바이러스로 전달되는 광유전학적 구조는 급성 뇌 절편에서 특정 시냅스의 생리학 및 가소성에 대한 상세한 전기생리학적 특성을 허용합니다. 시냅스를 광유전학적으로 활성화하는 주요 이점은 장거리 경로를 연구할 수 있는 능력과 해부학적으로 분리되지 않은 축삭의 선택적 자극입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구원 인 Lisa Kinnavane 박사가 될 것입니다.
시작하려면 해밀턴 주사기를 정위 프레임에 장착 된 이동식 암에 부착 된 미세 주입 주사기 펌프에로드합니다. 그런 다음 바이러스의 5 마이크로 리터 부분 표본을 마이크로 원심 분리기에 넣으십시오. 튜브를 몇 초 동안 돌리고 2 마이크로 리터의 바이러스 제제를 튜브 뚜껑에 피펫팅합니다.
주사기에 바이러스 제제를 채우려면 수술 용 현미경으로 바늘 끝을보십시오. 그런 다음 바늘 끝에 바이러스의 볼 루스를 수동으로 놓고 펌프 컨트롤을 사용하여 주사기 플런저를 빼냅니다. 펌프 주입량을 300나노리터로 설정하고 유량을 분당 100나노리터로 설정합니다.
펌프를 가동하고 바늘 끝에서 바이러스 방울을 관찰하여 적절한 흐름을 확인하십시오. 면봉에 바이러스를 흡수하고 70 % 에탄올로 바늘을 청소하십시오. 다음으로, 정위 프레임의 조절기 나사를 사용하여 바늘 끝을 브레그마로 탐색하고 프레임의 세 버니어 스케일에서 관찰된 정위 측정값을 기록해 둡니다.
브레그마 좌표에서 이러한 거리를 더하거나 뺍니다. 정위 팔에 장착 된 마이크로 드릴을 사용하여 두개골 표면에 버 구멍을 만드십시오. 바늘을 소정의 배측 배위에서 뇌 내로 삽입하고, 소정의 부피의 바이러스 제제를 주입한다.
주입 후, 볼 루스의 확산을 허용하기 위해 바늘을 10 분 동안 제자리에 두십시오. 그런 다음 바늘을 제거하고 펌프를 작동시켜 바늘이 막히지 않도록하십시오. 바이러스 주사 2 주 후, 쥐를 안락사시키고, 전체 뇌를 신속하게 해부하고, 자당 절단 용액으로 옮깁니다.
금속 티스푼을 사용하여 뇌를 집어 들고 여분의 용액을 버리고 여과지 위에 놓습니다. 메스를 사용하여 소뇌를 제거하고 대뇌를 길이를 따라 약 절반 정도 관상 동맥에서 자릅니다. 뒤쪽 절반은 LEC 조직 블록입니다.
조직 블록과 나머지 뇌를 자당 절단 용액으로 되돌립니다. 다음으로, 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 비브라톰 스테이지에 놓고 얇은 층으로 펴 바릅니다. 그런 다음 티스푼을 사용하여 LEC 조직 블록을 선택하고 전방 관상 절단이 부착되도록 접착제 패치에 옮깁니다.
스테이지를 비브라톰 조직 챔버에 설치하고 조직을 잠수하기에 충분한 자당 절단 용액을 빠르게 붓습니다. 조직 블록의 복부 표면을 칼날쪽으로 향하게 한 후 느린 칼날 전진 속도를 사용하여 복부에서 등쪽까지 350 마이크로 미터 두께의 조각을 자릅니다. 일반적으로 반구 당 7 개의 슬라이스를 얻을 수 있습니다.
슬라이스를 슬라이스 수집 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 수집 챔버를 섭씨 34도의 수조에 1시간 동안 두었다가 실온으로 돌아갑니다. 뇌의 나머지 부분을 파라 포름 알데히드에 48 시간 동안 두십시오.
표적 세포 식별을 위해 슬라이스를 기록 챔버에 넣고 슬라이스 앵커를 사용하여 고정합니다. 저배율에서 적외선 조명을 사용하여 LEC 레이어 5로 이동합니다. 그런 다음 고배율 수침 대물렌즈로 변경하고 피라미드 뉴런을 식별합니다.
테이프로 모니터의 셀 위치를 표시하십시오. 다음으로, 전체 세포 패치 클램프를 형성하기 위해, 붕규산 유리 마이크로 피펫을 제작하고, 이를 세포내 기록 용액으로 채운다. 채워진 마이크로 피펫을 전극 홀더에 놓고 전극 홀더 측면 포트에 연결된 마우스피스에 세게 불어 양압을 가합니다.
반월판이 형성되도록 현미경 대물렌즈를 올리고 현미경에서 볼 수 있을 때까지 전극을 반월판에 삽입합니다. 씰 테스트 창을 열고 피펫 저항이 3-5메가옴인지 확인합니다. 그런 다음 확인 된 세포를 피펫 팁으로 만지면 세포막에 움푹 들어간 곳이 생깁니다.
