The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.

1. 여성 배아 줄기 세포의 분화 유도 X 염색체의 불 활성화를 유도하기 위해 참고 : 여성 마우스 배아 줄기 세포 (요청시 제공)을 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)로 코팅 된 호화 배양 접시에 표준 ES 세포 조건에서 재배하고 있습니다. 우리는 여기에서 독자가 표준 세포 배양 기술에 39-41을 잘 알고 있다고 가정합니다. 분화를 유도하기 위하여, T25 접시에서 성장 ES 세포는 MEFs에서 분리되고, 분화 배지에서 도금 될 것이다. <ol><li> ES 세포 배양에서 ES 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. </li><li> 1.5 ML 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (37 ° C에서 미리 예열) 추가하고 7 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 5 분 후, 식민지를 깨고 부드럽게 요리를 흔들. </li><li> 세포 분화 배지 3.5 ㎖를 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화. 피펫 세포 상하 단일 세포 용액을 수득하고, 수집15 ML 튜브에. 200 XG에 5 분 동안 회전, 분화 매체의 10 ML에있는 세포를 수집합니다. </li><li> 비 젤라틴 화 배양 접시에 세포 현탁액을 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : ES 세포 현탁액에 남아 반면 MEFs는, 비 젤라틴 화 배양 접시에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 한편, 6 - 웰 플레이트에 멸균 유리 커버 슬립 (24 X 24mm)를 추가 0.2 % 젤라틴을 추가하고, 상온에서 최소 5 분 동안 품어. </li><li> 1 시간 후, 주로 비 접착 ES 세포로 구성되는, 사전 도금 ES 세포 배양의 상층 액을 수집합니다. 커버 슬립을 포함 6 - 웰 플레이트에 플레이트 ES 세포. 참고 : 사용 ⅙ 6 잘 플레이트의 6 우물 합류 T25 접시의 일. 이 잘 분화의 3 일 후에 합류 차별화 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 차별화 시간 코스, 세균 요리에 차별화 매체 접시 사전 도금 ES 세포와 incub에 대한세포 배양 인큐베이터에 통합 된 세포의 진탕 먹었다. 이 세포는 1-2 일 전에 고정으로 커버 슬립으로 도금 될 수 배아 체를 형성하도록 허용 할 것이다. </li></ol> 이후 DNA-RNA의 FISH 분석을위한 차별화 된 ES 세포의 2. 고정 <ol><li> 차별 문화에서 차별화 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. 참고 : 세포가 씻겨지지 않도록 조심스럽게 PBS를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 PBS를 제거하고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / PBS를 첨가하여 세포를 고정하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. 주의 : PFA는 독성과 흡입하거나 피부 나 눈에 접촉 될 때 중요한 건강 위험을 일으킬 수 있습니다. 또한, PFA는 발암 물질이다. </li><li> 4 % PFA / PBS를 제거하고 70 % 에탄올로 커버 슬립 배 씻는다. 주 : PFA의 흔적 후속 FISH 단계에 방해가되므로 올바른 세척이 중요합니다. 커버 슬립 전에 F에 몇 개월 -20 ° C에서 70 % 에탄올에 저장 될 수있다ISH 분석. </li></ol> FISH 실험에 대한 DNA 프로브의 3. 레이블 참고 : 관심의 유전자 (최소 길이&gt; RNA FISH, 또는&gt; DNA의 물고기를 20킬로바이트 2 KB), 또는 관심있는 유전자를 포함하는 BAC의 DNA 조각을 얻습니다. 대부분의 전사가 동시에 검출 할 수있는 여러 사본에 원인이되므로 RNA 검출을 위해, 작은 프로브, DNA 검출에 비해 충분히 할 수 있습니다. 단일 복사본 DNA 가닥의 강한 신호에 대해서, 더 긴 프로브 혼입 합텐의 충분한 수를 검출 할 수 있도록 요구된다. 바람직하게, 비 - 전사 된 게놈 영역은 DNA 프로브를 설계를 위해 선택된다. RNA를 검출하기 위하여 더 작은 프로브를 사용할 때, 이는이 완전히 배제 할 수는 없지만 RNA가 전사되는 게놈 로커스 결합 DNA-RNA의 FISH 방법으로 검출되는 것을 방지 할 것이다. 마우스 XIST을 검출하기 위해, 5.5 킬로바이트 된 cDNA 프로브를 사용 하였다. DET에 대한X 염색체의 ection 여러 BAC 프로브가 사용될 수있다. 좋은 결과는 XIST의 현장 가까이에있는 BAC RP23-100E1 및 BAC CT7-474E4의 혼합물로 얻어졌다. 관심의 유전자 또는 염색체에 따라 여러 가지 프로브는 최적의 결과를 얻기 위해 필요할 수 있습니다. , RNA-FISH에 사용되는 재료로 작업 깨끗한 환경에서 살균 필터 팁, 이는 RNAse 무료로 H 2 O 및 작업을 사용할 때마다. <ol><li> DNA 1 μg을 16 μL의 총 부피에 H 2 O에서 희석. 4 제닌 ㎕의 또는 비오틴 라벨링 솔루션 (시약 참조) 추가 소용돌이로 교반하여 혼합하고 90 분 동안 16 ° C에서 알을 품다. 참고 : 비타민 B 복합체 또는 제닌 표지 뉴클레오티드 지금 흠 번역에 의해 통합됩니다. </li><li> 한편, 비 통합 세포핵을 제거하기 위해 G50의 열을 준비합니다. , 2 ML의 주사기를 타고 스탬퍼을 제거하고 주사기로 멸균면을 추가합니다. 솔루션 t에서 G50 공 추가O 1 분 642 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 주사기를 배치, 주사기를 채우십시오. 참고 : 주사기의 약 80 %가 현재 G50로 가득해야합니다. 이하 G50이 존재하는 경우 반복합니다. </li><li> 90 분 후, 닉 - 번역 반응 혼합물을 H 2 O의 40 μL를 추가 한 G50 컬럼에 반응을 추가한다. 열에서 빈 튜브를 추가하고 2 분 642 XG에 원심 분리기. 반응 튜브를 통하여 흐름을 수집한다. </li><li> 펫을 통해 흐름의 양을 측정하고, 200 μL의 총 볼륨에 도달하는 H 2 O를 추가합니다. 13.3 μL 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖), 13.3 μL 효모의 tRNA (10 ㎎ / ㎖), 26.7 μL 마우스 침대-1 DNA (1 ㎎ / ㎖) 28 ㎕의 2 M NaAc, 산도를 추가를 통해 흐름을 침전 5.6. