우리는 동물 실험과 지원을 위해 호주 생물 자원 (Garvan 연구소, 호주), 생물 자원 센터 (UNSW 호주)와 동물 관리 및 윤리위원회 감사합니다. 이 작품은 호주 국립 보건 의료 연구위원회 (프로젝트 그랜트 APP1062720)에 의해 지원되었다. 박사 세자르 P. 카날 레스는 CONICYT - Becas 칠레 장학금 (# 72101076)의받는 사람입니다. 씨 바셈 Akladios는 UNSW 호주로 대학 국제 대학원 상을받는 사람입니다.

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 모든 절차 승인 ACEC 프로토콜 13 / 64B에서 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오. 투명 마우스 피부 조직의 1. 준비 참고 : 본 연구에 사용 된 모든 마우스는 C57BL / 6 유전 적 배경에 있었다 <ol><li> 마우스 피부 조직의 컬렉션입니다. <ol><li> 인도적 경추 탈구로 쥐를 안락사. </li><li> 조심스럽게 피부에 상처하지 트리머 복용 관리와 관련 피부 영역에서 머리카락을 제거합니다. </li><li> 워시 피부 인산염 완충 식염수 (PBS)에 70 % 에탄올로 오염을 제거합니다. </li><li> 집게와 지느러미 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개를합니다. </li><li> 지느러미 마우스 피부 (약 1.5 × 4cm)의 큰 영역을 해부하다. </li><li> 필터 종이에 피부 진피 쪽을 평평하게하고, 샘플의 전후방 방향을 기록하십시오. </li><li> 트라이PBS에서 새로 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액으로 가득 15 ML 튜브에서 m 필터 해부 피부 주위에 종이, 장소. </li><li> 4 ℃에서 냉장고에 밤새 실온에서 1 시간 동안 고정하거나. </li><li> 15 ML 튜브에 PBS에 세척 피부 2 × 5 분. 참고 : 다음 (1.1.10 - 1.1.12)을 조직의 장기 저장을위한 선택적인 단계입니다. </li><li> 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ㎖의 튜브에 에탄올 (25 %, 50 % 70 %)의 농도가 증가하여 PBS에서 해부 피부 탈수. </li><li> 더 사용할 때까지 4 ° C에서 15 ML 튜브에 PBS에서 70 % 에탄올 탈수 피부를 저장합니다. </li><li> 4시간 지우기 전에 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ml의 튜브에서 에탄올 (70 %, 50 %, 25 %, 0 %)의 농도가 감소함에 따라 PBS에서 피부 조직을 재수. </li></ol></li><li> 마우스 피부 조직 검사를 지우기 <ol><li> 3.85 g의 요소와 3.85 g의 N, N, N을 용해하여 CUBIC1 클리어 솔루션을 준비 &#39;, N&#39;70 °의 C - (60)에 설정된 히터 증류수 5.38 ㎖ 중의은 - 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민. 뜨거운 교반기를 사용합니다. </li><li> 이 분명하고, 실온으로 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다. </li><li> 대략적인 크기 0.2 × 0.5 cm의 생검에 날카로운 면도날와 마우스의 피부를 잘라, 그리고 15 ML 튜브에 CUBIC1 클리어 솔루션 5ml에 잠수함. 모낭의 시각화를 최적화하기 위해, 생검의 긴면이 샘플의 안테 - 후방 방향을 따라 절단되어 있는지 확인합니다. </li><li> 37 ° C에서 하이브리드 오븐에서 회전하는 플랫폼에 배치합니다. </li><li> 7 일 후 청산 솔루션을 변경합니다. 사용하기 전에 신선한 CUBIC1 솔루션을 준비합니다. </li><li> 7 일 후 조직의 투명성을 확인합니다. 필요한 경우 조직이 완전히 투명해질 때까지, CUBIC1 청산 용액에 조직 검사를 둡니다. </li><li> 피부 조직 검사가 투명하면,CUBIC1 솔루션을 제거하고 37 ℃에서 6 시간 동안 조직 4 번 씻어 1 × PBS의 4를 가하여. </li><li> 37 ℃에서 4 시간 동안 15 ml의 관에서 PBS에 V 크로즈 / w 20 %의 피부 조직을 세척 하였다. </li><li> -80 ° C 형 냉장고에 하룻밤 15 ML 튜브 매체 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 장착의 조직을 고정. 참고 :이 단계는 다음 단계에서 항체 침투를 위해 조직 검사의 투과성을 증가 할 것이다. </li></ol></li></ol> 2. 