저자는 모나 Herold의 지원 Paaqua를 부여하고 GWU 루터 쌀의 원정 지원 GWU 할란 휄로 십을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 MCB-1121711에 의해 지원되었다.

1. 악기, 문화 미디어와 요리 준비 <ol><li> 알루미나 연마 필름을 사용하여 네 포셉을 선명하게. 팁 크기를 모니터링 할 수있는 해부 현미경으로이 작업을 수행합니다. 포셉 중 하나 쌍은 백업 경우에는 팁이 절차를 수행하는 동안 손상된 역할을합니다. 네 개의 집게를 압력솥과 멸균 용기에 보관하십시오. </li><li> 및 필터 소독, 500 ML 0.1X와 1.0X 문화 매체의 각 (15 조리법 중 마크의 수정일 Ringers는 [MMR] 또는 수정일 바스의 식염 [MBS])가합니다. 우리는 정기적으로 MBS를 (; 1 ㎜ KCl, 0.7 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 5 밀리미터 HEPES [산도 7.8], 2.5 MM NaHCO 3 1X = 88 MM NaCl)을 사용합니다. 개월 동안 14-18 ° C에서 저장합니다. </li><li> 문화 매체 (나사 캡 유리 병에 100 ML 1X 문화 매체에 2g 전기 등급 아가로 오스)의 2 % 아가로 오스 솔루션을 확인하십시오. 아가로 오스를 해산하기 위해 압력솥. 이것은 달 동안 4 ° C에 저장하고,이 다음에 필요할 때 아가로 오스를 녹일 수있는 microwaved 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 액체이지만, 멸균 24도 문화 판의 각 우물의 바닥에 약 0.5 ML를 따르다. 이 플라스틱에 고집에서 explants를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 액체이지만, 2-3 60mm 배양 접시의 바닥에 2-3 ML을 흘려, 그리고 소용돌이 부드럽게 바닥 적용되어 있는지 확인합니다. 이러한 분해 요리로 봉사하고 세포막이 제거되면 아가로 오스는 플라스틱으로 고집에서 배아를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 냉각과 경화되면 불꽃은 6 &quot;파스퇴르 피펫의 팁은 공에 녹아 있으며, 가볍게 문화 판의 각 잘에있는 아가로 오스의 표면에 터치까지.이 얕은 우울증 만들어집니다로 explant가 배치됩니다. </li><li> 1X 멸균 문화 매체와 문화 판의 각 우물을 입력합니다. </li><li> 아가로 오스는 냉각과 경화되면, blastomere 분리를 촉진하기 위해 희석 문화 매체 (0.1X MMR 또는 0.1X MBS)로 분해 요리를 채 웁니다. </lI&gt; </ol> 2. 태아의 선택 <ol><li> 수정 된 알을 얻고 표준 프로토콜 15에 따라 젤리 코트를 제거합니다. 100mm 배양 접시에 0.5X 문화 매체로 전송할 수 있습니다. </li><li> 배아는 2 셀 단계에 도달하면, 첫 번째 절단의 고랑가 별도의 그릇에 동물 반구에서 가볍게 색소 영역 (그림 1)을 양분하는 사람들을 정렬합니다. 다음은 explants의 기증자 될 것입니다. explants을 시작할 수있는 단계 형제 제어 역할을 할 수있는 절차를 통해 기증 배아 옆에 별도의 접시에 나머지 2 세포 배아세요. </li></ol> 3. Explants의 작성 <ol><li> 분해 접시에 5-10 배아를 놓고 있지만, 한 번에 하나의 배아에서 작동합니다. </li><li> 투명 vitelline 막을 볼 수 있도록 최초의 배아를 배치, 그것은 배의 동물 극의 표면 위에 투명한 공간 (perivitelline 공간)로 구분합니다. 