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 533 ㎕의 얼음에게 차가운 100 % 에탄올을 추가합니다. 4 ℃에서 30 분 동안 16,200 XG에서 튜브와 원심 분리기를 흔들어 </li><li> 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올로 두 번 펠릿 씻는다. 5 분에 대한 16,200 XG에 원심 분리기4 ° C, 공기 펠렛을 건조. 50 + 하이브리드 솔루션의 50 μl를 추가하고 용해를 촉진하기 위해 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 레이블이 프로브는 -20 ℃에서 몇 년 동안 저장 될 수있다 주의 : 50 + 하이브리드 솔루션, 독성, 피부, 눈과 호흡기에 자극을 줄 수 있으며, 또한 기형이다 포름 아미드가 포함되어 있습니다. </li></ol> 4. Permeabilization, 결합 DNA-RNA 물고기를 고정 세포의 전처리 및 하이브리드 <ol><li> 70 % 에탄올 및 10 - 웰 플레이트에 세포 배양 PBS의 첨가를 제거하여, 커버 슬립에 고정 된 세포를 재수. 5 분 동안 품어. 총 세 번 반복합니다. </li><li> 세포 배양 PBS를 제거하고 세포를 투과하는, 6 - 웰 플레이트에 0.2 %의 펩신을 추가합니다. 4 분 동안 37 ° C에서의 물을 욕조에 6 - 웰 플레이트를 품어. 펩신을 제거하고, 이는 RNAse 무료로 H 2 O와 비활성화 </li><li> 실온에서 5 분 동안 4 % PFA / PBS와 함께 배양하여 사후 수정 세포. fixati 후에, 5 분 동안 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. </li><li> 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올로 배양하여 세포를 탈수. 전송 6 - 웰 플레이트 밖으로 커버 슬립, 그리고 몇 분 동안 공기 건조 커버 슬립. </li><li> 열 접시에 1 시간 동안 65 ° C에서의 coverslips을 배양하여 나이 세포. </li><li> 분석 할 수있는 모든 coverslip을 함께 추가하여 마우스 침대-1 DNA와 FISH 프로브를 사전 하이브리드, 50 + 하이브리드 솔루션, 0.5 ㎕의 마우스 침대-1 DNA, 비오틴 표지 XIST 프로브의 1 μL와 제닌의 1 μL의 25 μL X 염색체를 검출하는 표시 BAC 프로브. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 5 분 동안 99 ℃에서 변성. 침대-1 DNA가 프로브에 존재하는 순서를 반복 교배 할 수 있도록 45 분 동안 37 ° C에서 즉시 품어. </li><li> 노화 후, 유리 슬라이드에 (SSC/10 MM의 인산 완충 formamide/2x 70 %로 구성) 변성 버퍼의 50 μl를 발견하고, 세포가 towar을 향 상단에 커버 슬립을 넣어변성 버퍼 DS. 2 분 동안 65 ° C에서 알을 품다. </li><li> 5 분 동안 얼음 차가운 70 % 에탄올에 배양하여 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립, 사후 수정 세포를 추가합니다. </li><li> 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜. </li><li> 유리 슬라이드에 사전 하이브리드 프로브를 발견하고, 상단에 커버 슬립을 배양한다. 장소 SSC formamide/2x 50 ㎖의 50 %로 가득 찬 가습 실에서 슬라이드 및 37 ℃에서 하룻밤 배양 </li></ol> 5. 후 하이브리드 세척 및 검사의 항체 매개 검출 <ol><li> 2X SSC와 6 - 웰 플레이트를 입력하고 미리 따뜻한 42 ° C.까지 하룻밤 배양 한 후 커버 슬립을 추가하고 5 분 동안 42 ° C에서 알을 품다. </li><li> 2X SSC를 제거하고, 42 ℃에서 10 분 동안 50 % formamide/2x SSC와 커버 슬립을 품다 총 3 회 (모두 씻어 30 분)에 반복합니다. </li&gt; <li> SSC formamide/2x 50 %를 제거하고 실온에서 2 × 5 분 트리스 - 식염수 사이 (TST)와 함께 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 스팟 50 ㎕의 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 트리스 - 생리 식염수 BSA (TSBSA), 그리고 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 차단하는 거꾸로의 coverslips을 품어. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 양 - 안티 발굴 항체 (TSBSA에서 1:500)의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 첫 번째 배양 단계의 coverslips을 품어 거꾸로. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 토끼 반대로 양의 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 제 2 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . </li><li> 트랜스FER 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 토끼 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 세 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 마우스 항 비오틴 항체의 μL (TSBSA에서 1:200), 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 네 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 배양한다. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 당나귀 - 항 - 마우스 항체의 μL, 거꾸로 TST-가습 어두운 chamb 실온에서 30 분 동안 다섯 번째 배양 단계의 coverslips을 품어어. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 말 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 여섯 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . 참고 : 염소 안티 - 말 항체는 당나귀 - 항 - 마우스 항체를 인식합니다; 시 연구원에게 제공, 염소 항 당나귀 항체는 잘 작동합니다. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. 