이 작품은 국립 암 연구소, CA131967의 교부금에 의해 지원되었다.

1. BrdU의 설립 (터미널 라벨링) <ol><li> 이전 BrdU의 추가로 150mm 조직 문화 요리 24 시간에 약 70 %의 합류로 플레이트 세포. </li><li> 전에 수확에 적합한 시간 지점에서 20 μg / ML BrdU (시그마)를 포함하는 신선한 완벽한 미디어와 미디어를 대체합니다. 시간이 세포의 길이는 BrdU는 일반적으로 G2 단계는 시간 (그림 1) 2 사이 5 정도, 세포 유형 및 종과 다를 수있는 미디어에 배양되어 있습니다. </li></ol> 2. Monolayer 셀 문화의 염색체 수확 <ol><li> 접시에서 문화 미디어를 제거하고 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브 10 ML를 수집합니다. 나머지 미디어를 폐기하십시오. </li><li> 10 ML Versine [또는 HBSS (시그마)]로 한 번 세포를 씻어. </li><li> 접시에 Versine (또는 HBSS)의 5 ML 0.25 % 트립신을 추가합니다. 세포 판에서 분리 될 때까지 실온에서 알을 품다. </li><li> 단계 2.1에서 미디어 10 ML을 포함하는 튜브에 trypsinized 세포 현탁액을 추가합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 펠렛 셀에 10 분 400 XG에 원심 분리기. 0.5 미디어 ML 플러스 세포 펠렛을두고, 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 pipetting하여 철저하게 세포를 Resuspend. </li><li> hypotonic 솔루션 3 물방울 추가 (를 0.075 M KCl (시그마)는 37 예열 ° C), 파스퇴르 (Pasteur) 피펫으로 세포 현탁액을 섞는다. 0.5 ML hypotonic 솔루션을 추가하고 파스퇴르 피펫로 다시 섞는다. 5 ML에 hypotonic 솔루션의 볼륨을 데려와 다시 한 번 섞는다. 세포 유형에 따라 20-45 분에 대해 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 10 분 400 XG에 원심 분리기. 0.5 미디어 ML 플러스 세포 펠렛을두고, 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 부드럽게 튜브를 flicking하여 세포 펠렛을 Resuspend. osmotically 부어 셀은이 시점에서 연약하므로주의가 세포질 세포막을 방해하지 않도록해야합니다. </li><li> 부드럽게 파스퇴르 (Pasteur) pipett로 pipetting하여 혼합; Carnoy의 정착액 (메탄올 1시 3분 빙하 아세트산) 3 방울을 추가5. 부드럽게 파스퇴르 피펫으로 pipetting하여 0.5 ML의 정착액 및 혼합을 추가합니다. 정착액의 용적 (5) ML로 준비하고 부드럽게 파스퇴르 피펫으로 pipetting하여 다시 섞는다. 고정 셀은 몇 개월 -20 ° C에서 어둠 속에서 저장 될 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기 및 단계 2.8에서와 같이 대기음. </li><li> 신선한 정착액에 세포 펠렛을 Resuspend, 펠릿 및 추가 ~ 10 배 Carnoy의 정착액의 볼륨의 볼륨을 예상하고 있습니다. </li><li> 세포 현탁액 서부 유럽 표준시, 얼음처럼 차가운 현미경 슬라이드에 드롭 현명한을 추가, ~ 45 ° 각도로 슬라이드를 누른 상태에서 슬라이드의 표면 흐름에 세포 현탁액 할 수 있습니다. 종이 수건에 평면 슬라이드와 홍수 정착액으로 슬라이드를 마련하고 건조한 공기 할 수 있습니다. 역 현미경을 사용하여 mitotic 확산의 존재에 대한 슬라이드를 선택합니다. </li></ol> 3. RNase 처리 및 에탄올 탈수 <ol><li> 10 μg / 각 슬라이드에 2 배 SSC의 ML RNase A (시그마)의 장소 200 μl, 37 &amp; 드에 품다g, C 1 시간을위한. </li><li> 워시 배 SSC, 3 분 각각에 대해 실온에서 pH를 7.0로 3 회를 슬라이드. </li><li> 3 분 각 객실 온도에서 EtOH (시그마) 시리즈 (70 %, 90 % 및 100 %)을 통해 슬라이드를 탈수. </li><li> 공기는 상온에서 슬라이드를 건조. </li></ol> 4. 