Name: blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
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저자는 모나 Herold의 지원 Paaqua를 부여하고 GWU 루터 쌀의 원정 지원 GWU 할란 휄로 십을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 MCB-1121711에 의해 지원되었다.

1. 악기, 문화 미디어와 요리 준비 <ol><li> 알루미나 연마 필름을 사용하여 네 포셉을 선명하게. 팁 크기를 모니터링 할 수있는 해부 현미경으로이 작업을 수행합니다. 포셉 중 하나 쌍은 백업 경우에는 팁이 절차를 수행하는 동안 손상된 역할을합니다. 네 개의 집게를 압력솥과 멸균 용기에 보관하십시오. </li><li> 및 필터 소독, 500 ML 0.1X와 1.0X 문화 매체의 각 (15 조리법 중 마크의 수정일 Ringers는 [MMR] 또는 수정일 바스의 식염 [MBS])가합니다. 우리는 정기적으로 MBS를 (; 1 ㎜ KCl, 0.7 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 5 밀리미터 HEPES [산도 7.8], 2.5 MM NaHCO 3 1X = 88 MM NaCl)을 사용합니다. 개월 동안 14-18 ° C에서 저장합니다. </li><li> 문화 매체 (나사 캡 유리 병에 100 ML 1X 문화 매체에 2g 전기 등급 아가로 오스)의 2 % 아가로 오스 솔루션을 확인하십시오. 아가로 오스를 해산하기 위해 압력솥. 이것은 달 동안 4 ° C에 저장하고,이 다음에 필요할 때 아가로 오스를 녹일 수있는 microwaved 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 액체이지만, 멸균 24도 문화 판의 각 우물의 바닥에 약 0.5 ML를 따르다. 이 플라스틱에 고집에서 explants를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 액체이지만, 2-3 60mm 배양 접시의 바닥에 2-3 ML을 흘려, 그리고 소용돌이 부드럽게 바닥 적용되어 있는지 확인합니다. 이러한 분해 요리로 봉사하고 세포막이 제거되면 아가로 오스는 플라스틱으로 고집에서 배아를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 냉각과 경화되면 불꽃은 6 &quot;파스퇴르 피펫의 팁은 공에 녹아 있으며, 가볍게 문화 판의 각 잘에있는 아가로 오스의 표면에 터치까지.이 얕은 우울증 만들어집니다로 explant가 배치됩니다. </li><li> 1X 멸균 문화 매체와 문화 판의 각 우물을 입력합니다. </li><li> 아가로 오스는 냉각과 경화되면, blastomere 분리를 촉진하기 위해 희석 문화 매체 (0.1X MMR 또는 0.1X MBS)로 분해 요리를 채 웁니다. </lI&gt; </ol> 2. 태아의 선택 <ol><li> 수정 된 알을 얻고 표준 프로토콜 15에 따라 젤리 코트를 제거합니다. 100mm 배양 접시에 0.5X 문화 매체로 전송할 수 있습니다. </li><li> 배아는 2 셀 단계에 도달하면, 첫 번째 절단의 고랑가 별도의 그릇에 동물 반구에서 가볍게 색소 영역 (그림 1)을 양분하는 사람들을 정렬합니다. 