트리스 - 식염수 (TS)과 추가 5 분을 씻으십시오. </li><li> 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜. </li><li> 유리 슬라이드에 DAPI와 매체를 장착 한 방울 (시약 참조) 스팟, 거꾸로 상단에 커버 슬립을 추가합니다. 손톱 광택과 함께 슬라이드를 밀봉하고형광 현미경으로 FISH 결과를 평가한다 (그림 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Rudkin, G. T., Stollar, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+detection+of+DNA-RNA+hybrids+in+situ+by+indirect+immunofluorescence.">High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence.</a> Nature. 265, 472-473 (1977).</li><li>Imataka, G., Arisaka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+analysis+using+spectral+karyotyping+(SKY).">Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY).</a> Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).</li><li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders.">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li><li>Mastenbroek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+RCTs.">Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs.</a> Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).</li><li>Martins-Taylor, K., Xu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Genomic+stability+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 22-27 (2012).</li><li>Rens, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+evolution+of+the+duck-billed+platypus+karyotype+with+an+X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5+male+sex+chromosome+constitution.">Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).</li><li>Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+gene+expression+noise+to+understand+gene+regulation.">Using gene expression noise to understand gene regulation.</a> Science. 336, 183-187 (2012).</li><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog.">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Rep. 46, 65-72 (2013).</li><li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+of+C.+elegans+worms+and+embryos.">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li><li>Femino, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+detection+of+molecular+hybrids+between+RNA+and+DNA+in+tissue+sections.">Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections.</a> Nature. 225, 946-948 (1970).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations.">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).</li><li>John, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-DNA+hybrids+at+the+cytological+level.">RNA-DNA hybrids at the cytological level.</a> Nature. 223, 582-587 (1969).</li><li>Bauman, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Wiegant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+with+fluoresceinated+DNA.">In situ hybridization with fluoresceinated DNA.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).</li><li>Langer, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+biotin-labeled+polynucleotides:+novel+nucleic+acid+affinity+probes.">Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).</li><li>Manuelidis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+satellite+DNA+using+biotin-labeled+DNA+probes.">High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes.</a> J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).</li><li>Kislauskis, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+3'-untranslated+sequences+sort+alpha-cardiac+and+beta-cytoplasmic+actin+messenger+RNAs+to+different+cytoplasmic+compartments.">Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments.