We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. 조직의 해부 및 고정 (60 분) <ol><li> 초파리의 뇌를 들어, 1X PBS (인산염 완충 식염수)의 드롭 3 차 령 유충을 배치합니다. 적극적으로 혼잡하지 않은 유리 병 또는 병에서 크롤링 큰 3 차 령 유충을 선택합니다. <ol><li> 입 후크를 잡고 몸 (그림 1A, B)의 길이 아래로 2/3을 잡기 위해 다른 트위터 쌍을 잡기 위해 하나의 초 미세 트위터 쌍을 사용합니다. 애벌레 소화 기관의 뇌, 복부 신경절, 침샘과 일부를 노출 입 후크를 부드럽게 잡아 당깁니다. 뇌와 복부 신경 분리 핀셋을 사용하여 (그림 1A를, B) 플라스틱 페트리 접시에 1X PBT (트윈 (Tween)와 인산염 완충 식염수)의 드롭 릿에서 다른 조직과 장소에서. </li></ol></li><li> Nasonia의 고환 해부를 들어, 남성 3 일짜리 번데기 (붉은 눈 노란색 기관)을 선택합니다. 남성 Nasonia은 F에 비해 작은 날개 패드의 길이가번데기 (그림 1C) 동안 emales. <ol><li> 한 트위터 쌍, 다른 트위터 쌍을 사용와 흉부 지역 근처 복부의 상단에있는 번데기를 잡고, 복부의 가장 말단 팁을 잡고 눈물 방울 모양의 고환을 잡아 당깁니다 (그들은 지방에 둘러싸여됩니다 부드럽게 떨어져 흔들릴 수 있습니다 몸도 1D). 플라스틱 페트리 접시에 1X PBT의 물방울에 적절한 짓눌러과 장소를 방지 할 수 고환에서 어떤 외부 신체 부위를 분리합니다. </li></ol></li><li> 각 슬라이드를 들어, 네 다섯 조직 샘플 (예., 초파리 애벌레 두뇌 또는 Nasonia의 고환)의 총을 해부하다. 참고 : 5 개 이상의 샘플 과밀 핵 및 염색체로 이어질 것입니다. </li><li> 선택적으로, 유사 분열의 염색체 영역 실 염색질 (euchromatin) 자매 염색 분체의 일부를 분리하기 저장성 용액 조직을 치료하는 (5-10 0.5 % 구연산 나트륨의 하락 1X PBT로부터 뇌를 전송할10 개 이상) 분.하지 주 : 콜히친 (유사 분열 억제제) 중기 (11) 유사 분열의 수를 증가 시키는데 도움이 될 수있다. 부정적인 염색체 해상도에 영향을 줄 수 있기 때문에 매우 큰 건강한 유충 확산 및 형태, 사용하고, 원하지 않는 경우에도 그러나, 그것의 사용은 불필요하다. </li><li> 깨끗한 Sigmacote 처리 된 커버 슬립의 표면에 정착 용액 (45 % 초산 2.5 % 파라 포름 알데히드)의 방울 (~ 20 μL)을 놓습니다. 참고 : 사용의 매일 정착 솔루션은 신선한합니다. 45 % 아세트산에 1.8-3.7 % 파라 포름 알데히드에 이르기까지 정착액 솔루션은 물고기에 대한 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 면역 FISH이 프로토콜을 뇌 또는 고환이 아닌 다른 조직을 사용하여, 또는 적응하는 것은 다른 고정 제 실험이 필요할 수 있습니다 (다른 고정 제의 목록, 12 참조). </li><li> 조심스럽게 초 미세 핀셋, minimi으로 정착 방울로 해부 버퍼 (1X PBT)에서 각 조직 샘플을 전송정착액 솔루션으로 버퍼를 해부의 전송을 쌩쌩. 골고루 고정액 액적 내에 서로 이격되도록 조직 샘플을 위치. 실온에서 4 분 동안 고정 제의 조직을 배양한다. </li><li> 조심스럽게 아래 조직 및 커버 슬립 위에 폴리 라이신 코팅 슬라이드 얼굴을 배치합니다. 이 시점에서 아래로 눌러 대신 커버 슬립 슬라이드의 아래쪽에 붙어 있도록 두 가볍게 접촉하지 마십시오. 커버 슬립이 상단에 위치하도록 슬라이드 전환. </li><li> 필터 종이의 접힌 부분 내부 슬라이드 / 조직 / 커버 슬립을 샌드위치. 안정된 표면에 매우 단단히 똑바로 직접 커버 슬립 위의 위치 상 엄지 손가락, 프레스를 사용하여. (이 조직의 번짐의 원인이됩니다) 커버 슬립의 슬라이딩 측면 않도록주의해야합니다. </li><li> 액체 질소에 슬라이드 / 조직 / 커버 슬립 잠수함 (그림 1E, F에 장치 참조), 그리고 질소가 끓는 멈출 때까지 세우 (이상은 F입니다오프라인). 