이 작품은 NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA)와 NIH 보조금 AR052785 및 AR046786 (AEO 및 W.-MW)에 의해 지원되었다.

1. 피부 절개 0으로 2 살 신생아 마우스를 준비합니다 <ol><li> 적어도 20 분 동안 CO 2 챔버를 사용하여 마우스 새끼를 안락사시켜야. 최대 해부까지 시간을 얼음에 새끼를 남겨주세요. P0-P2 마우스는 매우 오래된 마우스로 준비된 세포로 추천하는 것은 전구 용량을 감소 낮은 그라프 트 수율의 결과가. 70 % 에탄올 중 하나 접시 (단계 1.3) 및 세척 솔루션의 세 요리 (3 단계 용)을 준비 할 때 피부 절개를 수행 할 준비가. Dispase 솔루션을 해동와 4에서 떠나 ° C. 자궁 경부는 안락사을 보장하기 위해 CO 2 과다 노출 후 새끼를 탈구. </li><li> 얼음과 살균 흐름 후드에 양도 문화 접시에 euthanized 새끼를 놓습니다. </li><li> 간단히 무균 배양 접시로 70 %의 에탄올과 장소에 immersing하여 새끼를 씻으십시오. </li></ol> 2. 마우스 스킨 해부 <ol><li> 멸균 가위로 몸의 기초에서 각 사지와 꼬리를 자르면. </li><li> CU 한 쌍의 사이에 단단히 몸을 파악rved 포셉과 머리에서 기본 근막을 관통하지 않고 메스를 사용하여 꼬리에 등쪽 피부를 따라 절개를합니다. </li><li> 조심스럽게 거리에 마우스의 중간 선에서 피부 껍질을 벗기다. </li><li> 곡선 포셉의 긴 쪽을 단단히 노출 된 마우스를 잡고 마우스의 뒤쪽 끝의 피부 아래 곡선 포셉의 다른 쌍을 삽입하고 부드럽게 마우스의 복부 이분의 일을 향해 허리를 통해 피부를 당겨. </li><li> 조심스럽게 한 부드러운 움직임에서 완전히 마우스에서 피부 껍질과 시체를 폐기하십시오. </li></ol> 3. Dispase 솔루션으로 피부와 품다을 씻으십시오 <ol><li> 진피 측과 세척 솔루션의 첫 번째 접시의 피부를 배치합니다. 피부를 확산하고 포셉으로 활발히 논의. 다음 피부를 박리하면서 세척 솔루션의 첫 번째 접시에 피부를 둡니다. </li><li> 세탁 솔루션의 첫 번째 접시에 다음 해부 피부를 삽입 한 후, 세탁 솔루션의 두 번째 접시에 전에 피부를 전송할 수 있습니다. 일의 스킨을 유지전자 초 세탁 솔루션을 모두 스킨가 수집 될 때까지. 최종 세척 스킨의 모든 전송, 간단히 활발히 논의. </li><li> 멸균 10cm 문화 요리에 10 ML의 얼음 차가운 Dispase을 추가합니다. Dispase 솔루션으로 피부를 갈아 피부 진피 쪽을 평평하게. </li><li> 4에 8-16 시간에 피부에 띄워 ° C (대체 옵션 : 1 시간 37 번 ° C). </li></ol> 4. 별도의 진피와 표피 <ol><li> 새로운 멸균 배양 접시에 피부를 갈아 피부 진피 쪽을 평평하게. 메스과 하나가 코너에서 진피를주의 깊게 누르십시오. </li><li> 집게로 표피를 잡고 천천히 벗겨 버릴 진피에서. 표피는 차로 한 조각으로 껍질을 해야지. 표피는 흰색과 얇은되며 진피는 갈색 두꺼운, 그리고 젤라틴해야합니다. </li><li> 별도의 멸균 문화 요리에 두 조직을 분리합니다. <ol class="lalpha"><li> 피부 특정 유전자 최저 / overexpression 이식을 만들려면 진피를 타고 t 매우 작은 조각으로 잘게 썬 고기앨리스의 메스. 