현장 하이브리드 화에 BAC 플러스 염색체 특정 Centromere 열거 프로브 (CEP) 또는 전체 염색체 페인트 용 프로브 칵테일의 작성 <ol><li> BAC / CEP 동시 하이브리드를 들어, 사전 하이브 리다이 제이션에 대한 두 개의 프로브 칵테일을 준비합니다. 우리는 적은 배경과 큰 신호 강도에 다른 stringencies 결과에 따라 개별적으로 BAC와 CEP 프로브를 사전 hybridizing 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 개인 Fosmids는 BAC 클론 대신에 또한 사용될 수 있다는 것을 발견했습니다. 아래에 설명 된 칵테일 제제는 단일 슬라이드의 볼륨을 나타냅니다. 동일한 프로브를 사용하여 여러 슬라이드를 처리하는 경우 단순히 볼륨 appropr을 증가<html> 취미가 생겼다. * BAC DNA 프로브 칵테일 : 11.5 μl 하이브 리다이 제이션 버퍼 (50 % 포름 아미드 (시그마) / 배 SSC / Dextran 황산 (시그마)) 2 μl DH 2 O DH 2 O의 2.5 μl BAC/Cot1 DNA (프로토콜 라벨은 아래를 참조) 15 μl 총 볼륨 * CEP 프로브 칵테일 : 7 μl CEP의 하이브 리다이 제이션 버퍼 (65 % Formamide/2x SSC / Dextran 황산) 2 μl DH 2 O 1 μl CEP/Cot1의 DNA (스펙트럼 Orange/Cy3/Texas 레드와 prelabeled 구입) 10 μl 총 볼륨 * 3시 2분 비율 25 μl / 슬라이드 및 혼합 프로브 칵테일에서 CEP 프로브와 함께 혼합 BAC 프로브를 denaturing 및 사전 하이브리드 (단계 5.1) 후. OR </li><li> 나누어지는 20 μl / 튜브에 전체 염색체 페인트 프로브 (Cy3/Texas 레드)의 슬라이드. 변성 및 사전 하이브 리다이 제이션 단계로 진행합니다. </li></ol>&quot;&gt; 5. 슬라이드와 프로브 변성 및 현장 하이브리드 화에 <ol><li> 75 변성 프로브 칵테일 (들) ° 10 분에 C. Cot1 DNA는 반복적 인 시퀀스에 잡종을 만들다하고 염색체를 metaphase하기 위해 후속 하이브리드을 방지 할 수 있도록 30 분에 37 ° C에서 프리 잡종을 만들다. </li><li> 3 분 72시 70% Formamide/2x SSC, pH를 7.0 ° C의 Coplin 병에서 변성 슬라이드. </li><li> 바로 3 분 각각에 대해 4에 Coplin 병에 EtOH 시리즈 (70 %, 90 % 및 100 %) ° C를 통해 슬라이드를 탈수. </li><li> 슬라이드가 실온에서 건조한 공기 할 수 있습니다. </li><li> 45 미리 따뜻한 슬라이드 ° C 프로브 사전 hybridzation (단계 5.1)의 마지막 10 분을위한 따뜻한 슬라이드. 필요한 경우 사전 hybridized 프로브 칵테일을 섞어서 각 슬라이드 25 UL를 추가, 부드럽게 고무 시멘트로 모든 가장자리를 따라 각 슬라이드과 인감에 coverslip를 놓습니다. 증발을 방지하기 위해 humidified 챔버에 37 ° C에서 하루 아침에 품다. </li></ol><ol><li> 3 분마다 38-40 ° C 50 % formamide/2x SSC, 산도 7.0에서 Coplin 병 3 회에 슬라이드를 씻으십시오. 세차의 온도는 프로브 사이에 다를 수 있습니다. 고 배경 하이브리드가있는 경우 귀하는 세차의 온도를 높일 수 있습니다. 신호가 희미한하고 더 배경이없는 경우 반대로, 다음이 세차의 온도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 워시는 상온에서 PN 버퍼 1 시간을 슬라이드 3 분을 위해, 그리고 BrdU 감지 단계로 진행합니다. </li></ol> 7. BrdU 검색 <ol><li> 어둠 속에서 실온에서 10 분 (200 μl / 슬라이드)에 대한 PNM 버퍼를 차단 슬라이드. </li><li> 종이 타월에 가장자리에 설정하여 슬라이드를 배수한다. 37 30 분에 PNM 버퍼에 방지 BrdU-FITC (50 μg / ML 로슈 또는 Millipore) 100 μl를 추가합니다 ° C. </li><li> 3 분마다 실온에서 PN 버퍼에 슬라이드에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 배수에 초과 PN 버퍼는 종이 타월에 에지 기능을 사용하면 한 번에 하나의를 슬라이드. 20 μl DAPI / antifade 장착 솔루션 (Invitrogen)를 추가합니다. 