날카롭게 힘을 사용사람의 subdominant 손 (하나가 바로 전달하는 경우 왼쪽)에 PS, perivitelline 공간 위의 vitelline 멤브레인을 파악. 다른 손에 날카롭게 집게를 사용하여 첫 번째 포셉 팁에 가까운 멤브레인을 파악하고, 부드럽게 거리에 막 껍질을 벗기면에 반대 방향으로 당긴다. 대상 셀이 막 제거하는 동안 손상되​​지 않도록, 해부하는 셀에서 거리의 초기 이해하십시오. 하나는 배아가 결합한 것 때문에 멤브레인가 제거되었음을 알 수 있습니다. </li><li> subdominant 손에 포셉와 하나 이웃 셀을 잡아 해부 할 수있는 셀이 직접 접촉하지 않도록하는 &quot;핸들&quot;로 셀을 사용합니다. 다른 손에 포셉으로 부드럽게 원하는 blastomere에서 떨어져 남아있는 이웃 세포를 당긴다. 같은 운명을 공유하는 중간 선 세포, 타겟팅하는 경우, 그들은 한 쌍으로 함께 제거 할 수 있습니다. 마지막으로, &quot;핸들&quot;셀을 멀리 해부. </li><li> 살균과 blastomere (또는 blastomere 쌍), 픽업, 유리 파스퇴르 피펫, 기포 및 과도한 흡입을 피. 피펫은 세포가 손상 될 수 있습니다 날카로운 모서리를 제거 할 수 화재 연마 될 수 있지만, 우리는 정기적으로이 작업을 수행하지 않습니다. explant 문화 요리의 잘의 문화 매체의 표면 아래에있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫의 팁을 놓고, 가볍게 blastomere을 배출. 이 중력에 의해 얕은 우울증으로 밀어해야합니다. 하나 이상의 배아에서 같은 blastomere은 단일 explant로 결합 할 수 있습니다. </li><li> 분해 요리, 하나 하나에 남아있는 배아와이 절차를 반복합니다. 10 배아에 대한 후, 해부 접시는 세포 부스러기로 가득합니다. 이 문제가 발생하면, 새로운 절개 요리로 변경합니다. </li><li> 모든 dissections 완료 후 explants가 얕은 우울증에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 부드럽게 건조 70 % 에탄올과 공기 살균 된 헤어 루프와 함께 우울증에 밀려 할 수 있습니다. </li><li> 지난 해부 한 후 한 시간 정도, 파편 surrou를 제거살균, 유리 파스퇴르 피펫으로 치료 explants를 nding. </li><li> 14-20의 문화 explants의 판을 ° C 형제, 컨트롤 배아를 포함하는 페트리 접시 옆에. 형제 자매 배아는 blastomere explants의 개발 단계를 나타냅니다. </li></ol> 4. 분석을위한 수확 Explants <ol><li> 형제 자매가 원하는 발달 단계에 도달 할 때 explants를 수확. 세포의 일부가 붕괴하는 경우에도 이러한 explants 아주 잘 남아있다. 문화의 구름 덩어리가 잘있을 경우 따라서, 건강 explant가 내 매장되어 있는지 확인 할 수있는 헤어 루프 나 집게로 탐험 해보세요. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫과 문화 솔루션의 작은 볼륨에서 explants를 선택하고, 부드럽게 실시 할 수있는 분석에 적합한 정착액 또는 용해 버퍼에 넣어 배출. </li></ol>