표피를 폐기하십시오. 감염 (7 단계)의 일에 lentiviral에 감염된 피부 세포와 결합하는 신선한, 치료 표피 세포를 준비하는 마우스 스킨의 또 다른 세트를 해부. </li><li> 표피 특정 유전자 최저 / overexpression 이식을 만들려면 6에 각각의 표피를 갈라 - 8 작은 조각입니다. 진피를 폐기하십시오. 감염 (7 단계)의 일에 lentiviral에 감염된 표피 세포와 결합하는 신선한, 치료 피부 세포를 준비하는 마우스 스킨의 또 다른 세트를 해부. </li></ol></li></ol> 5. 다진 조직에서 기본 마우스 피부 세포를 (mDCs) 해리 <ol><li> 1 시간에 37 ° C에서 갓 만든 Collagenase 솔루션과 피부 조각을 잠복기에 의해 mDCs을 떼어 놓다. 강아지 마우스 당 Collagenase 솔루션의 10 ML을 사용합니다. </li><li> 부드럽게 솔루션이 포함 된 진피마다 10 분 섞는다. 현미경으로 분리의 정도를 확인하고, 소화 세포 현탁액은 주로 단일 세포해야합니다. 이 솔루션은 분명의로 흐린로 변경해야합니다피부 세포는 진피에서 dissociated 있습니다. </li><li> collagenase의 활동을 줄이기 위해 10 % 최종 볼륨에 진피를 포함하는 Collagenase 솔루션에 FBS를 추가합니다. </li><li> 대형 소화되지 않은 clumps 및 전체 모낭을 제거 할 수있는 새로운 50 ML 튜브에 70 μm 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 30 ML 당 DMEM/10 % FBS의 10 ML을 추가 흐름을 통해 더욱 collagenase를 희석 할 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기 튜브는 더 전체 모낭을 제거하는 5 분을위한 탁상 원심 분리기 30 XG에 소화 진피를 포함하는. </li><li> 새로운 50 ML 튜브에 표면에 뜨는을 자세히 전송합니다. 5 분의 탁상 원심 분리기에 200 XG에 centrifuging하여 펠렛 세포. </li><li> DMEM/10 % FBS와 세포 (강아지 당 1 ML)를 Resuspend하고 세포를 계산합니다. 감염 Amniomax C-100 미디어 (7 단계)와 플레이트 세포, 또는 (9 단계) 접목을 위해 lentivirus에 감염된 KC와 결합합니다. 일반적으로 수율이 새끼 20 X 10 6 세포입니다. </li></ol> 6. 기본 Keratinocyte을 떼어 놓다다진 조직에서 S (KC) <ol><li> 15 분에 37 ° C에서 갓 해동 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 표피 조각을 잠복기에 의해 KC을 떼어 놓다. 강아지 마우스 당 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 7 ML을 사용합니다. </li><li> 표피마다 5 분을 포함 부드럽게 소용돌이 솔루션입니다. </li><li> 트립신의 활동을 줄이기 위해 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 함유 표피에 중화 솔루션의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 5 분의 탁상 원심 분리기에 200 XG에 centrifuging하여 펠렛 세포. 