</a> J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Corput, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+using+horseradish+peroxidase-labeled+oligodeoxynucleotides+and+tyramide+signal+amplification+for+sensitive+DNA+and+mRNA+detection.">Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection.</a> Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).</li><li>Jonkers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF12+is+an+X-Encoded+dose-dependent+activator+of+X+chromosome+inactivation.">RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation.</a> Cell. 139, 999-101 (2009).</li><li>Barakat, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF12+activates+Xist+and+is+essential+for+X+chromosome+inactivation.">RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li><li>Gontan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF12+initiates+X-chromosome+inactivation+by+targeting+REX1+for+degradation.">RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation.</a> Nature. 485, 386-390 (2012).</li><li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+action+in+the+X-chromosome+of+the+mouse+(Mus+musculus+L).">Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L).</a> Nature. 190, 372-373 (1961).</li><li>Barakat, T. S., Gribnau, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=chromosome+inactivation+in+the+cycle+of+life.">chromosome inactivation in the cycle of life.</a> Development. 139, 2085-2089 (2012).</li><li>Augui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).</li><li>Brown, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+from+the+region+of+the+human+X+inactivation+centre+is+expressed+exclusively+from+the+inactive+X+chromosome.">A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome.</a> Nature. 349, 38-44 (1991).</li><li>Brockdorff, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+position+and+exclusive+expression+of+mouse+Xist+from+the+inactive+X+chromosome.">Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 329-331 (1991).</li><li>Borsani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+murine+gene+expressed+from+the+inactive+X+chromosome.">Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 325-329 (1991).</li><li>Barakat, T. S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+inactivation+and+embryonic+stem+cells.">X chromosome inactivation and embryonic stem cells.</a> Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development.">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li><li>Gribnau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+choice+occurs+independently+of+asynchronous+replication+timing.">X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing.</a> J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA,+DNA,+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence.">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li><li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center.">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells.">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li><li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture.">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

DNA FISH에 적합한 조건이 안정적 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 될 수있는 결합 된 DNA-RNA FISH는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여러 가지 방법은 DNA와 RNA를 모두 검출 프로브와 동시 배양의 필요성을 우회 동일한 셀의 DNA 및 RNA 모두를 연구에 적용되어왔다. 예를 들어, 중첩 방식으로, 첫 번째 RNA 물고기가 수행되고, 셀은 이미지하고, 좌표를 가져옵니다. 그 후, 같은 슬라이드는 RNA FISH의 신호가 손실...

