이 프로토콜은 DamID 시퀀싱을 사용하는 대신 뉴클레오스켈레톤에 대한 부착을 평가하는 데 사용할 수 있으며 단일 세포 분석입니다. 이 방법을 사용하는 주요 이점은 비용 효율적이고 쉽게 액세스할 수 있다는 것입니다. 다른 시각화 기술에서는 일반적으로 발생하지 않을 수 있는 유전자와 염색체 간의 기능적 차이를 강조할 수 있습니다.
치료된 암 및 조로증 세포의 게놈 내 공간 및 기능적 조직과 노화 세포의 게놈 행동 차이는 이 프로토콜을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 방법은 수명 및 모든 질병에 걸쳐 모든 세포 또는 조직 유형에 적용할 수 있습니다. 프로브를 사용할 수 있는 모델 유기체에서도 사용할 수 있습니다.
시작하려면 500 밀리리터의 10 % 염산을 준비하고 큰 비커에 붓습니다. 현미경 슬라이드를 산에 개별적으로 떨어뜨리고 비커에서 산을 2G.Decant로 설정한 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 배양하고 슬라이드를 수돗물로 10회 세척합니다. 그런 다음 탈이온수에서 10회 더 가한다.
슬라이드를 메탄올로 두 번 헹구고 멸균 될 때까지 메탄올에 보관하십시오. 슬라이드를 종이 타월에 올려 건조시키고 호일로 싸서 오토클레이브나 뜨거운 오븐에서 살균합니다. 섭씨 37도에서 최소 48시간 동안 혈청과 5% 이산화탄소로 60-70% 밀도에 도달할 때까지 적절한 배지에서 세포를 성장시킵니다.
각 세포 유형을 수확하고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 슬라이드 당 10 밀리리터의 배지에서 5 개의 세포를 1 회 10 회 시드합니다. 슬라이드 및 부착된 세포가 들어 있는 배양 접시를 인큐베이터로부터 제거한다.
매체를 버리고 연필을 사용하여 슬라이드에 레이블을 지정합니다. 그런 다음 50 밀리리터의 얼음처럼 차가운 세포 골격 완충액이 들어있는 코플린 병에 넣으십시오. 항아리를 얼음 위에서 또는 섭씨 4도에서 15 분 동안 배양하십시오.
세포골격 완충액을 버리고 슬라이드를 완충액이 있는 코플린 병에 담궈 50밀리리터의 일회용 DNA 후광 완충액으로 빠르게 3회 헹굽니다. 슬라이드를 50 밀리리터의 추출 완충액이 들어 있는 코플린 용기로 옮기고 실온에서 4분 동안 인큐베이션한다. 그 후 슬라이드를 50 밀리리터에서 각각 1분 동안 10회, 5회, 2회, 및 1회 DNA 후광 완충액으로 연속적으로 배양한다.
완료되면 슬라이드를 10, 30, 70 및 95% 에탄올의 순차적인 에탄올 시리즈에 담급니다. 슬라이드를 70, 90 및 100 % 에탄올의 순차적 인 50 밀리리터 에탄올 시리즈를 각각 5 분 동안 통과시킵니다. 보온 접시에 공기 건조하십시오.
그런 다음 섭씨 70도 오븐에서 5 분 동안 굽습니다. 슬라이드를 섭씨 70도에서 2분 동안 70% 포름아미드 2배 SSC 용액에 넣어 변성시킵니다. 변성 슬라이드를 50 밀리리터의 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올에 5 분 동안 놓습니다.
그런 다음 실온에서 각각 5분 동안 90, 95 및 100%의 에탄올 시리즈를 통해 이동합니다. 완료되면 보온 플레이트에서 슬라이드를 자연 건조시킵니다. DNA 프로브를 섭씨 75도에서 뜨거운 블록 또는 수조에서 10분 동안 변성시킵니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후 10마이크로리터를 적절한 슬라이드에 피펫팅합니다. 프로브를 21 x 21mm 커버슬립으로 덮고 고무 시멘트로 밀봉합니다. 가습된 하이브리드화 챔버에서 섭씨 37도에서 최소 18시간 동안 슬라이드를 배양합니다.
배양 후 집게로 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 섭씨 45도로 예열된 pH 7에서 50% 포름아미드 2배 SSC 용액 50밀리리터에서 슬라이드를 3회 5분 배양합니다. 다음으로, 섭씨 60도까지 예열되었지만 섭씨 45도의 수조에 넣은 SSC 용액의 0.1배 50밀리리터에 슬라이드를 놓습니다.
5분 동안 배양하고 5분 배양을 위해 완충액을 두 번 교체합니다. 슬라이드를 실온에서 4배 SSC 용액 50밀리리터가 들어 있는 코플린 병에 넣고 완충액을 3번 교체하면서 15분 동안 배양합니다. 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 100 마이크로 리터의 4 % BSA 4 배 SSC 용액을 각 슬라이드에 적용하고 파라핀 필름으로 오버레이합니다.
실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 그 후 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 200에 희석된 100 마이크로리터의 스트렙타비딘 Cy3와 함께 배양하여 표지된 프로브를 검출하였다. 슬라이드를 실온에서 4배 SSC 용액 50밀리리터가 들어 있는 코플린 병에 넣고 완충액을 3번 교체하면서 15분 동안 배양합니다.
DAPI가 포함된 20마이크로리터의 마운팅 솔루션에 슬라이드를 장착하고 22 x 50mm 커버슬립으로 오버레이합니다. 100X 오일 대물렌즈가 있는 에피형광 현미경을 사용하여 DNA 후광과 염색체 영역을 시각화합니다. DNA 후광 준비를 통해 잔류 핵의 가장자리, 잔류 핵 내에 남아 있는 DNA, 주변 영역으로 스풀링된 부착되지 않은 DNA를 볼 수 있습니다.
증식하는 인간 진피 섬유아세포의 DNA 후광은 BRDU가 통합된 세포에서 생성되었으며 이후 항-BRDU 항체로 염색되었습니다. 증식 세포는 BRDU 및 항-pKi-67에 대해 양성이었다. 이 프로토콜은 DNA 후광 내에서 염색체 영역을 시각화하는 데 사용되었습니다.
개별 염색체는 염색체 1, 13, 17 및 18에 대한 특정 전체 팔 염색체 페인팅 프로브로 표지되었습니다. 항-pKi-67은 동일한 배양 내에서 증식하는 세포와 그 부재를 표시하는 데 사용되었습니다. 녹색의 텔로미어를 가진 DNA 후광 준비가 여기에 표시됩니다.
DNA 후광에서 텔로미어의 비율, 특히 실험 2 이미지에서 관찰 할 수 있습니다. 텔로미어의 평균 비율은 정지 세포에서 약 17%였습니다. 염색체 부착의 차이는 1 차 대조 섬유 아세포와 전형적이고 비정형적인 허친슨-길 포드 (Hutchinson-Gilford) 프로 게 리아 증후군을 가진 병든 세포에서 발견되었으며, 다른 Sun1 이소 형을 발현하고 라민 A 돌연변이는 없다.
1번 염색체와 13번 염색체는 제어된 DNA 후광과 비교할 때 잔류 핵 내에서 부착에 통계적으로 유의미한 차이를 보입니다. 전체 염색체 영역의 위치는 잔류 핵 및 DNA 후광과 상관 관계가 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 세포가 올바른 밀도로 시드되고 적시에 추출되는지 확인하십시오.
이 절차에 따라 간접 면역형광 및 RNA FISH를 수행할 수 있습니다.