남은 소화되지 않은 조직 위에 떠해야합니다. </li><li> 조심스럽게 소화되지 않은 조직으로 표면에 뜨는 대부분을 부어. 교란 세포 펠렛없이 10 ML의 피펫으로 남아있는 표면에 뜨는을 제거합니다. PBS로 세포 펠렛을 Resuspend. 경우 관세청에서 완전히 pelleted 없으며, 표면에 뜨는 대부분을 날려 부어과 세포의 대부분은 pelleted 때까지 원심 분리를 반복합니다. </li><li> 나머지 조직 또는 clumps을 제거 할 수있는 새로운 튜브에 70 μm 전지 스트레이너를 통해 세포 현탁액 스트레인. </li><li> centrifuging의 펠렛 세포5 분의 탁상 원심 분리기에 대한 200 XG에서. </li><li> CNT-07 미디어 또는 PBS (강아지 당 1 ML)과 카운트 세포에 Resuspend 세포. 감염 도금 세포 (7 단계)에 대한 CNT-07를 사용하여 (단계 9) 접목을 위해 lentivirus에 감염된 mDCs와 결합하는 PBS를 사용합니다. 일반적으로 수율이 새끼 당 3-10 X 10 6 세포입니다. </li></ol> 7. shRNA 또는 cDNA를 포함 Lentivirus과 기본 셀을 감염 감염의 날 (9 단계) 접목의 날에 바이러스에 감염된 세포와 결합하는 신선한, 치료 기본 관세청 또는 mDCs을 준비하는 마우스 스킨의 또 다른 세트를 해부. <ol><li><ol class="lalpha"><li> mDCs를 들어, 번호판 4 × 10 37 번 AmnioMAX-C100 미디어 및 배양과 10 cm 판 당 6 mDCs ° C 50 %의 세포 밀도에서 다음 날 감염 + 5 % CO 2. mDCs의 보통 3-4 플레이트는 이식을 생성하는 데 사용됩니다, 그리고 10-12 플레이트의 총은 한 실험에서 세 이식을 생성하기 위해 필요합니다. 또한, mDCs 첨부 해와 f를 확산또는 37 번 2 시간의 최소 ° C + 5 % CO 2, 감염 할 셀 도금의 동일한 일을 수행합니다. mDCs는 섬유 아세포 - 좋아 형태를 갖게됩니다. </li><li> KC를 들어, 판 12 × 10 37 번 CNT-07 미디어 및 배양과 10 cm 판 당 6 KC ° C 다음 날 감염 + 5 % CO 2. 또한, KC는 37 2 시간의 최소 연결하고 확산 해 ° C + 5 % CO 2와 같은 날에 감염을 수행합니다. KC의 보통 3-4 플레이트는 이식을 생성하는 데 사용됩니다. 10-12 판의 총은 한 실험 세 이식을 생성하기 위해 필요합니다. 관세청은 조약돌 형태를 갖게됩니다. </li></ol></li><li> 37 8 μg / ML의 Polybrene 솔루션 ° C + 5 % CO 2 5-10 분을위한 세포를 Preincubate. </li><li> 교환 매체와 lentivirus를 추가 + 8 μg / ML의 Polybrene 솔루션입니다. Lentiviral titer는 구성 사용하고 감염되기 전에 결정되어야한다에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 32에서 1 시간을위한 테이블 원심 분리기에 200 XG에서 번호판을 원심 분리기 °, lentivirus와 세포를 감염시킬 수 C. </li><li> lentivirus 함유 미디어를 제거하고 신선한 미디어를 추가 할 수 있습니다. KC를 들어, 신선한 미디어를 다시 추가하기 전에 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 보통 감염된 세포는 회복 37 번 밤새 ° C + 5 % CO 2.