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광에 의해 세포와 조직을 공부하는 것은 1970 년대 후반 1 년에 소개 된 이후, 연구자들은 세포 내 수준에서 유전자 염색질 조직 및 유전자 발현을 연구 할 수있다. DNA의 FISH 자주 세포 유전학, 핵형이, 암 진단 (3) 및 착상 전 유전자 검사 (4)에 사용되고, 그것은 그 나라의 환경에서 핵산을 검출 할 수 있으므로 분자 연구 5-6에서 중요한 역할을한다. RNA FISH에 의해 단일 ​​세포 발현 분석은 네이티브 차 전 사체를 검출 할 수 있고, 비 암호화 RNA를 염색체로부터 전사되고, 예를 들면 등 집단 수준에서 유전자 발현을 평가하는 다른 기술에 이점을 제공 정량적 RT-PCR, 게놈 넓은 발현 분석 또는 노던 블롯 . 원래 자신의 사이트에서 직접 발생하는 RNA 전 사체를 시각화함으로써, 예를 들어왔다유전자 발현 확률 7이며, 때로는 8 대립 유전자 특정 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 기술의 개선도 9-11 세포 내에서 하나의 mRNA 분자의 검출과 정량을 허용했다. FISH의 기본 원리는 매우 구체적인 왓슨과 크릭 염기쌍에 의해 핵산 프로브로 세포 내에서 핵산의 혼성화로 구성된다. 프로브는 직접 또는 간접적으로 검출, 미시적으로 시각화 될 수있는 신호의 결과 일 수있다. 초기 시도는 안전 문제, 제한된 공간 해상도 및 시간 12-14에 하나의 타겟을 검출 할 수있는 능력에 근거 단점이 있었다 방사성 표지 된 프로브로 구성되었다. 형광 색소, 합텐, 효소 등의 비 방사성 라벨의 후속 개발, 일상적인 분자 생물학 기법으로 물고기의 폭 넓은 사용을 허용했다. FISH 프로브는 직접 fluoroch으로 표시 할 수있다산 핵산에 형광 분자의 화학적 연결하여 romes (15)와 형광 표지 된 뉴클레오티드 16 ~ 19, 또는 프로브가 간접적으로 (비오틴과 제닌 포함) 합텐의 통합에 접합 된 합텐 특정 항체에 의해 합텐의 면역 검출 후 시각화 할 수있는 통합을 시퀀스 형광 기자는 20 ~ 21 분자. 후자의 방법은 원래의 신호를 향상시키기 위해 사용되는 형광 표지 된 항체의 여러 계층을 사용하여 신호 증폭이 가능하고, 낮은 수준으로 발현되는 RNA 종의 검출을 가능하게한다. 직접 및 간접 라벨링 기술과 다양한 합텐을 결합하여 여러 가지 목표를 동시에 동일한 셀 내에서 시각화 할 수 있습니다. FISH 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 대상에 대한 프로브의 하이브리드입니다. 이론적으로, 프로브가 구체적으로 실제로 목표에만 바인딩되지만,이 특이성프로브는 상동 지역에 바인딩 수 있으므로 항상 달성되지 및 하이브리드 조건이 항상 특정 DNA 영역 또는 RNA 종에 적합하지 않을 것입니다. 그들이 FISH 절차의 엄격 성을 증가시킬 수 있고, 배경 잡음의 고레벨 초래 FISH 프로브의 비특이적 결합을 방지 할 수있는 포스트 - 혼성화 세척 따라서 특히 중요하다. RNA 분자가 하나의 좌초로 그들은 쉽게 FISH 프로브에 혼성화 할 수 있습니다. 대조적으로, 이중 가닥 DNA 분자는 먼저 프로브에 혼성화 할 수있는 후 변성 단계를 필요로한다. 이것은 일반적으로 DNA의 변성을 초래 시험편의 가열에 의해 달성된다. 그러나 이러한 가혹한 조건에서, 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자가 손실 될 수 있습니다. 따라서 결합 된 DNA-RNA FISH는 조건의 상당한 최적화를 필요로하고, 단지 RNA 또는 DNA의 별도의 검출에 비해 기술적으로 도전이다. 여기에서 우리는 프리젠타 자세한 문의는 여성 마우스 배아 줄기 세포에게 22-24 차별화에 X 염색체 불 활성화 (XCI)를 연구 할 수있다 결합, 동시에 DNA-RNA 물고기의 프로토콜입니다. XCI는 중요한 성적인 여성의 배아 발달 (25)에 대한 메커니즘 및 heterochromatinization 결과이며 따라서 여성 개인이 26 ~ 27에있는 두 개의 X 염색체 중 하나의 침묵. 이 과정에 필수적인 RNF12 22 ~ 23과 REX1 24 단백질에 의해 조절되는 비 암호화 RNA XIST 28-30가 있습니다. XIST 표현이 배아 발달 동안이나 체외에서 ES 세포 분화에 미래 비활성 X 염색체 (사이)에 상향 조절된다 와 X 염색체를 따라 확산하여 X 염색체 (31)의 전사 종료 될 염색질 리모델링 효소를 유치 할 수 있습니다. 이 XIST RNA의 확산은 X 염색체의 코팅으로 RNA FISH에 의해 시각하실 수 있습니다일부도 XIST 클라우드라고한다. 여성 ES 세포 게놈 불안정성으로 인해 자신의 X 염색체 중 하나를 잃을 수 있기 때문에, 우리는 다른 사람은 확인 만 되었으면 염색체 안정 세포가이 중요한 과정 (22), (32)의 분석에서 평가하는 것을 확인하기 위하여, XCI을 연구하기 위해 결합 된 DNA-RNA FISH를 이용했다 -34. 모든 분자 생물학 기법으로, 여러 가지 우수한 프로토콜은 35-38을 발표되었다. 여기에 우리가 할 수 있도록 마우스 ES 세포, 세포의 고정, 닉 - 번역, 고정 된 세포의 전처리에 의한 FISH 프로브의 라벨에 분화 유도에서 시작, 우리의 방법을 제시 permeabilization 이후 프로브 흡수,에 프로브의 하이브리드 타겟, 그리고 마지막으로 형광 표지 된 항체에 의해 프로브의 검출. 여기에 제시 프로토콜은 XIST RNA의 충실한 검출 이틀의 기간 내에서 X 염색체를 허용하고,이 기술의 기본 가능성이 오티에 적용 할 수 있습니다그녀의 시스템과 연구의 영역.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">female mouse embryonic stem cells</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">will be made available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse embryonic fibroblasts</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell culture medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM &#223;-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4&#186;C for maximal 2 weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">LIF</td>
