우리는 피드백을 박사 에반, 뉴웰 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 또한 멀티 란탄 족 함유 폴리스티렌 구슬의 샘플에 대한 DVS 과학 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 NIH 보조금이 U19 AI057229에서 자금에 감사합니다.

CyTOF의 모든 세포 샘플은 고정 per​​meabilized해야합니다. 이 이리듐 함유 DNA의 intercalator의 큰 항목을 가능하게하고, 또한 대량 cytometer에 주입하기 전에 즉시 MilliQ 물 세척 및 resuspension 단계 동안 세포 용해를 방지 할 수 있습니다. 1. 시작 - 최대 질량 Cytometer의 <ol><li> CyTOF 소프트웨어 프로그램을 엽니 다. 악기 설정을 선택합니다. 카드 케이지 탭에서 오른쪽 하단 모서리로 이동하고 버​​튼을 &quot;ON&quot;히터를 클릭합니다. 200 ° C.에 도달하는 스프레이 챔버 맨틀에 대한 충분한 시간을 허용하도록 히터에 원하는 시간 전에 적어도 15 분을 돌려 </li><li> MilliQ 물로 가득 찬 신선한 주사기와 주사기 펌프에 흰색 규격-Ject 3 ML의 주사기를 교체합니다. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 작은 액체 소개 포트와 큰 가스​​ 도입 포트 모두를 통해 5% citranox 2 ~ 3 배를 끌어 주사기와 튜브를 사용하여 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 Backflush. MilliQ 물 t으로 backflushing 반복잔여 citranox를 제거 O. </li><li> CyTOF의 전면 패널에있는 표시등은 그림 1에서와 같이 불이되어 있는지 확인하십시오. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> 시작하기 전에 그림 1. CyTOF 패널 등. <ol start="5"><li> 아르곤 가스 탱크 밸브를 엽니 다. 이 켜하기 위해 전면에있는 &#39;아르곤&#39;빛의 원인이됩니다. </li><li> 가스 유입을 업 할 수있는 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 연결합니다. 나사가 빠지다 가스 튜브 커넥터를 메이크업과 검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 제거합니다. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 가스 도입 포트 줄기에있는 넓은 &quot;마디&quot;를합니다. 가스 도입 포트에 커넥터를 배치합니다. 가스 포트의 끝 부분 위에 검은 색 O-링을 배치하고, 포트 줄기의 넓은 부분을 통과 O-링을 강제로. 화장 가스 튜브로 하얀 원뿔 플라스틱 지적 좁은 끝으로 상단에 작품과 나사를 배치합니다. </li><li&gt; 액체 소개 관에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 첨부합니다. 조심스럽게 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝에 개통에 작은 튜브를 삽입합니다. micropipettor에 정류장에 느끼는 유사한 두 정거장이 될 것입니다. 당신은 가벼운 저항을 만날 때까지 첫째, 키를 눌러, 작은 튜브의 끝은 유리의 직선 섹션의 끝 부분에 있어야합니다. 둘째, 피팅에 더욱 유리의 직선 부분의 끝을 강제하기 위해 더 열심히 눌러 밀봉 할 나사 피팅 조입니다. 가열 망태에있는 하얀 개방에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝을 삽입합니다. </li><li> 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 &quot;시작 플라즈마&quot;를 누르십시오. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요이 이미 삽입되어 있기 때문에, &quot;OK&quot;를 누릅니다. 이 소프트웨어는, 냉각기를 켜 가스의 흐름을 시작하고 플라즈마에 불을 지필 것입니다. 검출기 전압 두는 것입니다. 완료되면 &quot;플라즈마 시동 순서가 성공적으로 완료되었습니다&quot;라는 팝업 창이있을 것이다; 보도 &quot;OK&quot;. 새로운 불빛 (그림 2 전면 패널에에 있어야합니다 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> 그림 2. 플라즈마 점화 및 시동 성공적으로 완료 CyTOF 패널 등 후. <ol start="9"><li> 주사기 펌프 켜기. 