종이 타월로 슬라이드를 커버하고 기포 및 과도한 마운트 솔루션을 강제로 coverslip에 아래로 누르십시오. 이미지 분석을 수행합니다. </li></ol> 8. 이미지를 캡쳐하고 BrdU의 설립을 정량화 <ol><li> 이미지는 올림푸스 BX61 형광 현미경과 올림푸스 CCD 카메라, 100x 목표, 자동 필터 휠과 Cytovision 소프트웨어 (응용 이미징)을 캡처합니다. BrdU는 FITC 필터 사용하여 캡처되며 염색체 페인트를 (텍사스 빨강, Metasystems 또는 Cytocell), BAC의 (Cy3)와 CEP (Vysis 스펙트럼 오렌지) 프로브는 텍사스 레드, Cy3 필터를 사용하여 캡처되며, DAPI는 DAPI 필터 (참조로 캡처 도 2 및도 3). </li><li> 관심 개별 염색체는 BAC / CEP 또는 염색체 특정 페인트 프로브 (그림 2B와 3B)로 식별됩니다. 활용Cytovision 소프트웨어는 관심의 각 염색체는 전체 metaphase 확산에서 &quot;컷 아웃&quot;입니다, 라인은 긴 팔 (그림 2C와 3C)에 짧은 팔의 염색체의 길이를 따라 통해 그려집니다. Cytovision 소프트웨어는 각 염색체의 길이를 따라 픽셀 강도 프로필을 수량화하는 데 사용됩니다. Cytovision 소프트웨어는 픽셀가 차지하는 영역을 계산하고 각 절연 염색체에있는 BrdU 또는 DAPI 신호로 표시 픽셀의 강도를 단정 지을. 각 염색체로 표현 평균 픽셀 강도 그런 다음 픽셀 (표 1, 그림 4)의 총 수를 얻기 위해 해당 픽셀이 차지하는 영역을 곱한 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 염색체의 최신 복제 영역의 시각화 할 수 있습니다. 따라서, BrdU의 설립의 밴드 패턴은 염색체의 적극적 복제 영역의 검출이 가능하고, chromos 간의 복제 타이밍의 차이ome 쌍은이 구간 패턴 (도 2 및도 3)의 차이로 볼 수 있습니다. 마지막으로, 구속력이 패턴에 이러한 차이는 상동 염색체 또는 염색체 팔을 4 ~ 복제 타이밍 차이의 추정을 허용 각 염색체 6,7에 대해 알려진 복제 타이밍지도에 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 두 개의 염색체 6 3A는 염색체 6 4의 정상적인 복제 타이밍에 비해&gt; 2 시간의 패턴을 구간에서 차이를 표시 그림에 있어요. 또한, 여기에 설명 된 것과 유사한 절차를 성공적으로 비활성 및 활성 X 염색체 8,9 사이의 비동기 복제 타이밍 연구에 사용되었습니다. 운영 중 및 운영 중지 X 염색체는 X 염색체 페인트를 사용하여 확인 하였다. 이미지는 채우려 mFISH 소프트웨어 (Vysis)와 X 염색체에 의해 점령 픽셀의 수와 휘황 라 차지하는 픽셀 수를 사용하여 획득 한beled BrdU 그 다음 NIH 이미지 (사용하여 계산 된 <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html을</a> ). </li></ol> 9. 형광 라벨을위한 BAC DNA의 닉 번역 (Vysis) <ol><li> microfuge 관을 차게 다음 프로브 믹스를 추가합니다 : DH 2 O 70 μl (4 μg의 DNA) 10 μl 0.2 MM dUTP - 오렌지 나 그린 20 μl 0.1 MM dTTP 20 μl 10X 닉 번역 버퍼 40 μl NT dNTP의 (마이너스 dTTP) 40 μl 닉 번역 효소 200 μl 총 볼륨 @ 16 ° 길러 CO / N. 10 분 70시 가열에 의해 반응 ° C를 중지합니다. 5 분을 위해 얼음에 진정. </li><li> 프로브 믹스에 다음을 추가하여 에탄올로 DNA를 침전 : 200 μl 프로브 솔루션 48 μl 3 M NaOAc 160 μl Cot1DNA (0.25 μg / UL) 1200 μl 100 % EtOH </li><li> O / N. 10 분에 -80 ° C에서 저장 </li><li> i를 돌려N 20 분에 12,000 XG에서 추위. EtOH에서 가만히 따르다. 70 % EtOH로 한 시간을 씻으십시오. 이전처럼 봐. EtOH에서 가만히 따르다. 공기가 EtOH이 증발 할 때까지 건조 시키십시오. 100 NG / BAC DNA의 μl의 최종 농도 40 μl DH 2 O에 Resuspend. </li></ol>