			<td style="width:124px;">Chemicon</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11960085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin&#8211;streptomycin (100&#215;)</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Non-essential aminoacids&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">&#223;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell differentiation medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 &#956;l/l monothioglycerol and 50 &#956;g/ml ascorbic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">IMDM-Glutamax</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Ascorbic acid (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">monothioglycerol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">T25 cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">6-well cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">cell culture grade PBS</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">falcon tubes</td>
			<td style="width:124px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">24x24 mm coverslips</td>
			<td style="width:124px;">Menzle</td>
			<td align="right" style="width:119px;">780882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">gelatin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1890-100G</td>
			<td>prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 &#7484;C until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20&#7484;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">absolute 100%&#160; ethanol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32221-2.5L</td>
			<td>use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">RNAse free water</td>
			<td style="width:124px;">Baxter</td>
			<td>TKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">sterile filter tips</td>
			<td style="width:124px;">Rainin Bio Clean</td>
			<td style="width:119px;">GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745816910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745824910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Sephadex G50</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2 ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">BD Plastipak</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">sterilized cotton</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf tubes</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">yeast tRNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15401-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse cot-1 DNA&#160; 1 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf bench top microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Eppendorf Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5810R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M NaAc, pH 5.6</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50+ hybridization solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">formamide</td>