주세요 또한, 37에서 복구 적어도 두 시간을 허용 ° C 이식을위한 세포를 trypsinizing 전 + 5 % CO 2. 대표 결과 섹션에 설명 된대로 감염 효율을 확인하기 위해 문화 감염된 세포의 작은 부분을 계속합니다. </li></ol> 8. 이식에 감염된 세포를 준비 <ol><li> 단계 4-6를 사용하여 피부의 신선한 기본 mDCs 또는 관세청를 분리합니다. 얼음 차가운 멸균 PBS에 Resuspend 세포. 셀을 계산합니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 피부 특정 유전자 최저 / overexpression 이식의 경우, 8 분 동안 37 ° C에서 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용하여 판에서 감염된 mDCs을 떼어 놓다. </li><li> 표피 특정 유전자 최저 / overexpression 이식의 경우, 접시 usi에서 감염된 KC을 떼어 놓다37 번 NG 0.125 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ° 15 분에 C. </li></ol></li><li> DMEM + 10% FBS (mDCs) 또는 중화 솔루션 (KC)를 사용하여 트립신 활동을 중화. 50 ML 튜브에 trypsinized 세포를 전송합니다. </li><li> 5 분의 탁상 원심 분리기에 200 XG에 centrifuging하여 펠렛 세포. </li><li> 얼음 차가운 멸균 PBS에 Resuspend 세포. 셀을 계산합니다. </li><li> 신선하게 조리 된 치료 대응 세포 유형의 바이러스에 감염된 세포를 결합합니다. 이식의 경우, 4 ° C.에 얼음 차가운 무균 PBS와 펠렛 탁상 원심 분리기에있는 세포 슬러리의 7-10 X 10 6 관세청과 7-10 X 10 6 mDCs을 결합 50 -100 μl 얼음 차가운 무균 PBS에 Resuspend 세포. 뉴 / 뉴 마우스 챔버 준비가 될 때까지 얼음에 세포를 유지. </li></ol> 9. 뉴 / 뉴 마우스를 위로에 상처 침대와 수정 회의소를 만듭니다 접목 전에 하루, 70 % 에탄올에 몸을 담글 수에 의해 압력솥 및 무균 실리콘 챔버와 수술 도구를 소독. 70 % etha 교체챔버를 사용하기 전에 멸균 PBS로 nol. <ol><li> 마취 뉴 / 뉴 마우스 (7-12주 세 여성)는 intraperitoneal 주사 (100 μl/10 g의 체중) 또는 기타 선호하는 방법으로 케타민 (8 MG / ML) / xylazine을 (1.6 밀리그램 / ML)를 사용하여. 눈 윤활유를 적용합니다. 마우스 아래의 장소 가열 패드. </li><li> 요오드와 누드 마우스 다시 피부를 소독하고 알코올 면봉으로 청소하십시오. </li><li> 1-3 붙이기 절개 사이트에 0.25 % Bupivicaine을 떨어 추가 할 수 있습니다. 포셉과 목의 기지에서 누드 마우스 뒤로 피부를 꼬집어. </li><li> 멸균 가위로 몰아 피부에 작은 원형 구멍을 (직경 ~ 1 ㎝) 자른다. </li><li> 상처 침대에 멸균 실을 배치하고 피부를 주변과 챔버 가장자리를 다룹니다. </li><li> 그림 2A와 같이 챔버 가장자리를 따라 봉합 (챔버 당 6 바늘)과 장소에 보안 실. </li><li> 방 준비가, 부드럽게 소용돌이 모양의 세포 슬러리 및 1 ML의 주사기에 부착 된 23 게이지 바늘로 최대립니다. 