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	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

개인 blastomeres 성공적으로 배양하기위한 가장 중요한 단계는 1) 제대​​로 관심 blastomere 식별, 필요한 매뉴얼을 개발하고 4), 살균, 건강한 문화를 유지 2), 3) 세포주기의 정확한 부분에서 박리 세포를 해부하는 동안 손상을 방지하고 잘 문화에 전송하는 민첩성. 특정 blastomeres를 조작하려면, 그것은 추기경의 축을 식별 할 수 있도록 필수적입니다. Xenopus의 배아에서 등?...

Xenopus laevis의 배아들은 달걀 microsurgical 접근 방식을 허용 할 수있을만큼 크기 때문에 배아 세포가 특정 운명을 취득하는하여 메커니즘을 식별 할 수 광범위하게 활용되었습니다. 각 셀은 고유 에너지 저장소를 제공 난황의 혈소판의 풍부한 세포 공급을 포함되어 있기 때문에 또한, 그들은 문화 매체의 영양 보완 필요없이 외부 개발할 수 있습니다. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - 세포의 운명이 결정되는이 메커니즘을 연구하는 중요한 자산이 (32 세포 단계를 통해 2) 절단 단계의 blastomeres의 운명지도의 종합 세트입니다. 이지도는 하나의 식별 blastomere으로 감지 분자를 microinjecting와 조직이 표시 자손에 의해 채워하는 후 개발의 모니터링에 의해 구축되었다. 배아의 추기경 축 안정적으로 많은 엠브리에서 확인 할 수 있기 때문에 일관성있는 운명의지도는 가능합니다OS. 식물 반구이 아닌 반면, 첫째, 모든 야생를 입력 배아에 동물 반구는 색소입니다. 둘째, 기름지게에서 정자의 항목은 미래 복부 편으로 동물 반구의 착색의 수축을 초래, 많은 배아에 착색 차이 따라서 등쪽과 복부 측면 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 셋째, 첫 번째 절단의 고랑 따라서 중간 시상 대부분의 배아에서 비행기, 그리고는 배의 오른쪽과 왼쪽 측면을 식별하는 데 사용할 수 있습니다 대략. 운명의지도는 자연스럽게 태아의 큰 인구에서 각 blastomere는 식별 할 일반 패턴에 알이 자주 다니엘 수정 된 사실에 의존하고 있습니다. 설명 내의 선택 절차를 사용하여 착색 및 절단 패턴에 대한 알 클러치 사이에 다양성이있는 반면 여기에서 소정의 운명과 셀이 90 %의 정확도로 식별 할 수 있습니다. 세포 운명은 방지 할 수 있습니다여러 메커니즘에 의해 embryogenesis 동안 채굴. 이러한 differentially 상속 세포질 mRNAs이나 단백질 등의 고유 요소는, 초기 패턴의 여러 측면에 기여합니다. 예를 들어, 특정 산모 mRNAs는 세포, 세균 라인에 기여 endoderm가, 또는 등쪽 몸 축 (7 검토)에 기여를 결정합니다. 태아의 신호 센터에서 더 많은 먼 이웃 셀이나이 지역에서 제공하는 외부 요인이 특정 조직 유형과 패턴 거의 모든 기관이 시스템을 유도 할 책임이 있습니다. 신호 센터의 예는 신경 외배엽 및 패턴 중배엽을 유도 gastrula의 주최자 / 노드 및 활동을 편광의 영역을 포함 사지 꽃 봉오리의 패턴 앞 - 뒤 축이. 운명의지도 다른 기관의 전구체를 확인하고 정상 배아에서 자신의 자손에 의해 촬영 발달 경로를 보여 있지만, 그들은 고유 구별 할 수 없습니다그리고 그 세포에 외부 영향을 미친다. 또한 자손 배의 복잡한 신호 환경에서 차별화 셀의 전체 발달 가능성을 공개하지 않습니다. 에 문화 다음 배아에서 세포의 제거 또는 2) 소설의 배아의 위치 1) 세포의 이식을 : 두 실험 방법은 셀의 운명은 고유 요인에 의해 결정됩니다 또는 이후 외부 요인에 의해 영향을 여부를 테스트 할 수 있습니다 외인성 신호의 부재. 세포가 수동으로 분리 될만큼 크기 때문에 두 실험 방법이 Xenopus에 가능했습니다. 예를 들어, 다수의 연구 (7 검토, 8, 9) 운명의 변화를 테스트하기 위해 호스트 배아의 소설 위치에 배아 (세포 세포 상호 작용을 변경하려면) 또는 이식 세포에서 단일 세포를 삭제했습니다. 또한, 배의 다른 지역에서 세포의 작은 번호를 explanting의 두 번째 접근법 전Xenopus의 배아의 세포가 세포 내 영양소 저장, 난황의 혈소판으로 가득하기 때문에 외인성 요인의 부재에 유도 조직 상호 작용을 명료하게하다하는 n 인물 문화이 가능합니다. 따라서, 그들은 문화 매체의 영양이나 성장 인자 보완없이 정의 된 소금 매체에서 몇 일 동안 배양 할 수 있습니다. 우리는 등쪽 동물 blastomeres가 maternally 상속 mRNAs 10, 11로 인해 신경과 등쪽 mesodermal 조직을 생성 할 수있는 자율적 인 능력을 가지고 있으며, 다른 32 셀 blastomeres의 중배엽 사양이 고유 및 외부 정보를 12 두에 의존했다 표시하려면이 방법을 사용했습니다 . explants 등의 배양 세포의 장점은 중간도 explanted 셀 12, 13, 14의 운명에 영향을 미칠 수있는 휴대 전화 통신 경로를 결정하기 위해 정의 된 신호 요소를 보완 할 수 있다는 것입니다. 또한, 하나는 blastomere 홍보를 삽입 할 수 있습니다내생 mRNAs의 번역을 방지하기 위해 오버 명시 적 유전자, 또는 안티 센스 oligonucleotides와에 mRNA와 문화 ior. 이, 이득과 손실 기능 분석은 분자가 자율적으로 표현 운명에 필요한되는 식별 할 수 있습니다. explant의 운명을 분석하려면 특정 세포 유형의 식별은 표준 유전자 발현 (예를 들어, 현장 하이브리드 화에 RT-PCR)과 immunocytochemical assays에 의해 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아 세포는 특정 조직에 개발 방법을 규제 고유 및 외부 메커니즘을 구별 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-38 </td><td> 포셉 팁의 주요 수리 과정 (12 μm), </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-46 </td><td> 포셉 도움말을 선명하게 잘 대해 보통 (3 μm) </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-54 </td><td> 포셉 도움말 연마를위한 고급 (0.3 μm) </td></tr><tr><td> 집게 : 뒤몽, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> # 11252-30 </td><td> 이 처음 구입했을 때 선명하게 필요하지 않는 좋은 방법이 있습니다. 부식 방지가 할 수 있도록autoclaved합니다. </td></tr><tr><td> Gentamicin 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> G1397 </td><td> 사용과 같은 날에 중간에 추가 </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