슬라이드를 제거하고 즉시 (면도날 고정 조직 긁히지 않도록) 위쪽으로 커버 슬립의 코너를 쓸어 넘겨 신선한 면도날로 커버 슬립을 떼어냅니다. <ol><li> 드라이 아이스의 블록에 슬라이드 / 조직 / 커버 슬립을 사전 냉각 전에 커버 균열에서 슬라이드를 예방하는 데 도움이됩니다 액체 질소에 침지에 1-2 분 동안, 최대 슬립. </li></ol></li><li> 즉시 실온에서 100 % 에탄올로 가득 코 플린 항아리에 조직과 슬라이드를 배치하고 (필요한 경우이 시간이 더 길어질 수 있습니다) 적어도 5 분간 방치 할 수 있습니다. 주 : 냉간 100 % 에탄올이 또한 사용될 수있다. </li><li> 조직과 슬라이드를 분리합니다 (고정 조직을 건드리지 않고) 킴과 초과 에탄올을 멀리 심지, 1 시간 동안 공기 건조에 슬라이드를 둡니다. <ol><li> 2 단계 또는 몇 주에 하이브리드를 수행하기 전에 몇 달을 위해 습도가 낮은 공기 또는 탈수 챔버 건조 슬라이드를 유지하기 위해 직접 진행합니다. </li></ol></li></ol> 그림 1 : (A) 3 차 령 초파리 유충 (오른쪽), 입 후크를 잡아 수있는 위치에 대한 지시 위치와는 (로 표시 *)과 뇌를 해부 유충을 끝까지 2/3; (왼쪽) 유생 헤드 내의 뇌의 상대 위치를 묘사 한 동일한 발달 단계 유충의 개략도. (B) 뇌와 3 차 령 초파리 유충 (오른쪽)이 개략적 해부 복부 신경절 조직 (왼쪽). 노란색 몸에 붉은 눈 단계에서 (C) 3 일 된 Nasonia 번데기. (D) 번데기를 잡아하는 방법을 나타내는 위치와 (오른쪽) 3 일 이전 Nasonia 남성 번데기 해부 고환 쌍 복부의 뒤쪽에 (* 표시) 몸에 중간에; (왼쪽) 개략적으로 묘사 남성과 여성이었다P는 번데기; 남성 번데기는 프로파일 지나서 연장 날개가 암컷 대조적 져널 프로파일 (흑색 화살표)를지나 연장하지 않는다 날개에 의해 구별 될 수있다; 고환 쌍의 상대적 위치는 남성 번데기에 표시됩니다. 액체 질소 용기에 슬라이드를 담가 사용 클립 및 (F) 방법 (E) 장치 - 문자열. 다중 클립 문자열은 여러 슬라이드를 동시에 침수 사용할 수 있습니다. 현장 하이브리드 2. (1 일 30 분, 오랫동안 1 시간 - 2.5 시간 프로브-에 하루 2) <ol><li> 1.1 하이브리드 버퍼의 20 μL 각 프로브 1 μL (100 NG)를 추가합니다. 피펫 프로브 / 고정 조직의 표면에 하이브리드 버퍼 (조직을 건드리지 않도록). </li><li> 조심스럽게 커버 슬립이 조직을 통해 직접 중앙에 있는지 확인하고, 프로브 / 하이브리드 버퍼에 직접 커버 슬립을 배치합니다. 버퍼는 토륨으로 마이그레이션해야합니다기포를 남기지 않고, 커버 슬립의 외연 전자. 참고 : 절차에 대한 문제를 제기하지 않는 조직을 접촉하지 않는 작은 거품을. 조심스럽게 슬라이드에 다시 떨어 조심스럽게 커버 슬립의 모서리를 들어 올려으로 큰 거품을 제거합니다. </li><li> 블록 (커버 쪽지를) 95 ° C로 예열의 표면에 슬라이드 / 조직 / 커버 슬립을 놓습니다. 노광을 방지하기 위해 알루미늄 포일의 큰 조각으로 덮을. 슬라이드를 5 분 동안 95 ° C에서 배양한다하자. 참고 : 튜브 구멍 전형적인 열 블록은 슬라이드 / 조직 / 커버 슬립을 배치 할 평면을 제공하기 위해 뒤집어 수 있습니다. </li><li> 이 터치에 따뜻한 때까지 약간 냉각시키는, 슬라이드를 제거합니다. 조심스럽게 그 아래에 액체를 밀봉하는 커버 슬립 씌워진 파라 필름 조각을 포장. </li><li> 습도 챔버 내부의 밀봉 된 슬라이드를 삽입하고 30 ° C로 예열 인큐베이터에 실을 배치합니다. 4 시간 하룻밤에 30 ° C에서 품어.<ol><li> 맨 아래에 배치 젖은 Kimwipes이나 종이 타월로 빈 팁 상자에서 습도 챔버 또는 리드 형 유리 섬유 복합 재질의 컨테이너를 만듭니다. 