면역 형광 염색법 <ol><li> 3 시간 - 2 실온에 1.2.9에서 조직) 해동. </li><li> 실온에서 8 시간 동안 PBS 5 ㎖로 15 ML 튜브에 세척 조직의 OCT 화합물을 제거합니다. </li><li> 37 년 쉐이커에 3 일 PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X100) 100 : 2 ML 튜브로 전송 생검, 모두 1 희석, 1 ml의 토끼 방지 Keratin14 또는 토끼 항 사료된다 항체의 조직을 품어 C 오븐 °. </li><li> 15 ㎖의 관,로 전송 생검차 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST 5ml에 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다. </li><li> 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 삼일 PBST 100과 부화 : 2 ML 튜브로 전송 생검 1, 희석 차 항체 Alexa594 1 ml의 항 - 토끼를 추가합니다. </li><li> 15 ML 튜브로 전송 생검, 그리고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST의 5 ㎖에서 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다. </li><li> 2 ML 튜브로 전송 생검 추가, 1 ml의 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 핵 Counterstain과 용액 (1 : 1,000) PBST와 37 ° C 오븐에 통에 밤새 품어. </li><li> DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 조직을 6 시간 동안 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST 1 ㎖​​를 추가합니다. 참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 나일 레드 염색 <ol><li> 1m의 최종 농도로 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 나일 레드 분말을 용해g / ㎖ </li><li> 1 μg / ML의 최종 농도는 1 ㎖의 PBS로 1 μL 나일 적색 용액을 추가한다. </li><li> 해동이 실온에 1.2.9에서 조직) - 3 시간 및 상온에서 8 시간 동안 5 ㎖ PBS로 세척한다. </li><li> 2 ML 튜브에 조직 검사를 전송하고, 실온에서 2.5 시간 동안 1 ml의 나일 레드 염색 용액에 조직을 잠수함. </li><li> 실온에서 30 분 동안 1 ml를 PBST로 4 회 2 ㎖의 튜브 피부 생검을 씻는다. </li><li> 상기 2 ㎖의 튜브에서 PBST 용액을 제거 DAPI 핵으로 대조 용액 (1 : 1000) 1 ㎖를 추가 PBST로 실온에서 밤새 배양한다. </li><li> DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 실온에서 6 시간 동안 피부 조직을 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST의 1ml를 추가합니다. 참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li></ol> 4. 이미지 <ol><li> (50)를 포함하는 CUBIC2 클리어 솔루션을 준비% 슈 크로즈, 25 % (w / v)의 요소, 10 % (/ V w) (w / v)의 2,2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol 및 0.1 % (v / v) 트리톤 X-100. </li><li> 37 ° C의 오븐에서 24 시간 동안 진탕 기에서 2 ㎖의 튜브에 1 ㎖의 용액 CUBIC2 피부 조직을 인큐베이션. 이 단계에서는 조직의 굴절률을 고르게한다. </li><li> 조직의 선명도를 확인합니다. 이 클리어되면, 유리 커버 슬립 상에 그 긴 변에 전체 피부 생검 (0.2 × 0.5 cm)에 위치, 모낭의 길이 방향이 커버 슬립의 표면에 평행 같은 것을 (# 1 24 X 60mm) 참고 : 선택 단계 : 항체 염색 생검은 약 7 일 동안 CUBIC2 용액에 저장 될 수있다. 나일 레드 염색 생검은 최대 1 일 동안 CUBIC2 솔루션에 저장 될 수 있으며, 가능한 한 빨리 군데해야합니다. </li><li> 영상 실을 준비합니다 (그림 1) (F를, 파란색 압정 반죽 또는 유사한을 재생하고,이 된 커버 (24 × 50 ㎜) : 이미징 챔버의 제조에 필요한 소모품은 다음과 같습니다 참고igure의 1A). <ol><li> 블루 압정의 두 개의 얇은 스트립 (직경 약 1mm × 2 ㎝)와 두 개의 커버 슬립 (그림 1B)를 준비합니다. </li><li> 피부 생검 (그림 1C)를위한 충분한 공간을 허용 한 커버 슬립에 파란색 압정 스트립을 놓습니다. 4.4.3) </li><li> CUBIC2 솔루션의 드롭 (그림 1C)의 커버 슬립에 스트립 사이에 피부 조직 검사를 놓습니다. </li><li> 두 번째 커버 슬립 (그림 1D)와 피부 생검을 커버. