Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 연구자들이 자유롭게 행동하는 동물의 깊은 뇌 구조에서 수백 개의 뉴런에서 공간적으로나 시간적으로 조정 된 활동을 조사 할 수있게 해줍니다. Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 세포 유형에 특정적, 대규모, 종방향 인 기록을 수행 할 수있는 능력을 포함하여 많은 이점을 제공합니다. 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식을 위한 당사의 수술 프로토콜은 심부 뇌 내 칼슘 이미징을 위한 상업적 또는 맞춤형 단일 광자 및 두 개의 광자 이미징 시스템과 호환됩니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 대학원생 인 Rashmi Thapa가 될 것입니다. 마취 된 마우스의 면도 된 수술 부위를 소독 한 후 메스를 사용하여 중간 선을 따라 피부를 통해 두 센티미터 절개하여 두개골의 람다와 브레그마를 노출시킵니다. 브레그마에서 전방 1.94 밀리미터와 내측 측면 0.5 밀리미터의 위치에 0.5 밀리미터 치과 드릴 버를 배치 한 후, 두개골을 통해 드릴링을 시작하십시오.
다음으로, 마이크로 펌프의 제어판을 사용하여 마이크로리터 주사기에 바이러스를 로딩하고 초당 50 나노리터의 유속으로 800 나노리터의 기포를 인출한 다음 800 나노리터의 바이러스를 인출한다. 바늘을 뇌 조직으로 천천히 움직여 등쪽 복부 1.75 밀리미터의 목표 Z 좌표로 이동 한 다음 등쪽 복부 1.65 밀리미터의 Z 좌표까지 약간 움직입니다. 제어판에서 실행 버튼을 눌러 바이러스를 주입하기 전에 분당 50 나노 리터의 유속으로 500 나노 리터의 바이러스를 주입하도록 마이크로 펌프를 설정하십시오.
주사가 끝나면 피부 가장자리를 정렬하고 조심스럽게 4-0 봉합사로 절개를 닫으십시오. 감염을 예방하기 위해 꿰매어 진 부위에 항생제 연고를 바르십시오. 그라디언트 인덱스 또는 GRIN 렌즈를 이식하려면 미세한 가위를 사용하여 눈 사이의 앞쪽에서 람다 뒤의 뒤쪽까지 1.5 센티미터 높이와 1.5 센티미터 베이스의 피부의 삼각형 영역을 소비하십시오.
두개골을 철저히 청소하고 말린 후 시아 노 아크릴레이트를 피부 가장자리에 바르고 피부를 두개골에 부착하십시오. 시아노아크릴레이트가 건조될 때 5분 후, 브레그마로부터 0.8 밀리미터의 전방 후부 1.94 밀리미터, 내측 측방 0.8 밀리미터의 위치에 직경 1.2 밀리미터의 치과용 드릴 버를 위치시킨다. 두개골을 뚫고 30 게이지 바늘 팁을 사용하여 경막을 제거했습니다.
45도 각진 날카로운 포셉으로 뼈 조각의 모든 조각을 청소하십시오. 다음으로, 수동으로 연마 된 27 게이지의 무딘 끝 바늘을 10도 각도로 기울어 진 로봇 팔에 연결된 바늘 홀더에 부착하고 바늘 홀더의 다른 쪽 끝을 집 진공 시스템에 연결하십시오. 브레그마 버튼을 클릭하여 브레그마의 Z 좌표를 0으로 설정하기 전에 브레그마를 만지기 위해 바늘 끝을 찾으십시오.
입력 X 값을 0.8로 설정하고, Y 값을 1.94로 입력하고, Z 값을 1.0으로 입력 한 다음 찾기 버튼을 클릭하여 바늘을 두개골의 뚫린 구멍 상단으로 이동하십시오. 바늘 끝을 뚫은 구멍에 중앙에 놓고 Z 위치 제로로 가져옵니다. 진공을 켜고 구부러진 팁이있는 30 게이지 바늘에 연결된 중력 제어 튜브 시스템을 통해 인공 뇌척수액 또는 ACSF로 노출 된 뇌 영역을 헹구기 시작하십시오.