주 : DNA 단일 가닥 올리고 프로브는 45-47 ℃의 이론적 용융 온도 (Tm) 28-33 염기 달성 할 수 있도록 설계되었다. 선택된 길이와 T m 범위는 우리가 공부 반복적 인 시퀀스들이 AT 풍부하며, 따라서 매우 낮은 GC 함량을 갖는다는 사실을 반영한다. 긴 프로브 가능성이 높은 T의 m 값을 가질 것이다; 이 30 ° C의 표준 하이브리드 온도에서 높은 배경 하이브리드의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 혼성화 온도가 몇몇 문제가 최상의 결과를 달성하기 위해 요구 될 수있다. 점진적으로, 최고의 하이브리드 온도 증가 (또는 감소) 5 ° C로 온도를 찾을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 슬라이드에서 파라 필름을 제거하고 조심스럽게 천천히 한쪽 모서리를 들어 올려 커버 슬립을 제거합니다. 워싱턴15 분 0.1X SSC 버퍼의 각 세척 3 회 밀어 쉬. 빛의 노출을 최소화하기 위해 세척시 알루미늄 호일로 코 플린 항아리를 커버. </li><li> 긴 비오틴 프로브를 사용하지 않는 경우, 2.8 단계로 진행합니다. <ol><li> 긴 바이오틴 프로브를 사용하는 경우, 조직 자체를 만지지 않도록 조심하면서, 킴과 조직 주변을 건조. 조직을 통해 차단 솔루션의 100 μl를 놓고 트래핑 거품을 피하기 위해주의하면서 커버 슬립으로 조심스럽게 다룹니다. 30 분 동안 37 ° C에서 파​​라 필름과 커버 슬립과 장소를 통해 슬라이드를 감 쌉니다. </li><li> 조심스럽게 커버 슬립을 제거하고 킴과 조직 주위시킨다. 피펫은 로다 민 - 아비딘 1 희석 100 ㎕ : 조직을 통해 SBT 1,000 부드럽게 커버 슬립 커버, 돌보는 거품을 트래핑 방지 할 수 있습니다. 30 분 동안 37 ° C에서 파​​라 필름과 커버 슬립과 장소를 통해 슬라이드를 감 쌉니다. </li><li> 조심스럽게 커버 슬립을 제거하고 배 SSCT과 5 분 동안 슬라이드를 각각 3 회 세척0.1X의 SSC에서 5 분 각 3 회. 참고 : 슬라이드가 오랜 시간 세척 할 수있다. </li></ol></li><li> 슬라이드를 제거하고 (조직에 닿지 않도록)를 초과하는 버퍼를 제거하는 건조 킴과 조직 주위시킨다. 10-15 분 동안 또는 수분이 완전히 소산까지 어두운 곳에 슬라이드 조직 쪽을 놓는다. </li><li> Vectashield 장착 매체의 피펫 11 μL ( &#39;4, 6 diamidino -2- 페닐 인돌 - DAPI) 조직 상. 조심스럽게 직접 장착 매체 및 조직의 중심을 통해 (안 Sigmacote 처리) 깨끗한 커버 슬립을 배치합니다. 장착 매체 커버 슬립의 가장자리를 향해 외측으로 천천히 이동한다. 주 : 장착 매체 사방 커버 슬립의 가장자리에 도달하지 못한 경우, 실장 매체의 추가적인 1-2 μL가 필요한 볼륨 채울 커버 슬립의 가장자리에 하나 위치에 적용될 수있다. 이 경우, 이전 슬라이드 표면에서 초과 매체를 닦아주십시오밀봉. </li><li> 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 조직 샘플을 통해 매니큐어를 칠 마십시오. </li><li> 어두운 곳에서 수직 슬라이드를 삽입하고 완전히 하드 (일반적으로 30 분 이상)까지 매니큐어 건조를 할 수 있습니다. 