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

염색체 확산의 준비는 여기에 설명 된 성공적인 복제 - 타이밍 분석을위한 중요한 단계입니다. hypotonic 치료 전에 colcemid 전처리 단계의 포함은 주파수와 mitotic 세포의 확산에 도움 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 수확하기 전에 1-3 시간에 colcemdi에 세포를 노출, 10 UG / ML의 최종 농도에 colcemid 사용합니다. 그러나, colcemid 전처리 단계의 포함은 G2의 길이를 변경할 수 있으며, 그 결과 염색체 3<...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 안티 BrdU-FITC </td><td> 로슈 Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 μg / μl </td></tr><tr><td> 닉 번역 키트 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 오렌지 dUTP </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 다름 </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP 하이브 리다이 제이션 버퍼 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP의 하이브 리다이 제이션 버퍼 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> 염색체 파이국세청 </td><td> MetaSystems 그룹 </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> 올림푸스 BX61 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 이미징 소프트웨어 시스템 </td><td> 응용 이미징 </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> 디지털 카메라 </td><td> 하늘 </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 현장 하이브 리다이 제이션 요리 IN 포름 아미드 솔루션 70% Formamide/2x SSC 35 ML 포름 아미드 * (시그마) 10 ML 10X SSC 5 ML D 2 H 2 0 HCL와 7.0 산도 (시그마) *이 -20 ° C.에 저장되어 그 포름 아미드를 사용하는 것이 중요합니다 장시간 실온 보관이 개미의 산성과 pH의 w를 생성합니다병 너무 낮. 50% Formamide/2x SSC 25 ML의 포름 아미드 (시그마) 10 ML 10X SSC 15 ML DH 2 O HCL와 7.0 산도 (시그마) 20x SSC, 4 L 702g NaCl (시그마) 358g 오세영 구연산 (시그마) 볼륨 DH 2 O PN 버퍼 [0.1 M NaP0 4 0.1 % NP_40 (시그마)] 0.1 M 솔루션 인산 나트륨의 각 (필터 소독, 500 ML의 aliquots에 저장)을 확인합니다. 0.1 M 아뇨 2 P0 4, L 13.8 g 아냐이 P0 4 (시그마) : 볼륨 DH 2 O 0.1 M 아뇨 2 P0 4 1 패 </str긴 사연&gt; 14.2 g 아냐이 P0 4 (시그마) 볼륨 DH 2 O. PN : 0.1 M 아뇨 2 P0 4 2 HP0 4 산도 8.0 NA 0.1 M의 pH를 조정합니다. 필터 살균 및 NP-40의 1 ML를 추가합니다. PNM 50 ML 1.25 g 비 지방 건조 우유 (시그마) 25 ML PN 버퍼 (위 레시피) 지속적으로 저어로 15-20 분 동안 섞는다. 10 분 400 XG에 2 번 봐. 표면에 뜨는 사용하여 유발 우유 단백질을 방해하지 않도록하십시오. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

