><td> Thorlabs </td><td> KW32 </td><td></td></tr><tr><td> 압축 공기 </td><td> Thorlabs </td><td> CA3 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리싱 퍽 </td><td> Thorlabs </td><td> D50-XX </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 검사 범위 </td><td> Thorlabs </td><td> CL-200 </td><td></td></tr><tr><td> 연마 영화 </td><td> Thorlabs </td><td> LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC 커넥터 끝 </td><td> Thorlabs </tD&gt; <td> 30126G2-240 </td><td> 240 μm의 정공, SS 페럴 </td></tr><tr><td> MC의 자극 단위 </td><td> 멀티 채널 시스템 </td><td> STG-4002 </td><td></td></tr><tr><td> MC의 자극 소프트웨어 </td><td> 멀티 채널 시스템 </td><td> MC-자극 V 2.1.5 </td><td></td></tr><tr><td> 블루 레이저 </td><td> CrystaLaser </td><td> CL473 - 050-0 </td><td></td></tr><tr><td> 레이저 전원 공급 장치 </td><td> CrystaLaser </td><td> CL2005 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 로타리 조인트 </td><td> 도리스 식 렌즈 </td><td> FRJ-V4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 용품 및 장비. </td></tr></tbody></table>

simultaneous electroencephalography, real-time measurement of lactate concentration and optogenetic manipulation of neuronal activity in the rodent cerebral cortex

뇌는 질량에 의해 신체의 5 % 이하를 나타냅니다이지만, 나머지 1에서 몸에서 사용하는 포도당의 약 분기 활용합니다. 비 급속 안구 운동 수면 (NREMS), 시간의 수면의 가장 큰 부분의 기능은 불확실합니다. 그러나, NREMS 중 하나를 분출하는 기능은 잠이 오지 않음 2-4를 기준으로 뇌성 포도당 이용의 속도에 상당한 감소이다. 해당 제품 및 기타 연구 결과는 수면 뇌성 신진 대사에 관련된 기능을 제공하는 널리 통용되고 있던 신념으로 이어 왔습니다. 그러나 NREMS 동안 뇌성 포도당 신진 대사의 감소 근간이 메커니즘은 elucidated 할 수 남아 있습니다. 뇌성 신진 대사 속도에 영향을 미칠 수 있습니다 NREMS과 관련된 하나의 현상이 뇌파 5,6에서 속도가 느린 파도, 4 Hz에서보다 주파수에서 진동의 발생입니다. 두개골 또는 대뇌 피질 표면의 수준에서 감지 이러한 느린 파도가를 반영depolarized / 최대 상태 hyperpolarized / 아래 상태 7 사이의 기본 뉴런의 진동. 다운 상태 동안, 세포는 수백 밀리 초까지 간격에 대한 작업 잠재력을 받아야하지 않습니다. 작업 잠재력에 대한 후속 이온 농도 그라디언트의 복원은 세포 팔에 큰 신진 대사 하중을 나타냅니다 NREMS과 관련된 아래 주 동안 활동 전위의 부재가 깨어날 상대적으로 감소 신진 대사에 참여할 수 있습니다. 두 기술 도전은 테스트하려면이 가상 관​​계를 위해 해결해야했습니다. 첫째, 대뇌 EEG의 역학을 반영한 시간적 해상도로 뇌성 glycolytic 신진 대사를 측정 할 필요 (그​​ 대신 분 초 동안입니다.) 이렇게하려면 우리는 젖산의 농도, 에어로빅 작용의 제품, 따라서 쥐의 뇌에 포도당 신진 대사의 속도의 기록을 측정. 락트산였다전두엽 피질에 포함 된 젖산 산화 효소 기반의 실시간 센서를 사용하여 측정. 감지 메커니즘은 락트산 산화 효소 분자의 층으로 둘러싸인 백금 - 이리듐 전극으로 구성되어 있습니다. 락트산 산화 효소에 의해 젖산의 대사는 백금 - 이리듐 전극에 전류를 생산 과산화수소를 생산하고 있습니다. 그래서 대뇌 작용들로 ramping는 감지 전극에 증가 현재에 반영되어 락트산 산화 효소에 대한 기판의 농도 증가를 제공합니다. 이 NREMS의 다른 측면에서이 변수를 분리하기 위해 대뇌 피질의 흥분을 조작하는 동안이 변수를 측정하기 위해 추가로 필요했습니다. 우리는 Pyra의 optogenetic 활성화를 통해 뇌성 대뇌 피질의 neuronal 활동의 elecetroencephalogram, 락트산 바이오 센서를 통해 glycolytic 유량의 측정 및 조작을 통해 neuronal 활동의 동시 측정을위한 실험 시스템을 고안midal 뉴런. 우리는 수면 관련 electroencephalographic 파형과 대뇌 피질의 젖산 농도의 순간 - 투 - 순간 역학 사이의 관계를 문서화하는이 시스템을 활용하고 있습니다. 프로토콜 자유롭게 동물을 행동에 공부에 관심이있는 개인을 위해 유용 할 수 있습니다, 뇌 내의 electroencephalographic 수준과 세포 에너지 론에서 측정 neuronal 활동 사이의 관계.