배의 세포를 모두 추적 계보 (Lineage)로 구성 운명의지도는 조직이 배의 각 셀에서 내려 어떤 알 수있다. 운명의지도 기관의 전구체를 식별와 후손 세포가 정상적인 배아에서 해당 기관을 채우는 것들로부터 발달 경로를 elucidating 매우 유용하지만, 그들은 전구체 세포의 전체 발달 가능성을 설명하거나 메커니즘을 식별되지 않는로 운명이 결정됩니다. 세포 운명의 노력에 대해 테스트하려면, 하나는 실험 조작 한 후 표현들과 함께 그대로 배아 (운명의지도)에 자손의 세포의 일반적인 레퍼토리를 비교합니다. 세포의 운명은 주변 세포 환경에 관계없이 (커밋) 고정, 또는 이웃에 의해 제공 외부 요인에 의해 그 영향을 받는가? Xenopus의 배아의 종합 운명지도를 사용하여, 우리는 확인하는 방법에 대해 설명합니다, 격리 및 문화 단일 절단 단계의 전구체, blasto라고meres. 이 방법은 하나가 이러한 초기 세포가 그들의 이웃 세포와의 상호 작용이 필요 손상 배아에서 자신의 정상적인 환경에서 획득 운명에 최선을 다하고 있습니다, 또는 신호의 다른 유형에 노출하는 경우 다른 운명을 표현하는 영향을 할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.

정확하게 세포의 발달 잠재력을 평가하는이 분석의 능력 운명에지도 1, 2, 3, 4, 5, 6을 기반으로 올바른 blastomere을 해부에 의존하고 있습니다. 따라서 이후 그림 2에 도시, 정기적으로 절단 패턴을 준수 그림 1에 도시 된 바와 같이, 2 셀 단계에서 올바른 착색 패턴 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 하나가 필요한 절단 단계에 도달로 정렬 배아를 관찰하고 불규칙 cl...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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15.2K 조회수.  The George Washington University. 개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

비디오: Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

연구

생물학

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

유전자 Inducible의 운명 매핑에 대한 실용적인 접근법 : 셀을 선택하고 추적하는 비주얼 가이드 VIVO에서</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...