세포 슬러리는 부드럽게, 바닥에 응축 한 경우바늘로 그리기 전에 1 ML의 피펫 팁을 resuspend. </li><li> 주사 바늘로 실 천천히 상처에 세포를 똑. </li><li> 깨끗하고 autoclaved 케이지에 배치 마우스. 집이 케이지 당 마우스 및 식수에 항생제와 타이레놀 (3 MG / ML)를 추가합니다. 우리의 경험에서, 케이지 당 두 여성의 마우스는 불리한 챔버에 외상, 이식, 또는 동물을 초래하지 않았습니다. </li><li> 반은 케이지에서 온난화 패드를 놓고 마취 떨어지기까지 쥐를 관찰합니다. </li></ol> 10. 7-9 일 후에 회의소를 제거 <ol><li> 단계 9.1에서와 같이 쏠 뉴 / 뉴 마우스를 마취. 눈 윤활유를 적용합니다. </li><li> 요오드와 실 주위에 피부를 소독하고 알코올 면봉으로 청소하십시오. </li><li> 조심스럽게 바늘을 잘라 챔버에서 제거합니다. </li><li> 부드럽게 마우스에서 챔버를 제거합니다. 챔버에 새로운 피부 이식 스틱은 집게를 사용하여 챔버에서 챔버의 일부 부드럽게 별도의 이식을 들어합니다. 챔버의 제거 동안 그라프 트를 누르십시오. 수술이 화장실해야그림 2B와 같이 K 둔하고 불투명. </li><li> 장소 (2 바늘)에 열려있는 상처 봉합 항생제의 박막과 비 점착성의 패드를 적용합니다. </li><li> 패드를 보호하고 상처를 보호하기 위해 마우스 주위에 붕대를 넣어. 장소에 붕대를 봉합 해. </li><li> 실리콘 챔버는 순한 비누로 청소하여 세척하고 철저하게 탈 이온수로 헹구어 있습니다. 70 %의 박 에탄올, 공기 건조 및 저장에 방을 만끽 해보세요. </li></ol> 11. 헤어 성장을위한 마우스 검사 <ol><li> 챔버 제거 3 일 후에 붕대와 패드를 제거합니다. 수술이 건조하고 색 갈색에 불투명해야합니다. </li><li> 헤어 성장 정기적으로 쥐를 확인합니다. 머리카락 이식 후 16일에 게재되기 시작합니다. </li></ol> 절차 개요 1 일하면 (2-3 시간) : 신생아 새끼를 희생 피부를 제거, 4 ° C 하룻밤에 dispase에 출발합니다. 2 일 (2-3 시간)는 : 피부의 기본 세포를 분리하고권장 세포 밀도의 판. 3 일 (3-4 시간) : lentivirus와 세포를 감염. 신생아 새끼의 또 다른 집합의 피부를 제거하고 4 ° C 하룻밤에 dispase에 출발합니다. 4 일 (6-8 시간) : 피부의 기본 세포를 분리, 셀, 그리고 얼음에 출발합니다. trypsinization 및 원심 분리에 의해 lentivirus에 감염된 세포를 복구, 계산 및 그라프 트 당 PBS의 50-100 μl에 7-10 X 10 6 피부 세포와 keratinocytes 조화를 이루고 있습니다. 마우스 상처 침대를 만들 챔버를 부착, 침대 상처를하기 위해 세포 혼합물을 적용 할 수 있습니다. 대체 절차 개요 대체 절차 개요 나흘에서 세 절차를 단축합니다. <ol><li> 1 시간 (예정 시간 5-7 시간)에 37 ° C에서 dispase에 마우스 스킨을 치료하여 주 1 일이 조화를 이루고 있습니다. </li><li> 두 시간 동안 도금 세포 (예상 시간 5-7 시간) 이후에 lentivirus와 세포를 감염시켜 주 2 주 3 조화를 이루고 있습니다. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

