이 원고에 대한 비디오 편집과 그녀의 도움 병진 과학 UTMB-NIH 보조금 1UL1RR029876-01과 Alisha 프레이 연구소.

1. 동물 준비 <ol><li> 동물 도착 : 동물 바이오 안전성 수준 2 (ABSL2) 시설에 도착시, 동물에게 그들의 새로운 환경에 적응하기 위해 이일을 최소 할 수 있습니다. 이 휴식 기간 후, 자신의 건강 및 전반적인 신체적 인 외모를 평가하기 위해 동물을 검사한다. <ol><li> 형광 기자를 활용하면은 GI의 autofluorescence 및 배경 신호의 양을 제한하는 알팔파 무료로 다이어트의 모든 동물 과목을 배치하는 것이 중요합니다. </li></ol></li><li> 동물을 면도 : 영상 중에 두개 지역에서 발견 발광 생물 신호를 향상 시키려면, 모든 동물의 머리를 면도. 산소 가스의 혼합물로 동물을 마취하고 isoflurane 기화. 동물이 완전히 anesthetized되면​​, 그들의 머리를 면도하는 전기 면도기를 사용합니다. 일단 면도가 완료, 자신의 새장에 동물을 반환하고 마취의 영향으로부터 완전히 복구를 위해 관찰합니다. </li><li> 바이오 의사 데이터시스템 (BMDS) 트랜스 폰더 삽입 (동물이 완전히 anesthetized있는 동안 마우스 면도 후 자리를 차지) : 덜 침습적 방법은 preprogrammed BMDS 무선 송수신기는 각 마우스의 등 지역에 피하 온도 이식을 추적 할 수 있습니다. 이 트랜스 폰더는 무선 식별 및 온도 기록을위한 수 있습니다. 트랜스 폰더의 주입 후, 상처에 수의학 급 조직 접착제를 적용합니다. </li><li> 기본 컬렉션 : 감염 전에, 모든 동물들에게 기준 온도와 무게를 기록합니다. 쥐가 마취에서있는 동안 복고풍 궤도 (RO) 블리드를 통해 플라크 감소 중화 시험 (PRNT) 분석을 위해 혈액을 수집합니다. 혈액 수집 후, 잠재적 인 이차 세균 감염을 줄이기 위해 수의학 항생제 눈 연고를 적용 할 수 있습니다. 이 기본 컬렉션은 동물 쥐에 의한 스트레스로 마취하에 배치 횟수를 고려하여 완료해야합니다. 미래 RO 컬렉션의마우스가 마취에서있는 동안 신고해야할, 영상 이후에 완료 될. RO에서 수집 한 최대 혈액 200 μl 주변에 있어야합니다. </li><li> 감염 : 이전에 설명 된대로 마취하에 장소 마우스. 인산에 의해 희석 40 μl의 총 볼륨의 - 루시 페라 제 TC83 5x10 6 5x10 7 PFU의 복용량을 사용하여 비강 경로를 통해 예방이 비강 감염을 통해 (PBS) 식염 버퍼링. 감염 후, 자신의 주택 케이지 내에서 쥐를 넣고 복구를 관찰합니다. </li></ol> 2. 동물 이미징 면책 조항 : 자신의 주택 단위, 바이오 캐비닛 (BSC), 또는 항상 XIC 봉쇄 상자에서 마우스세요. 이 프로토콜에 대한 승인 BSCs은 클래스 II 타입 B1 또는 B2 있습니다. <ol><li> 15 MG / ML의 농도에 intraperitoneal (IP) luciferin의 체중 g 당 10 μl와 함께 모든 동물을 주사. <ol><li> Ampligen을받는 쥐 injecte하여야한다자신의 그룹에 따라 -4 시간 포스트 감염 또는 48 시간 게시물 감염에서 12.5 밀리그램 / kg 체중의 복용에 d 개의 IP. </li></ol></li><li> 이전 luciferin을 주입하기 XIC-3 봉쇄 상자에서 적절한 운동을 보장하기 위해 세 그룹으로 쥐를 구분합니다. <ol><li> 모든 영상은 절차를 통해 각막의 건조를 방지하기 위해 안구 연고 / 윤활제를 사용합니다. </li></ol></li><li> LivingImage 소프트웨어와 언론 이미징 상자를 준비하는 초기화 열고, 설정 자동 저장, 자동으로 노출 시간 (자동 LivingImage 소프트웨어 3.2 이상의 새로운 기능입니다에 대한 노출 시간), C로의 현장을 볼 수 있으며, 열 필터, 분야 보기의는 사용자가 이미지 아르 생쥐의 수에 기초 및 기타 영상 프로젝트를 위해 필요에 따라 필터를 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 공기 숯 필터가 만료되지 않은 확인, 산소 탱크 가득하고, isoflurane 저수지가 가득 차 있습니다. XIC-3 전에서 전기 테이프의 작은 조각을 배치어떤 solation 상자 이미징 동안 동물의 움직임을 줄여 도와드립니다. </li><li> 3-5 분의 Isoflurane 유도 챔버 (뚜껑을 열 포함) 내에 섹션 2.1 및 장소에 설명 된대로 luciferin의 IP와 쥐를 주사. </li><li> 5 분 후, 유도 챔버의 뚜껑을 닫고 isoflurane의 흐름을 시작합니다. 마취가 약 2.0 L / 분에서 산소 유량 세트 약 3~5%에서 운영하고 있습니다. 일단 완전히 의식 추가 30 초를 기다린 XIC-3 절연 상자에 쥐를 전송합니다. 이 절차는 유도 챔버 (IVIS 단위가 자신의 수동 공정 용기 및 XIC-3 억제 상자가 직접에 / 소켓 아웃에 연결을 포함에서 isoflurane의 손실을 포함하므로 이용되는 바이오 안전성 캐비닛은 isoflurane의 소기의 안전을 위해 할 수 있는지 확인 ) 포함 마취 흐름을 보장 할 수 있습니다. <ol><li> 첨부 isoflurane 커넥터와 XIC-3 절연 상자에 칩 / 그룹 번호에 따라 쥐를 전송d는 엽니 다. 그들이 부드럽게 테이프 스트립에 쉬고있는 머리로 흉골 드러 누움에 배치되도록 마우스를 배치합니다. </li></ol></li><li> cavicide과 에탄올, 스프레이 손과 XIC-3 하단으로 XIC 봉쇄 상자를 닦아하고, IVIS 이미징 챔버에 전송할 수 있습니다. 한 번 이미징 유닛 내부의 밀폐 상자에 마취를 다시 연결하십시오. </li><li> 후 luciferin의 주입에 따라 10 분, 생활 이미지 소프트웨어를 통해 이미지가 쥐를. </li><li> 오픈 필터 초기 이미징 따라 순서 분석 및 발광 생물 반딧불의 루시 페라 제의 이미지 마법사 설정을 사용하여 DLIT 3 차원 영상을 시작합니다. 이 이미징 프로세스 4-5 분 소요됩니다하고 원하는 생쥐의 수에 대한 관련 뷰의 필드에서 완료해야합니다. <ol><li> 전 생체 분석은 뇌의 가능한 다음 검시 및 모음입니다. 멸균 페트리 접시에 뇌를 놓고 IMA에서 50-100 상단에 주식 luciferin의 μl, 그리고 장소를 똑상자를 ging. </li></ol></li><li> DLIT 영상이 완료되면 15-17 분 후 감​​염에 두 번째 오픈 필터 이미지를 완료. 서열 분석이 꺼져 확인 및보기 및 필터 설정의 필드가 이전 설정으로 돌아갑니다. </li></ol> 3. 반환 마우스 및 데이터 분석 <ol><li> isoflurane vaporizer를 끄고 바이오 안전성 캐비닛으로 다시 XIC 봉쇄 상자를 전송할 수 있습니다. </li><li> 자신의 주택 단위에서 다시 마우스를 놓고, 다시 주택 랙에 대해 적절한 살균제과 장소와 외관을 뿌려 상단을 닫습니다. <ol><li> 확인 마우스는 완전히 마취에서 회복했습니다. </li></ol></li><li> 이미징이 완료 될 때까지 실험에서 요구하는대로 위의 절차를 반복합니다. </li><li> , BSC를 소독 장비를 종료하고, 추가 분석을 위해 외부 실험실 위치에 모든 데이터를 전송할 수 있습니다. </li><li> 데이터를 분석하고 IVIS 결과 uti에 따라 3 차원 이미지를 생성LivingImage 소프트웨어를 lizing. <ol><li> 이미지가 제대로 지향하고 조명 / 색상 균형이 설정되어 있는지 확인합니다. 도구 팔레트 내 옵션은 이미지, 조정 정정, 이미지 정보, 투자 수익 (ROI) 도구 등이 있습니다. </li><li> 위치에 따라 특정 신호 강도를 식별 할 투자 수익 (ROI) 모양을 사용합니다. </li><li> , 마우스 몸을 강조하기 위해 표면 지형을 재구성 3D DLIT 재건를 초기화하고, 지형 재건에 장기 맵을 설정하는 선형 운동을 사용합니다. </li></ol></li><li> 또한 바이러스 적정 분석 혈액 및 장기의 컬렉션을 완료 할 수 있습니다. 본 연구에서는 적정은 수정 독수리 매체 (가상)에서 뇌 조직의 균질화를 통해 완성되었습니다. homogenate는 순차적으로 희석 우리는 1 시간에 Vero 세포의 6 잘 판을 감염되었습니다. 세포는 1.5 % agarose/2xMEM 오버레이로 덮여 있으며 37도에서 2 일 incubated되었습니다. 세포는 30 분에 포르말린 10 %로 고정되어 물들되었습니다크리스탈 바이올렛. </li></ol>