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경의 무대에 탑재 된 피부 조직 검사와 영상 챔버를 놓고 빛 경로로 조직을 이동합니다. </li><li> 형광 염색 관심 지역을 식별하는 수은 또는 할로겐 광원 및 표준 표면 형광 필터 (예 DAPI / GFP / CY3 / CY5)를 이용하여 시료를 검사한다. </li><li> (a 10X 및 20X 대물 렌즈 (NA 0.75) 및 표준 촛점 형광 이미징 기술을 사용하여 예를 들어., DA로 주목 화상 영역PI 염색 샘플은 405 nm의 레이저와 조명과 425 사이의 형광 신호 수집 - 475 nm의, 그리고 알렉사 플 루어 594 또는 나일 레드 묻은 시료와 561 nm의 레이저와 조명과 570 사이의 형광 신호 수집 -) 620 nm의. </li><li> 현미경 Z 스택 화상 획득 소프트웨어를 이용하여 관심있는 각각의 영역의 영상 Z-스택을 생성한다 (예., 후술하는 바와 같이 소프트웨어 4.13 NIS 촬상 소자를 사용하여). <ol><li> 최적의 레이저 파워와 PMT HV를 확인 / 오프셋 설정은 샘플 형광을 수집하기 위해 선정되었다. </li><li> &quot;취득 제어&quot;에서 &quot;ND 취득&quot;도구 모음을 엽니 다. </li><li> (다른 모든 탭이 선택 해제되어 있는지 확인합니다) &quot;Z 시리즈 설정&quot;탭을 선택합니다. </li><li> 라이브 스캔하는 동안, 샘플의 상단에 초점을 맞추고 &quot;최고&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 샘플의 바닥에 집중하고 &quot;바닥&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 입력 필수 단계 크기 (누르거나 최적화 된 스텝 크기 버튼). </li><li> 사전SS 버튼 &quot;지금 실행&quot;. </li><li> 개별 티파니 이미지 스택과 같은 결과 Z-스택 (이미지 Z-스택 당 1 형광 색소)을 저장합니다. </li></ol></li><li> 3D 분석 소프트웨어를 사용하여 관심의 3 차원 볼륨 영역을 재구성 화상 Z-스택을 사용 (예., 후술 Imaris x64의 7.2.3를 사용하여). <ol><li> 분석 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 선택 3D 볼륨 생성을위한 도구 모음에 버튼을 &quot;능가&quot;. </li><li> 열기 최초의 컬러 이미지 Z 스택 (예., DAPI). </li><li> 추가 색상 채널, 형광 색소 당 하나의 채널을 추가하려면 &#39;채널을 추가&#39;도구를 사용합니다. 따라서 DAPI와 알렉사 플 루어 594 형광 색소를 모두 포함하는 샘플은 두 개의 채널이 필요합니다. </li><li> 위의 4.7에서의 결정에 따라, (XYZ)을 올바른 픽셀 (복셀) 크기를 설정하려면 &quot;이미지 속성&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 필요에 따라 채널의 색상을 변경하려면 &quot;디스플레이 조정&quot;도구를 사용하여 (예를 들어, 파란색에 DAPI 채널을 설정 알렉사 플 루어 빨간색으로 594 채널). </li><li> 포에이미지 창에서 3D 볼륨을 sition, 필요에 따라 클릭하고 드래그 볼륨으로 컴퓨터 마우스를 사용합니다. </li><li> 3D 영상의 스크린 샷을 생성하기 위해 도구 모음에서 &quot;스냅 샷&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 3D 샘플 회전의 영화를 생성하는 도구 모음에서 &quot;애니메이션&quot;도구를 사용합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li><li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li><li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secret+life+of+the+hair+follicle.">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li><li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+skin+development,+homeostasis,+and+disease.">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+controls+stem/progenitor+cell+proliferation+in+the+mouse+postnatal+epidermis.">Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis.</a> J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer.">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li><li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen.">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li><li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis.">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749 (2014).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