오른쪽 상단에서 주사기 펌프를 시작하고 튜브를 통해 액체를 흐르는과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요에서 분사를 시작 녹색 &#39;재생&#39;버튼을 누릅니다. 기본 주사기 설정 물 3 ML위한 것입니다. 이 물 부족하면 샘플 샘플 루프를 통해 흐르는 될 위해서는, 주사기 펌프는 주기적으로 변경해야합니다. 화면의 상단에 액체가 주사기 펌프 밖으로 흘러이 얼마나 나타내는 카운터가 있습니다. 주사기 펌프이 카운터가 주사기의 끝을 도달 &quot;3.000&quot;또는 플런저에 도달 할 때 중단됩니다. 주사기를 충진 할 때, &quot;그만하세요&quot;가 아닌 카운터를 재설정 할 수있는 파란색 &#39;일시 중지&#39;버튼을 누르해야합니다. </li></ol>대량 Cytometer의 전자 &quot;&gt; 2. 매일 보정 <ol><li> 대량 cytometer는 보정 전에 뜨거운 안정적인 플라즈마를 달성하기 위해 약 20 분 필요합니다. 높은 가치의 3 % 이하 신호, 조정 단계의 목적은 &quot;Gd155&quot;을 (La139 + O16 산화) 유지하면서 Tm169 또는 Tb159의 원하는 신호를 극대화하는 것입니다. 데이터 수집 설정 창을 엽니 다 수집 설정 버튼을 클릭합니다. Analytes 탭에서 동위 원소 선택 패널을 열려면 주기적으로 테이블을 클릭합니다. 설명서에 나와있는 DVS 과학 튜닝 솔루션에서 동위 원소를 선택한 다음, &#39;저장&#39;을 클릭합니다. </li><li> 읽기 창 당 질량을 (ES) 열 버튼을 읽기 당 동위 원소를 클릭합니다. 새 번호를 입력하고 &quot;입력&quot;키를 눌러 &quot;펄스 카운트&quot;, 그리고 rescale y 축을 선택합니다. </li><li> 튜닝 솔루션을 그린 한 ML 규격 - Ject의 주사기를 채우십시오. &quot;로드&quot;를 샘플 포트 선택기를 돌려, 튜닝 솔루션 450 μl를 삽입 한 다음 &#39;삽입&#39;할 수있는 선택기를 켜십시오. 데이터 Acquisit의 질량 보정 탭에서<html> 이온 설정 창은 군중에 의해 흐르는되는 모니터링하기 위해 &#39;실행&#39;을 누르십시오. 오른쪽은 높은 질량 상태에서 창 왼쪽은 낮은 질량입니다. 참고 : 이미 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소 (그림 3)에 의한 TOF 9400-9800 지역에서 신호가있을 것입니다. 튜닝 솔루션 동위 원소가 디스플레이에 줄무늬 (그림 4)로 표시되기 시작 때까지 기다리십시오. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> 세탁 솔루션과 물 헹굼 후 다양한 동위 원소에 대한 배경 수준을 보여주는 그림 3. 질량 보정 탭 창. TOF 9400-9800 주변 지역은 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소에 해당하는, 항상 존재해야합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 4 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 질량 보정 탭 창, DVS 튜닝 솔루션의 다양한 동위 원소에 대한 수직 줄무늬를 보여주는이 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol start="4"><li> 창을 읽기 당 질량 (ES)로 돌아가서 왼쪽 상단 모서리에있는 녹색 &quot;재생&quot;버튼을 누르십시오. 단계 2.1에서 선택한 각 동위 원소는 다른 색 선으로 표시됩니다. 기본 x 축은 초에 &quot;시간&quot;입니다. 사람들이 안정된 때까지 서로 다른 동위 원소의 양을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 현재의 조정. 데이터 수집 설정 윈도우의 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 &#39;현재&#39;를 선택합니다. = 0, 마무리 = 10, 단계 값 = 0.5, 정착 시간 = 200을 시작하자,하고 &#39;저장&#39;을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)에 돌아 가기를 클릭합니다. x 축은 이제 &quot;현재&quot;입니다. 참고 곳 동위 원소 피크 (그림 5), 그리고 R의 신호<html> ecord. 악기 설정 창 DAC 채널 설정 탭에서 &#39;현재&#39;아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 &quot;실제 현재 값을 설정&quot;을 선택한 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li></ol><img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> 그림 5. 