다음으로, 마우스 피스에서 흡입하여 음압을 가하여 피펫 저항을 증가시킵니다. 세포막이 파열 될 때까지 점차적으로 음압을 계속 가하여 전체 세포 커패시턴스 과도 상태가 발생합니다. 전류 클램프 구성을 시작하려면 필터 큐브와 적절한 광학 장치가 있는 현미경 광 경로로 향하는 장착된 LED를 사용하고 40X 대물렌즈를 통해 슬라이스에 광 펄스를 적용합니다.
5 헤르츠, 10 헤르츠 및 20 헤르츠에서 여러 광 펄스의 트레인을 전달하여 시냅스 전 방출 특성을 조사합니다. 바이오 사이클틴이 뉴런을 채울 수 있도록하려면 전체 세포 구성에 들어간 후 최소 15 분 동안 기다리십시오. 전압 클램프에서 멤브레인 커패시턴스와 입력 저항을 모니터링합니다.
그런 다음 세포의 체세포에서 접근 각도를 따라 피펫을 천천히 빼내어 정전 용량 과도 상태 및 막 전류가 천천히 사라지는 것을 관찰하여 세포막의 재밀봉 및 피펫 팁에 아웃사이드 아웃 패치의 형성을 나타냅니다. 슬라이스를 24웰 플레이트의 파라포름알데히드에 넣고 밤새 배양합니다. OCT 배지를 사용하여 조직 블록을 저온 유지 표본 디스크에 부착합니다.
조직을 동결하려면 이소펜탄을 적절한 용기에 넣고 표본 디스크를 담그고 조직이 이소펜탄 수준보다 높도록 합니다. 그런 다음 이소 펜탄 용기를 액체 질소로 내리고 조직이 얼도록하십시오. 조직이 완전히 얼면 조직 블록을 저온 유지 장치 챔버에 섭씨 영하 20도에서 30분 동안 그대로 두어 블록의 온도가 평형을 이루도록 합니다.
평형 후 저온 유지 장치에서 40마이크로미터 두께의 섹션을 자르고 가는 붓을 사용하여 블레이드에서 섹션을 안내합니다. 이러한 동결 절편을 실온 폴리-L-라이신-코팅된 유리 현미경 슬라이드에 부착하여 상기 슬라이드를 절편에 접촉시킨다. 각 슬라이드에 150마이크로리터의 장착 매체를 추가한 후 커버 슬립을 적용하고 커버 슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다.
광퇴색으로부터 보호하기 위해 슬라이드를 덮고 12시간 동안 자연 건조시키십시오. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 바이러스 주사 부위의 위치를 검사합니다. 바이오 사이 틴 염색을 위해 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해 PBS의 3 % 과산화수소에 30 분 동안 슬라이스를 배양하십시오.
그런 다음 더 이상 산소 거품이 보이지 않을 때까지 PBS로 뇌 조각을 씻으십시오. 다음으로, 슬라이스를 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중 1%아비딘-비오티닐화된 HRP 복합체 용액에서 3시간 동안 배양한다. 6 개의 PBS 세척 후, 신경 구조의 바이오 사이틴 염색이 보일 때까지 DAB 용액에서 각 슬라이스를 배양합니다.
차가운 PBS에서 슬라이스를 옮겨 반응을 중지시킨다. 그런 다음 브러시를 사용하여 슬라이스를 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다. 과도한 PBS를 제거한 후 장착 매체를 추가하십시오.
커버 슬립을 사용하여 슬라이스를 덮고 앞에서 설명한 대로 자연 건조시킵니다. 건강한 피라미드 세포를 찾아 패치했습니다. 시냅스 후 세포 식별이 필요한 경우 형광 마커를 발현하는 세포를 광시야 광학을 사용하여 국소화해야 합니다.
2 밀리 초의 단일 광 펄스는 단순한 파형 광유전 흥분성 시냅스 후 전위를 초래했습니다. 시냅스의 단기 가소성은 5, 10 및 20 헤르츠 트레인의 광 자극을 적용하여 검사합니다. 장기 가소성을 조사하는 동안 콜린성 작용제 카르바콜을 순환 aCSF에 10분 동안 첨가하면 리간드 제거 후 40분 후에도 여전히 명백한 장기 우울증이 발생했습니다.
주사 부위의 길이를 조직학적으로 검사하였다. 형광 리포터 mCherry는 전위 및 하부 변연계 피질의 더 깊은 층에 국한되었습니다. 또한, 바이오 사이클틴으로 채워진 세포를 염색하여 그 위치와 형태를 확인했다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 사후에 확인할 수있는 구 심성 뇌 영역의 정확한 형질과 급성 절편을 준비 할 때 뇌의 신속한 해부입니다. 이 절차는 특정 인터뉴런 서브클래스와 같은 개별 세포 유형의 형광 표지와 용이하게 조합된다. 이를 위해 우리는 특정 세포 유형에서 재조합 효소를 발현하는 형질 전환 동물을 사용합니다.
바이러스로 전달되는 광유전학적 구조는 시스템 및 회로 신경과학 분야에서 급속한 발전을 가능하게 했습니다.