피부 개발 및 항상성 제어 규제기구는 가장 일반적으로 피부 형태학, 세포 집단 또는 단백질 발현의 제한된 하락 가능 항체와 조직 절편의 조직 학적 염색 또는 표지를 사용하여 2 차원으로 연구된다. 다수의 방법은 표피 전체 마운트 10-13의 3 차원 단일 세포 해상도 세포 단백질의 공간적 조직의 시각화를 개선하기 위해 개발되었다. 이들 중 일부는 특히 그러나 털이 피부를 사용하여 기술...

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 그것은 세 가지 주요 레이어 외부 표피, 진피 및 피하로 구성되어 있습니다. 표피는 높은 재생 조직이다. 그것은 주로 각질 구성된 층상 편평 상피이다. 각질 세포는 기저층에서 태어나 차별화하면서 suprabasal 레이어를 통해 위쪽으로 이동하고, 결국은 자신의 출생 후 한 달에 대한 외부 각질화 층에서 발산되어있다. 표피는 모낭 및 피지선 포함 부속물들을 개발하고있다. 모낭은 생활 1 전체에 순환 방식으로 재생. 표피의 재생 능력은 interfollicular 표피와 모낭 (2)의 기저층에있는 줄기 및 전구 세포의 존재에 의해 사용할 수 있습니다. 많은 신호 전달 경로는 표피 개발 및 재생에 관여하고있다. 이들 중 일부는 내 발생이러한 헤지 호그 경로로만 표피. 다른 신호 이벤트는 진피와 표피 세 사이에 발생한다. 예를 들어, 진피의 Wnt 신호 모낭 발달에 중요한 것으로 생각되며, 그들은 활성화 성장기의 발병 모유두에서 분비되는 모낭 벌지 줄기 / 선조 세포의 증식 및 모발 성장은 4. 더 나은들이 피부암으로 회생 피부 질환으로 교란 될 수있는 방법을 이해하는 표피 발달 및 재생을 제어하는​​ 세포 및 분자 적 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 이 문서에서는 C의 리어 설명, U는 전체 마운트 피부 준비를 명확히하고, 공 초점 현미경에 의한 단일 셀 해상도에서 3 차원 단백질 발현 패턴을 시각화하는 B 비 I의 maging 칵테일과 C omputational 분석 (CUBIC) 프로토콜 5-7 nobstructed. 입방 방법은 피부의 몰입을 포함한다이 아미노 알코올 기반 화학 칵테일의 조직. 이러한 솔루션은 단일 세포 면역 해상도를 허용 투명 단백질 손상 조직을두고 피부 샘플의 굴절률을 조정한다. interfollicular 표피와 모낭에서 각질 세포 인구를이 CUBIC 프로토콜, 기초를 사용하고 증식하는 안티 Keratin14 (K14) 및 안티 사료된다 항체를 사용하여 야생형 마우스의 전체 두께 피부 생검에 몇 군데 있었다. 야생형 피부 조직 검사에서 피지선은 나일 레드 염색을 사용하여 시각화 하였다. 마지막으로, 야생형 및 증식 YAP2-5SA-ΔC 피부 생검의 기초 각질 세포 인구 8을 비교 하였다. 이 CUBIC 프로토콜은 단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 조직 검사에서 단백질 발현의 시각적 평가를 가능하게하고, 유전자 변형의 피부의 표피 해부학과 형태 학적 결함을 인식하는 중요한 도구입니다마우스 및 표피 개발과 재생의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">P6418</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ethanol 96% (undenaturated)</td>
			<td style="width:195px;">Chem-supply</td>
			<td style="width:229px;">UN1170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Nile Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">821940</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sucrose</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">S0389</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td style="width:195px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:229px;">4583</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Keratin14 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Covance</td>
			<td style="width:229px;">PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Ki67 antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:229px;">ab16667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:423px;">Donkey anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:229px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Urea</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">66612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8242;,2&#8242;&#8217;-nitrilotriethanol</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">137002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:423px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon Instruments Inc</td>
			<td style="width:229px;">Nikon A1 - Confocal Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">cruZer6 Face Trimmer</td>
			<td style="width:195px;">Braun</td>
			<td style="width:229px;">Braun cruZer6 Face</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">438456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 외부 표피 층은 모낭과 땀샘 우리의 몸과 표피 부속의 대부분을 커버하는 층상 편평 상피이다 interfollicular 표피로 구성되어 있습니다. 표피는 일생 동안 부상에 응답하여 재생을 겪는다. 이 긴밀하게 표피 내부와 표피와 진피 사이의 활성 여러 규제 메커니즘에 의해 규제되는 기저 상피 줄기 / 전구 세포 인구를 K14이 발현으로 활성화되어 있습니다. 이 문서는 전체 두께 마우스 피부 생검을 명확히하고, K14 단백질 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 설명, 사료된다 세포 증식라고 표시된, 나일 레드 sebocytes를 표시 및 3D에서 단일 셀 해상도 DAPI 핵 라벨. 이 방법은 정확한 평가와 피부 해부학과 병리학의 정량 및 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의 수 있습니다. 입방 프로토콜은 일입니다단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 생검 분자 및 세포 상호 작용을 조사 날짜에 사용할 수 전자 최선의 방법.

성인 야생형 마우스의 전체 두께 등의 피부 생검은 기저 각질 세포 마커 Keratin14 (K14)를 결합하는 항체로 염색, 명확하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 2, 영화 1)으로 대조 하였다. DAPI 양성 핵 샘플 (도 2A, C)에 걸쳐 볼 수 있었고, K14 염색 배타적 interfollicular 표피의 하나의 셀 두께의 기초 층에 표시이고, 피지선 (검은 색 별표)의 외주 루트 칼?...

Watch this Scientific Journal Video about CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations at JoVE.com

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

cubic-protocol-visualizes-protein-expression-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K 조회수.  University of New South Wales Australia.  이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의. 

비디오: CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...