현재 튜닝 프로필. <ol start="6"><li> 화장 가스의 조정. 드롭 다운 메뉴 변경 &#39;메이크업 가스를. &quot; = 0.95, 단계 값 = 0.05, 정착 시간 = 200 = 0.55, 최종을 시작하자. 저장을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)로 돌아 가기. x 축은 이제 &quot;메이크업 가스&quot;유량입니다. 기록 곳 동위 원소 피크의 신호. 끝 부분의 &quot;Gd155&quot;신호 (그림 6)의 급속한 증가를 관찰. DAC 채널 설정 탭으로 돌아 가기로 &quot;메이크업 가스&quot;를 아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 &quot;실제 현재 값을 설정&quot;을 선택한 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li></ol>igure 6 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 6. 메이크업 가스 조정 프로필. <ol start="7"><li> 의 녹화 비율은 동위 원소 대 산화물을 원하는. 튜닝 솔루션의 두 번째 450 μl 주사를합니다. 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 &quot;시간&quot;을 선택, 시간 = 200 정착, = 0, 최종에게 = 10, 단계 값 = 1을 시작해보세요. &quot;저장&quot;을 누르십시오. 창을 읽기에 따라 대용량의 &#39;재생&#39;(ES)를 누르십시오. 라인 (그림 7) 안정화 한 후 Tm169 또는 Tb159 (높은 값)에 대한 왼쪽 상단 상자에 값을 읽어 커서를 사용하고 또한 &quot;Gd155&quot;값 (높은 값의 &lt;3 %). 이 값은 나중에 참조 할 수 있도록 조정 파일에 저장할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> 그림 7. 현재 및 메이크업 가스를 최적화 한 후 튜닝 솔루션 신호 강도의 측정. <ol start="8"><li> 샘 청소ple 루프. DVS 워시 솔루션 500 μl 다음, 샘플 루프를 통해 MilliQ 물 3 ML를 삽입. 질량 보정 탭에서 &quot;실행&quot;을 눌러 청소의 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. 줄무늬의 강도는 (그림 4) 배경 수준 (그림 3)으로까지 MilliQ 물 및 모니터 3 ML에 따라 다음 감소하기 시작 때까지 씻는다. </li></ol> 3. 실행 샘플 <ol><li> 취득 창을 엽니 다. 기본 설정 : 즉석에서 분석 = 수행 = 듀얼, 듀얼 카운트 보정 = 데이터를 분석하는 신호. 노이즈 감소가 선택됩니다. 원하는 경우 다음의이 변경 될 수 있습니다. 파일 이름을 입력합니다. 모든 파일은 E의 :/ / 드라이브에 저장해야합니다. </li><li> 인수 지연을 설정합니다. 샘플 루프와 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 사이의 튜브의 길이에 따라 약 30 초의 전지 이벤트를 등록에 다소 시간이 지연 될 수 있습니다. 따라서, 합 &quot;취득 지연&quot;총과 &quot;감지기 세인트능력 지연은 &quot;최소 30 초이어야합니다. 탐지기 안정성 지연은 적어도 20 초이어야합니다. </li><li> 데이터 수집 시간을 설정합니다. &quot;취득 시간은&quot;당신이 샘플을 실행하려면 시간 (초)입니다. 전체 450 μl 샘플 루프를 작성하면 600 초 완료 할 필요합니다. 그것은 50-100 초는 샘플을 수행 오버 최소화하기 위해 런타임의 마지막에 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 시료의 Resuspension. 기계에 염분의 빌드 업 최소화하기 위해, 그것은 MilliQ 물에서 최종 resuspension 다음, 세포 염색의 끝에서 MilliQ 물에서 적어도 두 개의 세차가 완료하는 것이 좋습니다. MilliQ 물의 볼륨 펠릿은 당신이 시작 셀 및 전체 염색 절차 후 세포 회복의 수에 따라 달라집니다 셀을 resuspend하는 데 사용됩니다. 좋은 시작 장소는 10 6 (시작) 셀 / ML입니다. resuspension 후, 응집체를 제거 할 셀 스트레이너를 통해 필터링합니다. </li><li> 시작 샘플 실행합니다. 현재 샘플에 대한 새 파일 이름을 입력합니다.<html> , &quot;로드&quot;샘플을 삽입, 취득 창에서 다음 누르 &quot;실행&quot;을 &quot;주입&quot;로 전환하려면 샘플 루프 밸브를 전환합니다. </li><li> 셀 이벤트를 등록. 셀은 각 수직 동위 원소 / 마커 채널 (그림 8)에서 마르크의 수평 모음으로 스냅 샷 창에 표시됩니다. 