이 시점에서, 이미지 나중에 이미징을위한 최대 1 주일 -20 ° C에서 조직 또는 저장. </li></ol> 버퍼 / 솔루션 조리법 10 배 PBS <ul><li> 80g의 NaCl </li><li> 2.0 g의 KCl </li><li> 14.4 g 나 2 HPO 4 </li><li> 2.4 g의 KH 2 PO 4 </li><li> pH 7.4까지, H 2 O 1 L </li></ul> 1X PBT <ul><li> 5 ml의 10 배 PBS </li><li> 45 ML의 H 2 O </li><li> 0.1 % 트윈 20 </li></ul> 20 배 SSC <ul><li> 175.3 g의 NaCl </li><li> 88.2 g 나 구연산 </li><li> 800 ML의 H 2 O에 </li><li> pH7로, H 2 O 1 L </li></ul> 배 SSCT <ul><li> 200 ml의 20 배 SSC </li><li> 799 ML의 H 2 </서브&gt; O </li><li> 0.1 % 트윈 20 </li></ul> 0.1X SSC <ul><li> 5 ml의 20 배 SSC </li><li> 995 ML의 H 2 O </li></ul> 하이브리드 믹스 (20 μl의 11에서 수정) <ul><li> 10 μL 포름 아미드 </li><li> 4 ㎕의 50 % 덱스 트란 설페이트 </li><li> 2 μL 20 배 SSC </li><li> 4 μL의 H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 mL) 중 <ul><li> 2 ml의 20 배 SSC </li><li> 0.01 g 소 혈청 알부민 (BSA) </li><li> 10 μL 트윈 20 </li><li> 7.9 ML의 H 2 O </li></ul> 블로킹 용액 (8) (10 mL) 중 <ul><li> 0.3 g의 BSA </li><li> 10 μL 트윈 20 </li><li> 2 ml의 20 배 SSC </li><li> 8 ML의 H 2 O </li></ul> 파라 포름 알데히드 고정액 용액 (1 mL) 중 <ul><li> 2 O (시 물을 추가) 393.75 μL의 H </li><li> 450 μL의 빙초산 </li><li> 156.25 μL 16 % 파라 포름 알데히드 </li></ul>

<ol>
	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. 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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISH 자주 염색체 특정 시퀀스를 매핑하는 데 사용된다. 우리는 높은 사본 번호, 염색질 시퀀스에 최적화 된 DNA ISH을위한 간단한 방법을 설명 하였다. 오히려 기존의 DNA의 ISH 프로토콜의 요구 사항 인 포름 아미드 용액에 세척을 사용하는 것보다, 우리는 DNA를 변성 직접 미리 가열 블록에 조직에 장착 된 슬라이드를 배치합니다. 이 방법은 많은 양의 포름 아미드의 사용을 회피. 선명 혼성화 신호?...

현장 하이브리드 (DNA ISH)에서 DNA는 특정 염색체 영역에 매핑 시퀀스 일반적으로 사용되는 방법이다. euchromatin 내에서 단일 복사본 지역으로 프로브의 다양한 통해 닉 번역 또는 긴 DNA 제품 1, 2의 최종 라벨링 및 deoxygenin (DIG)의 통합을 포함하여 접근, -attached 뉴클레오티드과 인식의 소수를 생성 할 수 있습니다 그룹 결합 항체 1-3. 몇 또는 단일 복사본 수의 실 염색질 (euchromatin) 시퀀스의 시각화가 높은 특정 활동 또는 집합 신호를 향상 작은 여러 개의 프로브의 칵테일 하나의 큰 프로브 중 하나를 사용해야합니다. 그들은 일반적으로 수십 블록으로 알려진 단일 염색체 영역에서 클러스터 반복 수천로서 존재하기 때문에 대조적으로, 위성과 같은 이질 염색질의 DNA에서 발견되는 높은 서열이 반복은, DNA ISH 쉬워 표적이다. 전이 될 또한이 될 수 있습니다별개의 염색체 유전자좌 2에서 높은 사본 번호로 발견했다. 이 경우, 낮은 특정 활동과 단일 프로브 효과적으로 인해 여러 사이트에서 자신의 하이브리드에 염색질 시퀀스에 레이블을 지정할 수 있습니다. 반복적 서열 프로브 상업적 짧은 올리고 뉴클레오티드 (30-50 BP)을 화학적으로 합성하여 여러 가지 형광 그룹 중 하나와 결합 될 수있다. 