아주 초기 태아조차도 개별적인 배아 신호의 완전한 기능을 분별하는 도전을 만들 수 있는 많은 다른 신호 분자를 포함합니다. 내인성 신호 센터에서 세포를 격리시킴으로써, 이 이식은 연구원이 상대적으로 격리에 주어진 신호 분자의 역할을 검토할 수 있게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 배양에서 줄기 세포를 유지하는 데 필요한 시간이나 노력없이 단순화 된 전 생체 시스템 내에서 배아 타이밍, 세포 운동 및 유전자 발현 패턴을 재구성 할 수 있다는 것입니다.
먼저 감염되지 않은 배아에서 이절을 절단하여 시작합니다. 확장 문화를 확장 하는 이절 하는 경우, 다음 컷은 노 른자 가까이 했다. 먼저 당겨진 유리 모세관 바늘을 RNA로 채우는 것으로 시작합니다.
채워진 바늘을 마이크로 조작기에 넣고 집게로 바늘 끝을 부러놓습니다. 미네랄 오일 한 방울을 가진 단계 마이크로미터를 사용하여 사출 부피를 보정하고, 공압 인젝터에 대한 주입 시간과 압력을 조정하여 원하는 크기의 볼러스를 달성합니다. RNA 바늘 팁은 주입할 준비가 될 때까지 오일에 잠긴 상태로 유지합니다.
파스퇴르 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 배아를 사출 판에 넣은 다음 장갑을 낀 손가락을 사용하여 계란을 통틀로 부드럽게 누릅니다. 원하는 수의 배아가 도달하거나 배아가 분열되기 시작할 때까지 단세포 배아의 노른자에 10개의 피코그램 ndr2 RNA를 주입하십시오. 스퀴즈 병에서 달걀 물의 부드러운 스트림을 사용하여 주입 판에서 배아를 라벨이 붙은 페트리 접시로 씻어냅니다.
배아를 섭씨 28.5도에 넣고 128세포 단계에 도달할 때까지 배아를 넣습니다. 요리에서 수정되지 않은 계란과 죽은 배아를 제거합니다. 배아가 128세포 단계에 도달하면, 라벨이 붙은 유리 페트리 접시에 넣고, 가능한 한 많은 달걀 물을 데수수있습니다.
작은 접시 이름에 해당하는 실험실 테이프로 유리 결정화 요리에 라벨을 지정하고, 계란 물로 방법의 3 분의 2를 채웁니다. 이러한 요리는 해부 현미경 옆에 배치하여 빠른 접근성을 위해 합니다. 밀리리터 프라이나제 스톡당 20밀리리터 1밀리리터를 넣고 얼음 위에 해동하여 50밀리리터 원뿔형 튜브에 3X Danieau용 용액15밀리리터를 넣습니다.
배아가 함유된 각 유리 페트리 접시에 pronase 용액을 최소 5밀리리터를 추가합니다. 유리 접시를 원형 운동으로 양시하여 해부 현미경으로 지속적으로 점초의 진행 상황을 모니터링합니다. 코리온이 주름을 시작하고 1~2개의 배아가 그들의 축출에서 나오면, pronase와 배아가 들어있는 유리 페트리 접시를 계란물이 들어 있는 해당 유리 결정화 접시에 조심스럽게 덩크합니다.
점진 배아를 달걀물로 세 번 씻고 접시에서 달걀 물을 데수합니다. 0.3X 다니오의 용액으로 세 번째이자 마지막 세척을 수행합니다. 페트리 접시 뚜껑으로 비반향배아를 덮고 256세포 단계에 도달할 때까지 섭씨 28.5도의 인큐베이터로 돌려보겠습니다.
아가로즈 코팅 페트리 접시에 3X 다니오의 솔루션으로 채웁니다. 배아가 256세포 단계에 있으면 3X 다니우의 용액이 들어 있는 아가로즈 코팅 판으로 옮기고 접시의 중심을 따라 일렬로 세워줍니다. 배아를 안정화하기 위해 닫힌 집게 한 쌍을 사용하고 다른 한 쌍을 사용하여 blastoderm을 절단하십시오.
잘라내기 위해, 부드럽게 한 쌍의 집게로 blastoderm 세포를 짜낸 다음 안정화 집게를 가지고 다른 집게를 따라 실행하여 blastoderm을 가로 질러 약 절반을 슬라이스합니다. 배아를 회전시키고, 집게를 기존 절단에 넣은 다음 나머지 blastoderm 직교를 첫 번째 절단으로 절단합니다. 3X Danieau의 용액에 5분 이상 이산하여 치유한 다음, 4밀리리터의 엑스웰 미터로 채워진 6웰 플레이트의 잘 코팅된 아가로즈로 옮겨 보세요.
원하는 시점이나 스테이지에 도달할 때까지 식소 배양판을 섭씨 28.5도인 큐베이터에 넣습니다. 키메라 이출을 자르려면 1mm 유리 구슬을 사용하여 12 개의 작은 얕은 우물로 성형 된 아가로즈가있는 접시를 사용하십시오. 3X 다니오의 용액으로 접시를 채웁니다.
플레이트의 왼쪽에 1개의 유전자형 또는 상태의 12개의 배아를 첨가하여 준비하고, 다른 유전자형의 12개의 배아는 플레이트의 오른쪽에 조절된다. 각 상태의 배아 1개를 12웰 중 하나 근처의 플레이트 중심으로 이동합니다. 집게를 사용하여 단일 배아 각경에 대해 설명된 대로 각 배아에서 각 배아를 잘라냅니다.
두 개의 절단 된 가장자리를 빠르게 눌러 두 반쪽이 하나의 절개로 함께 치유 할 수 있도록 집게를 사용하여 얕은 우물 내에서 함께 흥분. 플레이트 내의 나머지 12웰을 계속 합니다. 이병이 치유되면, 4밀리리터의 농사 매체로 채워진 6웰 플레이트의 잘 코팅된 아가로즈로 옮기다.
원하는 수의 이절이 이루어질 때까지 반복합니다. 배양은 그대로 형제 배아가 원하는 단계에 도달 할 때까지 섭씨 28.5도 에서 이양됩니다. 감염되지 않은 야생형 배아 또는 50picograms의 mRNA 인코딩 주입된 배양 기간 동안 반올림된 대조군 이외에도 메소더m, 엔도름 또는 신경 절제술의 마커를 발현하지 못했습니다.
ndr2 mRNA의 10 피코그램으로 주입된 배아에서 절단된 축출은 문화에서 8~9시간 후에 높게 길어졌습니다. 차동 간섭 대비 현미경 검사법에 의하여 이 이 분야의 살아있는 시간 경과 화상 진찰은 확장이 수정 후 8 시간 전후에 또는 약 8 시간 시작한다는 것을 밝혔습니다. ndr2의 10 피코그램으로 주입된 배아로부터 의기식은 중피 마커, tbxta, noto, tbx16 및 신경 절제술 마커 sox2의 견고한 발현을 나타냈다.
배아 마진보다 이절을 잘 자르는 것이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면, 이 절제는 여백에서 내인성 신호를 포함하고 순진하지 않습니다. 이 방법에서, 이 병은 위장 형태발생에서 음염 신호의 역할을 해결하기 위해 사용되었다.
미래에, 그밖 연구원은 추가 신호 분자의 역할을 시험하기 위하여 이 접근을 이용할 수 있습니다, 예를 들면, 발달 프로세스의 수에 있습니다.