대량 cytometer 1,000 세포 / 초를 등록 할 수 있지만, 셀 이벤트 사이의 더 나은 해상도는 일반적으로 300-500 셀 / 초에서 얻어진다. 이 ~ 1 셀 / 화면 재생의 평균에 해당합니다. 셀 이벤트 카운터가 뜨기 시작하기 전에 30 초까지 걸릴 수 있습니다. 이것은 &quot;에 On-The-Fly&quot;데이터 처리로 인해, 더 셀 이벤트 정보가 손실되지 않습니다. </li></ol><img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> 8 그림. 샘플 동안 수집 창에 별도의 세 가지 세포 사건과 관련된 요소에 해당하는 장소의 수평 행을 보여 실행할 수 있습니다.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol start="7"><li> 세포 사건의 품질. 각 동위 원소 채널뿐만 아니라 셀 이벤트 요금 좋겠어 어떤 배경을 확인할 수 있습니다. 대량 cytometer는 배경 위에 신호의 특정 증가로 &quot;셀 이벤트&quot;, 이렇게 무료로 금속 또는 언 바운드 항체는 &quot;셀 이벤트&quot;수를 변경할 수에서 배경 신호를 인식합니다. 또한, 너무 높은 농도에서 세포를 실행하는 것은 쌍으로 된 것 이벤트의 증가 된 수의 원인이 될 수 있습니다. 배경은 추가 세차 이상 세포 희석가 감소 할 수 있습니다. Doublets이 증가 런타임의 비용에서 큰 세포 희석하여 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 샘플 데이터 수집을 완료. 수집 시간에 도달하면 데이터 수집이 완료된다. 있는 팝업 창이하기 전에 약간의가있을 것 &quot;OK&quot;버튼이 나타납니다, 다시이 &#39;에 On-The-Fly &quot;데이터 처리 때문입니다. 샘플 획득도 premat 중지 할 수 있습니다urely &quot;중지&quot;버튼을 눌러. 이 경우 이미 등록 모든 셀 이벤트는 출력 파일에 포함하여 처리됩니다. </li><li> 각 샘플 사이의 MilliQ 물을 적어도 500 μl의 주입은 또한 샘플 carryover를 최소화하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 4. 사용 후 기계 청소 <ol><li> 솔루션을 씻으십시오. 최종 샘플을 실행하고 물 플러시 샘플 루프, 샘플 루프로 세척 솔루션의 450 μl를 삽입 한 후. 단계 2.8에서와 같이 데이터 수집 설정 창 (그림 9)의 질량 보정 탭에서 무료로 금속의 릴리스를 모니터링 할 수 있습니다. 무료 금속 신호가 감소하기 시작하면, MilliQ 물 3 ML로 플러시하고 배경 수준이 달성 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> DVS 워시 솔루션과 사후 운영 청소하는 동안 그림 9. 질량 보정 탭 창,. TOF 지역 9800-11000의 수직 줄무늬는 기계 청소하는 항체 - 라벨 동위 원소입니다. TOF 11,500 주변의 수직 줄무늬가 두 적외선 intercalator의 동위 원소에 해당합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 5. 컴퓨터를 종료 <ol><li> 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 &quot;플라즈마를 중지&quot;를 선택합니다. 절차가 완료되면 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거하라는 팝업 창이있을 것입니다. &quot;OK&quot;를 누릅니다. 카드 케이지 탭에서 히터를 끄십시오. 아르곤 공급 장치의 밸브를 닫습니다. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 제거. 조심스럽게 뒤로 당겨 스프레이 챔버에서 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거합니다. 나사가 빠지다 샘플 소개 단계 1.6에서 관 그리고 옆 넣습니다. 약간 느슨하게하기 위해 돌려서 메이크업 가스 도입 연결 한 다음, 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 당긴다. 함께 망 피팅으로 남겨두면 리터의 가능성을 줄일 수 있습니다검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 osing. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 단계 1.3에서와 같이 주사기와 튜브를 사용하여 5 %의 citranox과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 두 포트를 Backflush. 스토어, 다음 사용 때까지 5 % citranox에 덮여. </li></ol>