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헤어 reconstitution의 assays는 드 노보 헤어 소낭 형성의 메커니즘을 조사에 대한 고유 한 장기 재생 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 헤어 소낭 형성에 유전자 기능을 결정하는 데 유용 수정 챔버 헤어 분석을 설명합니다. 우리 검정 우리가 피부 또는 표피 세포 유형 중 하나에 유전자 overexpression 또는 분해를 달성하기 lentiviral 표현 기법을 소개하도록 수정보고 챔버 헤어 reconstitution 분석 5, 6,11,에 기반을두고 있습니다. 우리 분석은 조직 별 유전자 녹아웃을 생성 할 수있는 빠른 대안을 제공합니다. 이 분석은 우리가 그라프 트 컬렉션에 lentivirus와 기본 세포를 감염에서 최소 셋처럼 주 헤어 소낭 형성에 유전자 기능을 설명 할 수 있습니다. 우리 검정은 한 셀 타입 12에 lentivirus에 의해 조합 shRNA / cDNA 전송을 사용하여 유전자 상호 작용을 해결하기 위해 확장 할 수 있습니다뿐만 아니라 피부 및 표피 세포 사이에 신호의 일반 시험을 할 수 있습니다에스. 미묘한 결함이 관찰 어렵 동안 우리의 머리 분석은 가장, 헤어 소낭 재생에 강한 이득 또는 손실 기능 phenotypes을 검출에 적합합니다. 우리는 성공적으로 우리의 머리 재생 분석 1,12를 사용하여 몇 가지 유전자의 피부 특정 유전자의 기능을 보여주고 있습니다. GFP 마커에 따라 shRNA 10을 표현 lentivirus 벡터에서 공동이 - 표현, 우리는 기증자 피부 세포를 표현 shRNA가 생성 헤어 이식에 지속되는 보여 주었다. GFP 양성 세포는 재생 모낭 (그림 3)의 피부 유두 (DP)에 참석했다. 셀 따라서 관찰 헤어 소낭의 표현형은 null로 유전 hypomorph에서 다양한이었고, GFP의 수준을 다양한 표현으로 DP 세포 가능성이 유전자 최저의 다른 수준으로 구성. 이 분석에 대한 하나의 개선 graftin 전에 높은 shRNA 표현 세포에 대한 신속하고 효율적인 선택을 확립하는 것입니다g 강한 GFP-표현 세포를 정화하기 위해 FACS를 사용하여 같은. 대안이 검정 9 돌연변이 또는 조건부 녹아웃 세포를 대체하는 것입니다. 기본 피부 세포 passaged하고 나면 DP의 효력이 점차 손실로 다른 한편으로는, DP 세포 기능을 보존 할 수있는 문화 시스템은 매우 유용합니다. 잠재적 인 문화 시스템은 인공 틈새 또는 집계 문화 2,7,8,13에서 파생 biomaterials의 사용을 포함합니다. 또 다른 개선이 피부에 특정한 손실 또는 신선한 keratinocytes 생성하기 위해 마우스 새끼의 두 번째 세트 (7 단계)의 사용을 줄일 수로 높은 휴대 복구 속도 신뢰할 수있는 표피 세포 동결 방법 이득의를 생성하는 것입니다 기능을 연구. 머리 성장이 약간은 덜 동기화 고치 방향이 더 무작위입니다 있지만, 이러한 챔버 헤어 분석, 헤어 소낭 밀도와 일반 마우스 피부와 유사한 품질을 생산하고 있습니다. 머리 재생 유전자 분석의 몇 가지 제한이 includ전자 lentivirus와 전화 번호의 대량의 요구 사항, 그리고 이러한 패치와 플랩 assays 3,4,14 등의 헤어 reconstitution의 assays 다른 형태의에 비해 수술 방법의 측면에서 집중적 매우 노동입니다. 그러나, 머리의 성장을 감지하는 모낭과 타임 라인의 질은 다른 assays 4 우수합니다. 우리 목표 헤어 재생 분석은 기존 유전 모델에 빠르고 편리 동반자를 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> # 카탈로그를 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> 셀 N TEC </td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100의 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 로슈 </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, 1 형 </td><td> 시그마 </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> 시그마 </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> 조직 배양 접시 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> 해부 가위 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 10-275 </td><td> 곡선 </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex 공급 </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> 크기 안돼. 10 </td></tr><tr><td> 70 μm 세포 stainer </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 원심 분리기 관 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-959 - 49D </td><td></td></tr><tr><td> 알코올 면봉 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 게이지 바늘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-821 - 13F </td><td></td></tr><tr><td> 눈 윤활유 </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone - lodine의 면봉 </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 회의소 </td><td> Renner GmbH의 </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> 봉합 </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> 유연한 붕대 </td><td> 피셔 과학 </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> 비 점착성의 드레싱 </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 자료 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션을 씻으십시오 PBS 500 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 12.5 μg / ML Fungizone 100 μg / ML Gentamycin Dispase 솔루션 HBSS 2.5 MG / ML 최종 Dispase 100 μg / ML Gentamycin 중화 미디어 HBSS 15 % (V / V) FBS Collagenase 솔루션 0.25 % (w / V) Collagenase, 제 1 형 ontent &quot;&gt; 100 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 2.5 μg / ML Fungizone 50 μg / ML의 Gentamycin Polybrene 솔루션 HBSS 8 μg / ML (w / V) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