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	<li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H/HeN+and+BALB/c+Mice.">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li><li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice.">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection.">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜은 생체 분석을위한 이미징 측면을 다루고 있지만, 향후 연구를위한 중요한 요소로 발광 생물 벡터를 인식하는 것이 중요합니다. 루시 페라 제 표현을위한 벡터로 TC83 우리의 활용, VEEV의 감쇠 백신 변형은 효소의 대량는 이전 1-4에 설명 된대로 CNS에서 바이러스의 높은 복제 속도로 인해 생산되고 있다는 보장합니다. 재조합 바이러스의 추가 감쇠에 두 번째 subgenomic 발?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 시스템 (스펙트럼) </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XGI-8-가스 마취 시스템 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XIC-3 억압 박스 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4.0 소프트웨어 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 원격 / 식별 칩 </td><td> 바이오 의사 데이터 시스템 </td><td> IPTT-300 </td><td> 동물 ID 및 성격ature </td></tr><tr><td> 26 GX 3 / 8 &quot;바늘로 BD Integra 1ml TB의 주사기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> 수의사 본드 조직 접착제 </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Vetropolycin의 안과 연고 </td><td> 웹스터 동물 제품 </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산이 식염 1X 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS 칩 리더 </td><td> 바이오 의사 데이터 시스템 </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-HOST 소프트웨어 </td><td> 바이오 의사 데이터 시스템 </td><td></td><td> 프로브 정보를 다운로드하는 데 사용 </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) detection of a neuro-invasive encephalitic virus