ACSF는 0.2 미크론 필터를 통해 여과되는 동안 95 % 산소와 5 % 이산화탄소의 가스 혼합물로 지속적으로 버블링됩니다. AutoStereota 소프트웨어를 사용하면 뇌 조직의 흡인이 네 라운드로 완료됩니다. 포부의 첫 번째 라운드의 경우 Z 값이 0으로 표시되는지 확인하십시오.
그런 다음 zStep 세션에서 첫 번째 행과 두 번째 행을 클릭하고 확인하십시오. 첫 번째 행의 값을 0.2와 1로 설정합니다. 두 번째 행의 값을 0.15와 4로 설정합니다.
모드 세션에서 바늘 크기를 27 게이지와 1.2로 설정하십시오. 딤지 0.9를 설정합니다. 다른 모든 값은 기본값입니다.
포부를 시작하려면 NotSet, KeepZero 및 시작 버튼을 순차적으로 클릭하십시오. 흡인의 첫 번째 라운드는 깊이가 0.8 밀리미터이고 직경이 1 밀리미터 인 기둥 포켓을 생성합니다. 포부의 세 번째 라운드에서 zStep 세션의 첫 번째 행을 클릭하여 확인하고 첫 번째 행의 값을 1.8 및 1로 설정합니다.
모드 세션에서 바늘 크기 27 게이지와 2.2를 설정하십시오. 다른 값을 이전 라운드와 동일하게 유지하여 포부를 시작하십시오. 포부의 세 번째 라운드 후, 기둥 주머니의 깊이는 1.8 밀리미터입니다.
열망의 마지막 라운드는 주머니 바닥에 축적 된 혈액을 청소하는 것입니다. zStep 세션에서 첫 번째 행의 값을 1.6 및 1로 설정하고 포부를 시작하기 전에 모드 세션에서 바늘 크기 27게이지 및 2.2 및 Dims 0.6을 설정합니다. 주머니에 혈액이 없으면 진공을 멈추고 ACSF의 관개를 중단하고 바늘을 Z 좌표에서 2 밀리미터, 중앙으로 0.5 밀리미터 앞쪽으로 가져 오십시오.
멸균 1mm GRIN 렌즈를 뇌 조직 주머니에 넣으십시오. 다음으로, 녹은 아가로스를 주걱으로 GRIN 렌즈와 뇌 조직 사이의 틈새에 적용하십시오. 아가로스가 겔을 형성한 후, 마이크로 블레이드를 이용하여 과량의 아가로스를 제거한다.
치과용 시멘트 분말과 촉매액을 미리 냉각된 혼합에 잘 섞어 두개골에 자기경화 접착수지 시멘트층을 도포하고, 먼저 GRIN 렌즈를 둘러싸고 노출된 두개골 전체를 덮는다. 깨끗한 플라스틱 우물에서 치과 시멘트 분말과 검은 숯을 액체와 혼합하여 치과 시멘트의 첫 번째 층 위에 혼합물의 얇은 층을 적용하십시오. 다섯 분 동안 굳어지게하십시오.
Miniscope를 케이블에 연결하고 사용자 지정 개발된 소프트웨어 NuView를 켭니다. NuView에서 하드웨어를 클릭하고 LED1을 확인한 다음 스트림 단추를 클릭하여 라이브 이미지를 봅니다. 라이브 스트리밍을 중지하려면 중지 버튼을 클릭하십시오.
다음으로, 미니스코프를 맞춤형 미니스코프 홀딩 암에 고정시킵니다. 전동 컨트롤러의 도움으로 노출 된 GRIN 렌즈 바로 위에 Miniscope를 배치하여 렌즈 표면과 평행하게 만듭니다. 미니스코프를 GRIN 렌즈쪽으로 천천히 내리고 최적의 초점 평면이 발견 될 때까지 Z 위치를 조정하십시오.