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

인간 면역 감시 센터, 대량 세포 계측법을 포함한 assays의 비용을 복구 전적으로 사용자의 비용을 청구 스탠포드 대학에서 서비스 센터에서 저자는 일 모두.

지난 몇 수십 년 동안 형광 유동 세포 계측법은 표면 표현의 측면과 기능 assays에서 모두 단일 세포를 분석 주력 방법이었습니다. 그러나, 형광 염료의 스펙트럼 중복의 문제가 동시에 마커의 수를 제한하고 있습니다. 12 개 이상의 동시 마커를 사용하여 실험이보고 된 반면, 필요한 보상의 양이 기술적으로 어려워집니다. 대신 fluorophores의, 대량 세포 계측법은 항체에 대한 라?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> CyTOF TM 대량 cytometer </td><td> DVS 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 솔루션을 씻으십시오 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201071 </td><td> 물에 0.05 % 불화 수소산 산 </td></tr><tr><td> 솔루션을 튜닝 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201072 </td><td> 0.5 ppm으로 라, CS, TB, TM, IR, 추적 질산 </td></tr><tr><td> 유럽​​ 연합 (EU) 함유 폴리스티렌 구슬 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201073 </td><td> 약 1,000,000 / ML에서 제공 구슬, 자연 풍부한 유럽 연합 (EU) 동위 원소를 포함 </td></tr><tr><td> 멀티 란탄 족 함유 (라 / 홍보 / TB / TM / 루) - 폴리스티렌 구슬 </td><td> DVS 과학 </td><td> 아직 상업적으로에 사용할 수 </td><td> 등록 된 란탄 계열 원소의 자연 풍부한 동위 원소를 포함 </td></tr><tr><td> 질산 (집중) </td><td> 피셔 과학 </td><td> A467-500 </td><td> Optima 추적 메탈 순수 ICP-MS 학년 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 내내 아래로 튜브 셀 스트레이너 캡-5mL로 </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 주입하기 전에 세포 샘플을 필터링하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 규격 - Ject tuberkulin 주사기-1mL </td><td> 헨케 말대꾸 늑대 </td><td> 4010-200V0 </td><td> 실리콘 무료, 라텍스 무료 </td></tr><tr><td> 규격 - Ject의 주사기-3 ML </td><td> 헨케 말대꾸 늑대 </td><td> 4010.000V0 </td><td> 실리콘 무료, 라텍스 무료 </td></tr><tr><td> MilliQ 물 </td><td></td><td></td><td> 18 MΩ 순수한 물, 유리 또는 상업적 세제 (바륨 현재의 높은 수준으로 인해)으로 세척 한 플라스틱 병에 저장해서는 안됩니다. </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> Z273236 </td><td> 산성 세제 </td></tr><tr><td> 아르곤 가스 </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999 % 초 고순도 </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