헤어 소낭의 morphogenesis, 상피 조직이 나왔죠 파생 keratinocytes과 기본 mesenchyme 간의 상호 작용을 필요로하는 복잡한 과정은 장기 개발 및 조직 별 신호를 공부 할 수있는 매력적인 모델 시스템입니다. 헤어 대과 개발이지만이 과정에 필수적인 요소의 유전자 다루기 쉬운, 빠르고 재현 분석은 도전 남아 있습니다. 여기 타겟팅 overexpression 또는 조직 별 방식으로 lentivirus를 사용하여 요소의 shRNA로 인한 최저를 생성 할 수있는 절차를 설명합니다. 헤어 재생 모델 5, 6, 11의 수정 된 버전을 사용하여, 우리는 헤어 소낭의 morphogenesis로 이어질 상피 - 중간 엽 신호 경로의 연구를 촉진하기 강력한 이득 또는 기본 마우스 keratinocytes 또는 피부 세포의 손실 기능 분석을 달성 할 수 . 우리는 lentivirus contai을 제공, 신선한 기본 마우스 keratinocytes과 피부 유두 세포 및 전구 물질을 포함 피부 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다세포 인구 중 하나에 shRNA 또는 cDNA 중 하나를 닝, 그리고 누드 마우스 실려 완전히 형성 모낭을 생성하는 세포가 조화를 이루고 있습니다. 이 방법은 3 주 이내에 모낭을 생성하는 데 필요한 조직 별 요인의 분석이 가능하고 기존 유전 모델에 빠르고 편리 동반자를 제공합니다.