게놈 시퀀싱 기술을 사용하여 이질 염색질 내에서 반복적 인 시퀀스를 매핑 인해 매우 반복적 인 위성 블록 4-6,7 내 건물 비계에서 발생하는 문제로 어렵다. 현재, ISH는 서브 염색체 수준에서 이러한 시퀀스를 맵핑하는 가장 효과적인 방법으로 서있다. 이 전략은 지속적인 유전체 및 전 사체 염기 서열 연구에 의해 발견되는 반복적 인 시퀀스의 큰 숫자를 매핑하는 것이 중요하다. 슬라이드에 장착 된 염색체에 매핑 반복적 인 시퀀스의 효율성과 편의성은 GRE 될 것이다atly DNA ISH에 대한 단순화 된 프로토콜에 의해 강화. 예를 들어, DNA ISH 기존 프로토콜 따라서 매핑 시퀀스에 필요한 시간을 실질적으로 첨가하고이 비싼 시약 화학 폐기물의 대량 생산, 2,8- 포름 아미드 용액에서 하이브리드 화의 다수의 조직 세척을 포함한다. 여기에서 우리는 포름 아미드 세척의 필요성을 우회하고 기본적인 실험실 장비 및 시약을 이용하여 수정 된 DNA ISH 방법을 설명합니다. 이 방법은 원래의 형광 염료와 접합 된 상업적으로 합성 된 올리고를 사용하여 초파리 유충 neuroblasts 염색질의 영역에서 고도로 반복적 인 DNA 서열의 빠른 매핑을 위해 설계되었다. 그러나,이 방법은 또한, 다른 수단을 통해 복수 9,10 상이한 조직 유형 염색체 및 합성 걸쳐 큰 프로브를 사용하여 반복적 인 시퀀스를 매핑하기 위해 작동한다. 또한,이 방법은 더 길거나 multip 사용하여 실 염색질 (euchromatin) 시퀀스를 매핑하는데 사용될 수있다르 관심 실 염색질 (euchromatin) 시퀀스 내 짧은 프로브.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

현장 하이브리드 (DNA ISH)에서 DNA는 특정 염색체 영역에 매핑 시퀀스 일반적으로 사용되는 방법이다. 이 방법은 계산 방법이 엄청난 도전에 직면 염색질 영역에 매핑 매우 반복적 인 시퀀스에서 특히 효과적이다. 여기에서 우리는 다른 DNA ISH 프로토콜의 표준 단계입니다 포름 아미드 세척을 우회 DNA ISH에 대한 간소화 된 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 효과적으로 다른 곤충 조직 유형의 개수에 걸쳐 염색질 염색체 영역 내의 반​​복적 인 DNA 서열을 표시 형광 염료를 수행 짧은 단일 가닥 DNA 프로브와 혼성화를 위해 최적화된다. 그러나, 애플리케이션은 큰 프로브 및 단일 카피 (비 반복) DNA 서열의 시각화와 함께 사용하기 위해 확장 될 수있다. 우리는 신경 세포와 Nasonia을 melanogaster의 초파리에서 숙청 염색체에 여러 가지 반복적 인 시퀀스를 매핑하여이 방법을 보여vitripennis 정모 세포. 우리는 모두 작은, 상업적으로 합성 프로브 및 비교를위한 더 큰 프로브 하이브리드 패턴을 보여줍니다. 이 절차는 간단한 실험실 소모품 및 시약을 사용하고, DNA ISH을 수행하는 작은 경험이 연구자에 이상적입니다.

여러 조직에서 염색체, (그림 2B PCR 제품의 닉 번역을 통해 만든)이 방법을 설명하기 위해, 우리는 화학적으로 형광 복합체 (그림 2)와 이상 바이오틴 프로브 수정 된 작은 상업적으로 합성 올리고 세트를 교배 타입 (표 1 참조). 대상 시퀀스 D.에서 유사 분열 염색체의 pericentromeric (염색질) 지역에 위치한 위성 반복을 포함 번데기 N.에서 애벌레 neuro...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

17.9K 조회수.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

연구

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

전체 산<em&gt; 현장에서</em복족류 연체 동물 용&gt; 하이브리드 방법<em&gt; Lymnaea의 stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...