<html> 으로, 그림 2에 표시된 EEG, EMG 및 뇌성 젖산 농도가 지속적으로 모니터링하는 동안 optogenetic의 자극과 EEG / 락 테이트 / EMG 데이터 수집을위한 시설을 갖추고 쥐가 자연 슬립 / 웨이크 상태 전환을 받았습니다. 락트산 센서의 전류는 EEG 낮은 진폭의 기간 동안 증가하고 EEG 높은 진폭의 기간 동안 감소. 그림 3에 도시 된 바와 같이, EEG의 두 채널은 전두엽 피...

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Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

절차는 뇌파, electromyogram, 그리고 뇌성 젖산 농도를 모니터링하는 동안 optogenetically 뇌성 대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 활동을 조작하기위한 설명되어 있습니다. 사람들이 자연 수면 / 웨이크주기를 받아야 동안 실험 녹음 케이블 테 더링 마우스에 수행됩니다. Optogenetic 장비는 우리의 실험실에서 조립, 녹화 장비는 상업적으로 사용할 수 있습니다.

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

simultaneous-electroencephalography-real-time-measurement-lactate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.1K 조회수.  Washington State University. 절차는 뇌파, electromyogram, 그리고 뇌성 젖산 농도를 모니터링하는 동안 optogenetically 뇌성 대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 활동을 조작하기위한 설명되어 있습니다. 사람들이 자연 수면 / 웨이크주기를 받아야 동안 실험 녹음 케이블 테 더링 마우스에 수행됩니다. Optogenetic 장비는 우리의 실험실에서 조립, 녹화 장비는 상업적으로 사용할 수 있습니다.

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Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

쥐 두뇌에 동시 fMRI와 전기 생리학

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

연구

신경과학

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic field pulses. The initiation of cortical activation or its modulation depends on the background activation of the neurons of the cortical region activated, the characteristics of the coil, its position and its orientation with respect to the head. TMS combined with simultaneous electrocephalography (EEG) and neuronavigation (nTMS-EEG) allows for the assessment of cortico-cortical excitability and connectivity in almost all cortical areas in a reproducible manner. This advance makes nTMS-EEG a powerful tool that can accurately assess brain dynamics and neurophysiology in test-retest paradigms that are required for clinical trials. Limitations of this method include artifacts that cover the initial brain reactivity to stimulation. Thus, the process of removing artifacts may also extract valuable information. Moreover, the optimal parameters for dorsolateral prefrontal (DLPFC) stimulation are not fully known and current protocols utilize variations from the motor cortex (M1) stimulation paradigms. However, evolving nTMS-EEG designs hope to address these issues. The protocol presented here introduces some standard practices for assessing neurophysiological functioning from stimulation to the DLPFC that can be applied in patients with treatment resistant psychiatric disorders that receive treatment such as transcranial direct current stimulation (tDCS), repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS), magnetic seizure therapy (MST) or electroconvulsive therapy (ECT).

The protocol presented here is for TMS-EEG studies utilizing intracortical excitability test-retest design paradigms. The intent of the protocol is to produce reliable and reproducible cortical excitability measures for assessing neurophysiological functioning related to therapeutic interventions in the treatment of neuropsychiatric diseases such as major depression.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...