다음은 explants의 기증자 될 것입니다. explants을 시작할 수있는 단계 형제 제어 역할을 할 수있는 절차를 통해 기증 배아 옆에 별도의 접시에 나머지 2 세포 배아세요. </li></ol> 3. Explants의 작성 <ol><li> 분해 접시에 5-10 배아를 놓고 있지만, 한 번에 하나의 배아에서 작동합니다. </li><li> 투명 vitelline 막을 볼 수 있도록 최초의 배아를 배치, 그것은 배의 동물 극의 표면 위에 투명한 공간 (perivitelline 공간)로 구분합니다. 날카롭게 힘을 사용사람의 subdominant 손 (하나가 바로 전달하는 경우 왼쪽)에 PS, perivitelline 공간 위의 vitelline 멤브레인을 파악. 다른 손에 날카롭게 집게를 사용하여 첫 번째 포셉 팁에 가까운 멤브레인을 파악하고, 부드럽게 거리에 막 껍질을 벗기면에 반대 방향으로 당긴다. 대상 셀이 막 제거하는 동안 손상되​​지 않도록, 해부하는 셀에서 거리의 초기 이해하십시오. 하나는 배아가 결합한 것 때문에 멤브레인가 제거되었음을 알 수 있습니다. </li><li> subdominant 손에 포셉와 하나 이웃 셀을 잡아 해부 할 수있는 셀이 직접 접촉하지 않도록하는 &quot;핸들&quot;로 셀을 사용합니다. 다른 손에 포셉으로 부드럽게 원하는 blastomere에서 떨어져 남아있는 이웃 세포를 당긴다. 같은 운명을 공유하는 중간 선 세포, 타겟팅하는 경우, 그들은 한 쌍으로 함께 제거 할 수 있습니다. 마지막으로, &quot;핸들&quot;셀을 멀리 해부. </li><li> 살균과 blastomere (또는 blastomere 쌍), 픽업, 유리 파스퇴르 피펫, 기포 및 과도한 흡입을 피. 피펫은 세포가 손상 될 수 있습니다 날카로운 모서리를 제거 할 수 화재 연마 될 수 있지만, 우리는 정기적으로이 작업을 수행하지 않습니다. explant 문화 요리의 잘의 문화 매체의 표면 아래에있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫의 팁을 놓고, 가볍게 blastomere을 배출. 이 중력에 의해 얕은 우울증으로 밀어해야합니다. 하나 이상의 배아에서 같은 blastomere은 단일 explant로 결합 할 수 있습니다. </li><li> 분해 요리, 하나 하나에 남아있는 배아와이 절차를 반복합니다. 10 배아에 대한 후, 해부 접시는 세포 부스러기로 가득합니다. 이 문제가 발생하면, 새로운 절개 요리로 변경합니다. </li><li> 모든 dissections 완료 후 explants가 얕은 우울증에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 부드럽게 건조 70 % 에탄올과 공기 살균 된 헤어 루프와 함께 우울증에 밀려 할 수 있습니다. </li><li> 지난 해부 한 후 한 시간 정도, 파편 surrou를 제거살균, 유리 파스퇴르 피펫으로 치료 explants를 nding. </li><li> 14-20의 문화 explants의 판을 ° C 형제, 컨트롤 배아를 포함하는 페트리 접시 옆에. 형제 자매 배아는 blastomere explants의 개발 단계를 나타냅니다. </li></ol> 4. 분석을위한 수확 Explants <ol><li> 형제 자매가 원하는 발달 단계에 도달 할 때 explants를 수확. 세포의 일부가 붕괴하는 경우에도 이러한 explants 아주 잘 남아있다. 문화의 구름 덩어리가 잘있을 경우 따라서, 건강 explant가 내 매장되어 있는지 확인 할 수있는 헤어 루프 나 집게로 탐험 해보세요. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫과 문화 솔루션의 작은 볼륨에서 explants를 선택하고, 부드럽게 실시 할 수있는 분석에 적합한 정착액 또는 용해 버퍼에 넣어 배출. </li></ol>