영상 기술의 현대적인 발전은 바이러스 성 연구가 수행되는 방식으로 발전하고 상세 검색을 권장합니다. 처음 흄의 3Rs에 Russel과 버치 제안한 (교체, 감소, 정제), 과학 연구에서 동물 모델의 활용은 과학 정확성과 속도를 향상하면서 동물 사용을 줄이기 위해 새로운 방법론을 식별 할 수 지속적인 압력을 받고 있습니다. 흄의 원칙에 대한 주요 도전하지만, 동물 질병 병적 상태와 전체 숫자를 줄이는 한편 연구 통계적으로 정확하도록하는 방법입니다. 백신 효능 연구는 현재 통계적으로 유의미한 것으로 간주하기 위해 동물의 다수를 필요로 종종 면역 보호의 식별을위한 높은 병적 상태와 사망률의 끝점하는 결과를 가져올 수도 있습니다. 우리는 점점 줬어에 의해 중추 신경계 (CNS)의 침략을 추적 할 반딧불 발광 생물 효소와 함께 생체 이미징 시스템 (IVIS)에 활용손쥐 모델의 phalitic 바이러스. 일반적으로,이 병은 비교적 천천히 진행하지만 바이러스 복제는 특히 CNS 내에서 빠른 속도이며, 종종 치명적인 결과로 이어질 수 있습니다. TC83 룩과 마우스의 비강 감염 후, 감쇠 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 변종이 루시 페라 제 유전자를 표현하도록 수정, 우리는 최소 3 일전에 임상 질병의 증상을 개발하기 전에 뇌에서 바이러스 복제를 시각화 할 수 있습니다. 우리는 임상 증상이 개발되기 전에 신속하게 TC83 룩 감염에 대한 치료 및 백신 보호 기능을 식별 할 수있는 키 encephalitic 질병 개발 엔드 포인트로 CNS의 침략을 활용. IVIS 기술을 통해 우리는 동물 번호와 질병을 줄이면서 약물 치료학 및 백신의 신속하고 정확한 테스트를 시연 할 수 있습니다.

바이러스 복제가 중앙 CNS (그림 1)에 코 지역에서 이동하는 유전자 변형 바이러스, TC83 - 루시 페라 제, 우리는 발광 생물 신호 강도의 증가를 보았다. 높은 바이러스 복제 속도로 인해, 우리는 벡터 및 벡터에 대한 동물 면역 반응에 의존 발광 생물 신호의 높은 수준 (그림 2A)를 참조 할 예정입니다. 우리는 CNS에서 바이러스 복제 피크 (그림 2B)와 함께, 일 5-7 후 ...

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In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

소설로 루시 페라 제 및 생체 이미징 시스템 (IVIS)에서를 활용하면 임상 개발가 발생하기 전에 질병 끝점을 식별 할 수 의미합니다. IVIS은 우리가 미래 연구를위한보다 정확한 질병 모델을 제공 실시간으로 여러 일 동안 encephalitic 바이러스의 침입을 시각화 할 수 있습니다. 또한 우리는 신속하게 현재 활용 동물 모델보다 antivirals과 백신의 잠재적 인 보호 기능을 식별 할 수 있습니다. 여러 시간 지점을 통해 개인 동물을 활용하는 기능은 감소 동물의 요구 사항, 비용, 질병 연구의 더 인간적 더 과학적인 수단을 확보 활용 동물 전반적인 질병을 보장합니다.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

20.5K 조회수.  University of Texas Medical Branch. 소설로 루시 페라 제 및 생체 이미징 시스템 (IVIS)에서를 활용하면 임상 개발가 발생하기 전에 질병 끝점을 식별 할 수 의미합니다. IVIS은 우리가 미래 연구를위한보다 정확한 질병 모델을 제공 실시간으로 여러 일 동안 encephalitic 바이러스의 침입을 시각화 할 수 있습니다. 또한 우리는 신속하게 현재 활용 동물 모델보다 antivirals과 백신의 잠재적 인 보호 기능?...

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...