최근 몇 년 동안, 단일 세포의 급속한 분석은 일반적으로 유동 세포 계측법과 휘황-라벨 항체를 사용하여 수행되었습니다. 그러나, 형광 방출의 스펙트럼 중복의 문제는 동시 프로브의 수를 제한하고 있습니다. 반면, 오히려 fluorophores보다 ICP-MS. 1 액체 단일 셀 도입 시스템 DVS 과학 커플의 새로운 CyTOF 질량 cytometer는 매우 강화 금속 동위 원소를 포함하는 킬레이트 화 고분자는 항체 또는 기타 특정 프로브에 연결된다. 2-5가 때문에 금속 순도와 질량 cytometer의 대량 해상도, 인근 동위 원소로부터 &quot;스펙트럼 중복&quot;은 없습니다, 따라서 보상 매트릭스 필요. 또한, 란탄 족 금속의 사용으로 인해, autofluorescence 대한 동등한 따라서 거기에는 생물학적 배경이 없습니다합니다. 원자 질량 103-203, 이론적으로 최대 100 레이블이 동시에 구별 할 수에 걸쳐 대량 창을 갖추고 있습니다. 현재, 35 개 이상의 채널 샘플 면역 프로파일의 전례 절개를 허용 DVS 과학에서 사용할 수있는 킬레이트 시약을 사용하여 사용할 수 있습니다. 6-7 대량 세포 계측법에 단점은 프로브 당 별도의 금속 동위 원소 (앞으로 또는 측면 분산 가능성이 이에 상응하는 금액),하고 파괴적인 기술 (복구를 정렬의 어떠한 가능성)이라는 사실에 대한 엄격한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 대량 cytometer의 현재 구성도 만의 셀 전송 속도 ~ 25 %, 따라서 세포의 높은 입력 번호를 필요가 있습니다. 대량 cytometer의 최적의 일일 실적은 몇 가지 단계가 필요합니다. 최적화의 기본 목표는 M 신호 강도를 줄이고 M 16에서 원하는 신호를 방해한다는 산화물 (M 16)의 형성을 최소화하면서 원하는 금속 동위 원소 (M)의 측정 신호 강도를 극대화하는 것입니다. 첫 번째 단계는 시스템 때문에 고온, 안정적 I을 따뜻하게하는 것입니다CP 플라즈마가 설립되었습니다. 둘째, 현재와 메이크업 가스 유량에 대한 설정은 매일 최적화해야합니다. 샘플 수집하는 동안, 최대 셀 이벤트 요금은 검출기 효율과 처리 속도 1,000 세포 / 초에 의해 제한됩니다. 그러나, 느린 셀 이벤트 속도 (300-500 셀 / 초)은 샘플의 품질에 따라 보통 셀 이벤트 사이하므로 더 나은 해상도가 doublets와 파편을 통해 그대로 singlets을 극대화 할 수 있도록하는 것이 바람직하다. 마지막으로 하루의 끝에 기계의 적절한 청소는 무료 금속에 의한 배경 신호를 최소화하는 데 도움이됩니다.

위의 프로토콜을 따르면 네 가지를 달성해야합니다. 첫째, 대량 cytometer를위한 충분한 워밍업 시간을 허용하는 것은 최적의 신호와 최소한의 산화물 형성에 필요한 뜨거운, 안정적 플라즈마를 생성합니다. MilliQ 물과 DVS 워시 솔루션 (그림 9)와 대량 cytometer의 두 번째, 적절한 세척은 (그림 8) 샘플 수집하는 동안 배경을 감소하는 데 도움이, 금속 흡착의 수준 튜브와 기계의...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K 조회수.  Stanford University. CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의

비디오: Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

연구

생체공학

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

휴대 전화에 폭 넓은 분야 형광 현미경과 형광 이미징 유동 세포 계측법

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, known as the Aristotle's lantern, is a compelling source of bioinspiration with an intricate network of musculature and calcareous teeth that can scrape, cut, chew food and bore holes into rocky substrates. We describe the bioinspiration process as including animal observation, specimen characterization, device fabrication and mechanism bioexploration. The last step of bioexploration allows for a deeper understanding of the initial biology. The design architecture of the Aristotle's lantern is analyzed with micro-computed tomography and individual teeth are examined with scanning electron microscopy to identify the microstructure. Bioinspired designs are fabricated with a 3D printer, assembled and tested to determine the most efficient lantern opening and closing mechanism. Teeth from the bioinspired lantern design are bioexplored via finite element analysis to explain from a mechanical perspective why keeled tooth structures evolved in the modern sea urchins we observed. This circular approach allows for new conclusions to be drawn from biology and nature.

A protocol for bioinspired design is described for a sampling device based on the jaws of a sea urchin. The bioinspiration process includes observing the sea urchins, characterizing the mouthpiece, 3D printing of the teeth and their assembly, and bioexploring the tooth structure.

Bioinspired 디자인을위한 프로토콜 : 접지 샘플러 성게 턱을 바탕으로

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...