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	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

개인 blastomeres 성공적으로 배양하기위한 가장 중요한 단계는 1) 제대​​로 관심 blastomere 식별, 필요한 매뉴얼을 개발하고 4), 살균, 건강한 문화를 유지 2), 3) 세포주기의 정확한 부분에서 박리 세포를 해부하는 동안 손상을 방지하고 잘 문화에 전송하는 민첩성. 특정 blastomeres를 조작하려면, 그것은 추기경의 축을 식별 할 수 있도록 필수적입니다. Xenopus의 배아에서 등?...

Xenopus laevis의 배아들은 달걀 microsurgical 접근 방식을 허용 할 수있을만큼 크기 때문에 배아 세포가 특정 운명을 취득하는하여 메커니즘을 식별 할 수 광범위하게 활용되었습니다. 각 셀은 고유 에너지 저장소를 제공 난황의 혈소판의 풍부한 세포 공급을 포함되어 있기 때문에 또한, 그들은 문화 매체의 영양 보완 필요없이 외부 개발할 수 있습니다. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - 세포의 운명이 결정되는이 메커니즘을 연구하는 중요한 자산이 (32 세포 단계를 통해 2) 절단 단계의 blastomeres의 운명지도의 종합 세트입니다. 이지도는 하나의 식별 blastomere으로 감지 분자를 microinjecting와 조직이 표시 자손에 의해 채워하는 후 개발의 모니터링에 의해 구축되었다. 배아의 추기경 축 안정적으로 많은 엠브리에서 확인 할 수 있기 때문에 일관성있는 운명의지도는 가능합니다OS. 식물 반구이 아닌 반면, 첫째, 모든 야생를 입력 배아에 동물 반구는 색소입니다. 둘째, 기름지게에서 정자의 항목은 미래 복부 편으로 동물 반구의 착색의 수축을 초래, 많은 배아에 착색 차이 따라서 등쪽과 복부 측면 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 셋째, 첫 번째 절단의 고랑 따라서 중간 시상 대부분의 배아에서 비행기, 그리고는 배의 오른쪽과 왼쪽 측면을 식별하는 데 사용할 수 있습니다 대략. 운명의지도는 자연스럽게 태아의 큰 인구에서 각 blastomere는 식별 할 일반 패턴에 알이 자주 다니엘 수정 된 사실에 의존하고 있습니다. 설명 내의 선택 절차를 사용하여 착색 및 절단 패턴에 대한 알 클러치 사이에 다양성이있는 반면 여기에서 소정의 운명과 셀이 90 %의 정확도로 식별 할 수 있습니다. 세포 운명은 방지 할 수 있습니다여러 메커니즘에 의해 embryogenesis 동안 채굴. 이러한 differentially 상속 세포질 mRNAs이나 단백질 등의 고유 요소는, 초기 패턴의 여러 측면에 기여합니다. 예를 들어, 특정 산모 mRNAs는 세포, 세균 라인에 기여 endoderm가, 또는 등쪽 몸 축 (7 검토)에 기여를 결정합니다. 태아의 신호 센터에서 더 많은 먼 이웃 셀이나이 지역에서 제공하는 외부 요인이 특정 조직 유형과 패턴 거의 모든 기관이 시스템을 유도 할 책임이 있습니다. 신호 센터의 예는 신경 외배엽 및 패턴 중배엽을 유도 gastrula의 주최자 / 노드 및 활동을 편광의 영역을 포함 사지 꽃 봉오리의 패턴 앞 - 뒤 축이. 운명의지도 다른 기관의 전구체를 확인하고 정상 배아에서 자신의 자손에 의해 촬영 발달 경로를 보여 있지만, 그들은 고유 구별 할 수 없습니다그리고 그 세포에 외부 영향을 미친다. 또한 자손 배의 복잡한 신호 환경에서 차별화 셀의 전체 발달 가능성을 공개하지 않습니다. 에 문화 다음 배아에서 세포의 제거 또는 2) 소설의 배아의 위치 1) 세포의 이식을 : 두 실험 방법은 셀의 운명은 고유 요인에 의해 결정됩니다 또는 이후 외부 요인에 의해 영향을 여부를 테스트 할 수 있습니다 외인성 신호의 부재. 세포가 수동으로 분리 될만큼 크기 때문에 두 실험 방법이 Xenopus에 가능했습니다. 예를 들어, 다수의 연구 (7 검토, 8, 9) 운명의 변화를 테스트하기 위해 호스트 배아의 소설 위치에 배아 (세포 세포 상호 작용을 변경하려면) 또는 이식 세포에서 단일 세포를 삭제했습니다. 또한, 배의 다른 지역에서 세포의 작은 번호를 explanting의 두 번째 접근법 전Xenopus의 배아의 세포가 세포 내 영양소 저장, 난황의 혈소판으로 가득하기 때문에 외인성 요인의 부재에 유도 조직 상호 작용을 명료하게하다하는 n 인물 문화이 가능합니다. 따라서, 그들은 문화 매체의 영양이나 성장 인자 보완없이 정의 된 소금 매체에서 몇 일 동안 배양 할 수 있습니다. 우리는 등쪽 동물 blastomeres가 maternally 상속 mRNAs 10, 11로 인해 신경과 등쪽 mesodermal 조직을 생성 할 수있는 자율적 인 능력을 가지고 있으며, 다른 32 셀 blastomeres의 중배엽 사양이 고유 및 외부 정보를 12 두에 의존했다 표시하려면이 방법을 사용했습니다 . explants 등의 배양 세포의 장점은 중간도 explanted 셀 12, 13, 14의 운명에 영향을 미칠 수있는 휴대 전화 통신 경로를 결정하기 위해 정의 된 신호 요소를 보완 할 수 있다는 것입니다. 또한, 하나는 blastomere 홍보를 삽입 할 수 있습니다내생 mRNAs의 번역을 방지하기 위해 오버 명시 적 유전자, 또는 안티 센스 oligonucleotides와에 mRNA와 문화 ior. 이, 이득과 손실 기능 분석은 분자가 자율적으로 표현 운명에 필요한되는 식별 할 수 있습니다. explant의 운명을 분석하려면 특정 세포 유형의 식별은 표준 유전자 발현 (예를 들어, 현장 하이브리드 화에 RT-PCR)과 immunocytochemical assays에 의해 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아 세포는 특정 조직에 개발 방법을 규제 고유 및 외부 메커니즘을 구별 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-38 </td><td> 포셉 팁의 주요 수리 과정 (12 μm), </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-46 </td><td> 포셉 도움말을 선명하게 잘 대해 보통 (3 μm) </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-54 </td><td> 포셉 도움말 연마를위한 고급 (0.3 μm) </td></tr><tr><td> 집게 : 뒤몽, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> # 11252-30 </td><td> 이 처음 구입했을 때 선명하게 필요하지 않는 좋은 방법이 있습니다. 부식 방지가 할 수 있도록autoclaved합니다. </td></tr><tr><td> Gentamicin 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> G1397 </td><td> 사용과 같은 날에 중간에 추가 </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