포유류의 DNA 복제는 일시적 복제 프로그램에 따라, S 단계 동안 다른 시간에 염색체를 따라 여러 사이트에서 시작합니다. 복제 타이밍 사양은 epigenetic 수정에 대한 반응 조직 별 및 발달 신호에 의해 규제 동적 과정이라고 생각합니다. 그러나, 어디에서 DNA 복제가 염색체 함께 시작하면 규제 메커니즘을 제대로 이해 남아 있습니다. 상동 염색체는 보통 그러나이 규칙에 중요한 예외가 있습니다, 동기식 복제합니다. 예를 들어, 여성 포유류의 세포에 두 개의 X 염색체 중 하나는 X의 불 활성화 1로 알려진 과정을 통해 늦은 복제됩니다. 2-3 시간이 될 것으로 추정 복제 타이밍,이 지연과 함께 유전자의 대부분은 transcriptionally 한 X 염색체에 침묵된다. 또한, X의 불 활성화 센터로 알려진 이산 시스 - 연기의 궤적은, 일 포함하여이 X의 불 활성화 과정을 조절전체 비활성 X 염색체에 지연 복제 타이밍의 전자 유도. 또한, 암 세포와 세포에서 발견 특정 염색체 rearrangements는 전체 염색체에게 2,3에 영향을 미치는&gt; 3시간 그 복제 타이밍에 상당한 지연을 표시 이온화 방사선에 노출. 우리 연구실의 최근 작품은 이산의 중단 시스 - 행동의 전체 염색체 (4)에 영향을 미치는 매우 늦은 복제 표현형에 염색체 loci 결과를 나타냅니다. 추가 &#39;염색체 공학&#39;연구는 포유류의 염색체는 각 염색체의 적절한 복제 타이밍 5 제어 이산 시스 - 행동 loci가 포함되어 있다는 제안이 이상 복제 - 타이밍 표현형의 다양한 염색체 결과에 영향을 미치는 특정 염색체 rearrangements를 나타냅니다. 여기, 우리는 현장 하이브리드 화에 형광과 결합 염색체 복제 타이밍의 정량 분석​​하는 방법을 제시한다. 이방법은 동일한 세포 내에서 상동 염색체 간의 복제 타이밍의 직접 비교를 허용, 6에서 적응되었습니다. 또한,이 방법은 전체 염색체에 영향을 복제 타이밍의 변화와 연관 염색체 rearrangements의 모호 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 최근에 개발 된 높은 처리량 마이크로 어레이 이상 또는 재 배열 및 염색체를 취소 뜯어을 제시 상동 대립 유전자를 구별 할 수 없습니다 프로토콜을 시퀀싱 장점이 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 하나의 셀을 평가하기 때문에 또한, 그것은 인구의 셀의 일부만에 존재하는 염색체 rearrangements의 염색체 복제 타이밍의 변화를 감지 할 수 있습니다.

인간의 염색체 6의 복제 타이밍 분석의 예는 그림 2에 표시됩니다. 6q16.1에있는 ASAR6 유전자 4의 삭제를 포함하는 셀은 5 시간에 BrdU에 노출 mitotic 세포에 대한 수확 및 염색체 6 페인트 프로브 (Vysis)와 물고기와 BrdU의 설립에 대한 처리되었습니다. 두 6의 사이 BrdU 구간 패턴에 상당한 차이가 있습니다, 이는 이전에 염색체 6의 [표시 4 염색체 6 패턴을 구간 복제 타이밍에 ?...

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을 활용<em&gt; 현장에서</em&gt; 포유류의 염색체 복제 타이밍을 평가하는 하이브리드 (물고기). 이 기술은 동일한 세포 내에서 재 배열 및 취소 - 재 배열 염색체의 직접적인 비교를 할 수 있습니다.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

13.9K 조회수.  Oregon Health & Science University. 염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을 활용 현장에서 포유류의 염색체 복제 타이밍을 평가하는 하이브리드 (물고기). 이 기술은 동일한 세포 내에서 재 배열 및 취소 - 재 배열 염색체의 직접적인 비교를 할 수 있습니다.

비디오: Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

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Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...