Miniscope의 위치를 변경하지 않고 Miniscope 베이스 주위에 치과 시멘트의 첫 번째 층을 적용하십시오. 시멘트가 경화 된 후 Miniscope가 마우스 머리에 스스로 설 수 있도록 지주 팔을 부드럽게 제거하십시오. 바닥 주위에 치과 시멘트의 두 번째 층을 적용하여 모든 틈새를 채우고 틈새에서 LED 조명이 누출되지 않도록하십시오.
치과 시멘트가 굳어지게하십시오. 마우스를 이소플루란으로 잠깐 마취시킨 후, 보호 캡을 제거하기 전에 작은 스크루 드라이버로 베이스의 잠금 나사를 풀고 아세톤에 담근 면봉으로 GRIN 렌즈 표면을 청소합니다. Miniscope를 케이블에 연결하고 NuView 소프트웨어를 시작하여 무딘 포셉을 사용하여 약간 조이거나 느슨하게 하여 베이스를 기준으로 미니스코프의 위치를 조정하여 최적의 초점면을 식별하기 시작합니다.
최상의 초점면이 결정되면 케이블을 분리하고 마우스를 홈 케이지에 다시 넣기 전에 잠금 나사를 조이십시오. 행동 카메라 소프트웨어를 켜서 라이브 스트림 기능을 통해 마우스 동작 경기장을 봅니다. 상단 카메라의 초점을 수동으로 조정합니다.
스트로브 트리거를 선택하고 트리거 활성화/비활성화를 선택한 다음 레코드 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 찾아보기를 사용하여 동작 기록이 저장될 위치를 선택합니다. 원하는 이미지 형식을 선택합니다.
마우스를 경기장 가까이로 가져와 Miniscope를 데이터 수집 시스템에 연결된 케이블에 연결합니다. 그런 다음 마우스를 경기장 중앙에 놓습니다. 비헤이비어 카메라 소프트웨어에서 녹화 시작을 클릭합니다.
NuView에서 LED1을 확인하고 캡처를 클릭 한 다음 버튼을 트리거하여 녹음을 시작하십시오. 이를 통해 칼슘 이미징과 마우스 행동을 동시에 기록 할 수 있습니다. 히트 중지 3, 000 프레임 후 파일을 저장합니다.
녹음이 완료되면 마우스를 이소플루란으로 간단히 마취시키고 미니스코프를 바닥에서 분리한 다음 보호 캡을 베이스 위에 올려 놓고 마우스를 홈 케이지에 다시 넣습니다. 차선책의 생체 내 칼슘 영상의 세포 맵에는 일부 활성 뉴런이 포함되었지만 성공적인 이미징에는 집중 영역에 수백 개의 활성 뉴런이 포함되었습니다. 실패한 생체내 칼슘 영상화의 전형적인 예에서, 영역은 어둡고 다섯 개 미만의 활성 뉴런을 포함하거나, 영역은 밝았지만 활성 뉴런이 없는 것으로 관찰되었다.
대표적인 분석에서, 연속적인 생체내 칼슘 이미징 기록으로부터의 최대 프로젝션 형광 세포 맵 및 칼슘 과도기가 도시된다. 실험 마우스의 내측 PFC에서의 GCaMP6f 발현 및 GRIN 렌즈 이식에 대한 사후 평가는 GCaMP6f가 발현되고 GRIN 렌즈가 원하는 뇌 영역에 정확하게 이식되었음을 나타냈다. 좋은 칼슘 이미징을 얻으려면 GRIN 렌즈를 이식하기 전에 출혈이 완전히 멈추고 현장에 혈전이 없는지 확인해야합니다.
이 기술은 다른 인간 뇌 장애의 마우스 모델에서 신경 회로 변화를 연구하고 약물 후보가 변경된 회로를 정상화 할 수 있는지 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.