배의 세포를 모두 추적 계보 (Lineage)로 구성 운명의지도는 조직이 배의 각 셀에서 내려 어떤 알 수있다. 운명의지도 기관의 전구체를 식별와 후손 세포가 정상적인 배아에서 해당 기관을 채우는 것들로부터 발달 경로를 elucidating 매우 유용하지만, 그들은 전구체 세포의 전체 발달 가능성을 설명하거나 메커니즘을 식별되지 않는로 운명이 결정됩니다. 세포 운명의 노력에 대해 테스트하려면, 하나는 실험 조작 한 후 표현들과 함께 그대로 배아 (운명의지도)에 자손의 세포의 일반적인 레퍼토리를 비교합니다. 세포의 운명은 주변 세포 환경에 관계없이 (커밋) 고정, 또는 이웃에 의해 제공 외부 요인에 의해 그 영향을 받는가? Xenopus의 배아의 종합 운명지도를 사용하여, 우리는 확인하는 방법에 대해 설명합니다, 격리 및 문화 단일 절단 단계의 전구체, blasto라고meres. 이 방법은 하나가 이러한 초기 세포가 그들의 이웃 세포와의 상호 작용이 필요 손상 배아에서 자신의 정상적인 환경에서 획득 운명에 최선을 다하고 있습니다, 또는 신호의 다른 유형에 노출하는 경우 다른 운명을 표현하는 영향을 할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.

정확하게 세포의 발달 잠재력을 평가하는이 분석의 능력 운명에지도 1, 2, 3, 4, 5, 6을 기반으로 올바른 blastomere을 해부에 의존하고 있습니다. 따라서 이후 그림 2에 도시, 정기적으로 절단 패턴을 준수 그림 1에 도시 된 바와 같이, 2 셀 단계에서 올바른 착색 패턴 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 하나가 필요한 절단 단계에 도달로 정렬 배아를 관찰하고 불규칙 cl...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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비디오: Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

연구

발생학

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

유전학

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

생물학

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

제브라피시 배아에서 나이브 Blastoderm 의 세대

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

인간 배반포 모델링 배반포 개발 및 이식을 위한 프로토콜

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a promising model organism for laboratory studies of development, providing a useful outgroup comparison to the well studied arthropod model organism Drosophila melanogaster. In contrast to the syncytial cleavages of Drosophila, the early cleavages of Parhyale are holoblastic. Fate mapping using tracer dyes injected into early blastomeres have shown that all three germ layers and the germ line are established by the eight-cell stage. At this stage, three blastomeres are fated to give rise to the ectoderm, three are fated to give rise to the mesoderm, and the remaining two blastomeres are the precursors of the endoderm and germ line respectively. However, blastomere ablation experiments have shown that Parhyale embryos also possess significant regulatory capabilities, such that the fates of blastomeres ablated at the eight-cell stage can be taken over by the descendants of some of the remaining blastomeres. Blastomere ablation has previously been described by one of two methods: injection and subsequent activation of phototoxic dyes or manual ablation. However, photoablation kills blastomeres but does not remove the dead cell body from the embryo. Complete physical removal of specific blastomeres may therefore be a preferred method of ablation for some applications. Here we present a protocol for manual removal of single blastomeres from the eight-cell stage of Parhyale embryos, illustrating the instruments and manual procedures necessary for complete removal of the cell body while keeping the remaining blastomeres alive and intact. This protocol can be applied to any Parhyale cell at the eight-cell stage, or to blastomeres of other early cleavage stages. In addition, in principle this protocol could be applicable to early cleavage stage embryos of other holoblastically cleaving marine invertebrates.

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a promising model organism for studies of crustacean embryology and comparative arthropod development and evolution. This protocol describes a method for manual removal of single blastomeres from early cleavage stage embryos of Parhyale.

Amphipod 갑각류의 여덟 세포 배아에서 단일 셀의 절제<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Fate Mapping

Fate mapping is a technique used to understand how embryonic cells divide, differentiate, and migrate during development. In classic fate mapping experiments, cells in different areas of an embryo are labeled with a chemical dye and then tracked to determine which tissues or structures they form. Technological improvements now allow for individual cells to be marked and traced throughout embryonic development and adulthood.
This video reviews the concepts behind fate mapping, and then details a fate mapping protocol in zebrafish using photoactivatable fluorescent proteins. Finally, specific applications and modifications of this unique technique are discussed.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

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줄기 세포처럼