			<td style="width:124px;">Acros organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">dextran sulfate</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">pepsin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887</td>
			<td>prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 &#181;l 37% HCL per 100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">HCL, 37% solution&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">object glasses</td>
			<td style="width:124px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">20x SSC</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9763</td>
			<td>dilute to 2x SSC in RNAse free water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">10 mM Phosphate buffer, pH 7</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">denaturation buffer</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tween-20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M Tris pH 7.5 solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tris-Saline-Tween washing solution (TST)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 &#181;l Tween-20, add RNAse free water till 1 liter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">10x Saline solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline-BSA (TSBSA)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>500 &#956;l 10x Saline, 250 &#956;l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">BSA, purified, 100x&#160;</td>
			<td style="width:124px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">sheep-anti-dig antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:500 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse-anti-biotin antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:200 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline washing solution (TS)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:124px;">Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nail-varnish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">fluorescent miscroscope</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined dna-rna fluorescent in situ hybridization (fish) to study x chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells

제자리 혼성화 (FISH)에서 형광 세포의 핵산의 검출을 가능 분자 기법이다. DNA 물고기는 종종 세포 유전학과 암 진단에 사용되며, 종종 중요한 임상 적 의미를 가지고있는 게놈의 수차를 검출 할 수있다. FISH RNA는 세포에서 RNA 분자를 검출하는데 사용될 수 있으며, 유전자 발현의 조절에 중요​​한 통찰력을 제공했다. DNA FISH에 적합한 조건이 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 수 있습니다와 같은 세포 내 DNA 및 RNA의 물고기를 결합하는 것은 기술적으로 도전이다. 우리는 여기에서 X 염색체에 의해 인코딩 XIST RNA와 DNA의 결합을 동시에 검출 할 수 쉽게 적용 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 결합 된 DNA-RNA 물고기 프로토콜 가능성이 RNA와 DNA가 탐지해야하는 다른 시스템에 적용 할 수 있습니다.

결합 된 DNA-RNA 물고기를 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여, 우리는 여성의 배아 줄기 세포를 분화에 X 염색체의 불 활성화를 시각화 할 수있게되었습니다. 1 우리가 XIST (인 모두 검출 DNA-RNA FISH 실험의 대표적인 예를 보여줍니다 비활성 X 염색체에 소위 XIST RNA 구름과 액티브 X 염색체에 기초 전사 핀 포인트), 그리고 핀 포인트의 신호로 볼 수있는 X 염색체?...

Watch this Scientific Journal Video about Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

27.5K 조회수.  Erasmus MC - University Medical Center.  현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다. 

비디오: Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

연구

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...