그림 1에서 우리는 3 주 이전 재생 헤어 이식에 Smoothened (SMO), 중요한 쉬 신호 구성 요소의 피부 별 lentiviral shRNA의 최저의 결과를 보여줍니다. 혼자 lentiviral 벡터를 사용하여 제어 이식은 강력한 머리 성장 (그림 1A)를 보여줍니다. 반대로, 머리 성장 (그림 1B)의 손실 SMO 결과의 피부 별 최저. Hematoxylin 및 eosin 얼룩은 머리 컨트롤의 모낭 및 실험 조건 (그림 1C, D)의 단계를 도시한다. 유사한 치료에서 헤어 성장 표현형은 lentiviral 벡터 혼자 감염 긍정적 인 제어를 포함하여, 실험 중 변수가 될 수 있습니다. 따라서 긍정적 인 제어 이식은 항상 이식의 30 %가 흉터 나 이식의 불완전 첨부 파일의 결과로 실패 수 있기 때문에 레퍼런스로 모든 실험에 포함되어야합니다. 다시 한 요소의 cDNA 등 overexpressing과 같은 두 가지 요소 사이의 상호 작용을 테스트의 경우다른 요소의 scue shRNA로 인한 최저는, 하나는 항상 매니페스트 각 실험의 손실 함수 결과를에 최저 혼자 이식을 포함해야합니다. 이는 특정 유전자가 머리 소낭 재생 경로와이 유전자의 상호 작용을 perturbs 방법을 결정하는 데 필요한 범위를 제공합니다. 챔버 (그림 2A)의 제거는주의 수행해야합니다. 새로 형성된 수술이 무딘 표면 (그림 2B)로 약간 불투명해야합니다. 수술이 이식은 상처 침대에 부착 남아 있는지 확인하는 것이 중요합니다 그래서 부드럽게 한쪽 리프팅, 챔버에 충실 할 수 있습니다. 수술이 사흘 뒤에 상당히 안정적이며, 드레싱을 제거 할 때 약간의 어려움을 제시해야합니다. 강력한 머리 성장은 세 주 (그림 2C) 이후에 관찰해야합니다. mDCs이나 관세청 중 하나를 생략하면 어떤 머리를 (그림 2D) 11없이 복구 상처 부위에 발생합니다. 중 하나에서 세포 사망이나 셀 손실그림 1b에 도시 된 바와 같이 피부 - SMO 최저의 감소 ​​헤어 재생 대조적으로 머리카락의 세포 유형은 또한 결과. 성공적인 분석을 보장하기 위해, 그것은 접목하기 전에 적절한 overexpression 또는 최저 효율보다 90 % 이상 세포의 바이러스 감염을 달성하기 위해 중요합니다. 접목 절차의 시간 제약으로 인해, 우리는 접목 실험을 시작하기 전에 문제가 촬영 바이러스 감염 효율을 추천, 항상 손실 또는 이득의 표현을 확인하기 위해 절차를 접목 당일 셀의 일부를 저장합니다. Lentiviral titer는 구성 사용하고 감염이 90-100% 효율을 달성하기 전에 결정해야에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 lentiviral 벡터에서 coexpressed GFP과 바이러스 성 감염 효율을 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 분해 또는 overexpression의 범위를 결정하는 정량 PCR 및 / 또는 서양 얼룩을 수행합니다. 라벨 형광 태그 듀얼 표현 벡터를 활용급속도로 이루어질 감염 세포는 신호와 성숙 이식에서 우리의 구조를 표현하는 세포 수의 perdurance를 신고 할 수있는 방법을 제공합니다. 우리는 lentiviral 벡터 SMO shRNA와 함께 pSicoR-CMV-GFP 10에서 CMV 프로모터에 의해 구동 GFP를 사용합니다. 그림 3에서, 우리는 GFP가 대표 헤어 소낭의 피부 유두에 lentivirally - 표현된다 3 주 오래된 피부 별 이식을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> 1 그림. 헤어 대과 성장의 조직 학적 분석. (A) 빈 lentiviral 벡터 및 치료 keratinocytes에 감염된 피부 세포를 제어 헤어 재생 이식의보기. (B) 피부 세포에 lentiviral shRNA를 사용하여 Smoothened 최저의 모공 손실의 치료 keratinocytes 결과와 결합. (C) Hematoxylin 및 eosin의 착색은 anagen 헤어 f를 보여줍니다제어 이식에 ollicles은 진피로 내려 확장 및 (D) Smoothened 최저의 모낭은 저하하고 대부분 결석 남아 있습니다. 모든 이미지, 3 주 접목 후입니다. 스케일 바는 100 μm를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> 그림 2. 기본 세포를 이식. 봉합 실 주택 기본 피부 세포와 keratinocytes가있는 (A) 뉴 / 뉴 마우스. (B) 챔버의 제거가 새로 둔하고 성격의 불투명 한 것을 피부를 형성 제공합니다. (C) 이식에 완전히 성장 머리카락 사용 야생 접목 후 삼주의 주요 피부 세포와 keratinocytes을 입력합니다. (D) keratinocytes없이 주요 피부 세포의 추가는 3 주 후에 머리카락이 발생합니다. 비슷한 결과는 피부 세포가없는 기본 keratinocytes의 추가로 볼 수 있습니다. 그림 3. 3 주 이전 생성 그라프 트에서 피부 유두의 피부 유두에서 GFP의 표현의 유지 보수. 공 촛점 이미지. GFP는 lentiviral 벡터에서 피부 세포 인구로 표현하고 피부 유두 (녹색)에 감지되었습니다. Versican (빨간색)는 피부 유두와 핵은 Hoechst (파란색)과 라벨했다 demarcates. 참고 GFP는 피부 세포가 아닌 주변 keratinocytes에서 구체적으로 표현된다. 스케일 바는 20 μm를 나타냅니다.

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

이득 또는 손실 기능을 중재 할 lentivirus를 사용하여 머리 소낭 재생 모델의 조직 별 분석.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K 조회수.  Stanford University School of Medicine. 이득 또는 손실 기능을 중재 할 lentivirus를 사용하여 머리 소낭 재생 모델의 조직 별 분석.

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Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

연구

생물학

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

성인 마우스 Hippocampal 이가있는 이랑의 해부

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

추출 및 인간과 원숭이의 머리에서 코르티솔 분석

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

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