다세포 조직은 복잡하며,이 프로토콜은 단순화 된 방식으로 세포 전이를 재구성합니다. 한 가지는 세포 도체 양성자와 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구하는이 기술입니다. 이 프로토콜은 화학적으로 기능적인 폴리스티렌 구슬을 사용하여 세포 도체 양성자를 재구성합니다.
구슬은 관심있는 양성자와 함께 절단 할 수 있습니다, 세포 반응에 미치는 영향을 테스트하기 위해. 우리는 마우스 배아에 C-엘레강스에서이 방법을 사용했다. 따라서,이 프로토콜은 넓은 유기체의 연구에 똑바로 할 수있다.
배아는 높은 전체 염소 처리 후에 깨지기 때문에, 1개의 성공적으로 blastomere를 격리할 수 있기 전에 중요한 사례가 필요합니다. 시각적 데모는 blastomere 격리 방법 중에 모세관을 처리하는 방법에 대한 더 큰 이해를 제공합니다. 시작하려면 1.5 밀리 리터 마이크로 원심 분리기 튜브에서 10 밀리 그램의 카복실레이트 변형 폴리스티렌 구슬의 무게를 측정합니다.
MES 버퍼 1밀리리터를 튜브에 추가하여 세척합니다. 튜브를 소용돌이로 사용하여 구슬을 섞습니다. 벤치 탑 원심분리기를 통해 2000XG에서 60초 동안 튜브를 회전시합니다.
버퍼를 조심스럽게 피펫으로 전환하여 상신을 디카드합니다. MES 버퍼 1밀리리터로 구슬을 다시 씻으십시오. 세척 후, 튜브에 EDAC 10 밀리그램을 포함하는 MES 버퍼 1밀리리터를 추가하여 표면 카복실 그룹을 활성화합니다.
튜브를 소용돌이로 사용하여 구슬을 섞습니다. 실온에서 15분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다. 2000XG에서 60초 동안 구슬을 회전시합니다.
버퍼를 조심스럽게 꺼내서 상체를 버리고 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 튜브를 소용돌이하여 구슬을 혼합하고 PBS 세척을 한 번 더 반복합니다. 0.65 밀리 리터 로다민 레드-X 스톡 솔루션에서 1밀리리터 10, 100, 100, 1,000배의 로다민 레드-X 희석 시리즈를 준비합니다.
Pippette 20 마이크로 리터의 구슬은 각 시리얼 희석 튜브에 넣습니다. 실온에서 5분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다. PBS 1밀리리터로 구슬을 두 번 씻으시면 됩니다.
세척 후, 튜브에 PBS의 1 밀리 리터를 추가하고 최대 6 주 동안 섭씨 4도에 저장합니다. 라이브 이미징에 사용되는 현미경으로 구슬의 형광 강도를 확인하십시오. 오른손과 왼손으로 10 마이크로 리터의 용량으로 마이크로 모세관의 각 끝을 잡으라.
미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 긴장을 가하고 모세관 의 중심을 버너 위로 가져와 손으로 당겨진 두 개의 모세 혈관을 만듭니다. 해부 현미경에서, 집게와 손으로 뽑아 모세 혈관의 끝을 손질. 두 팁 개구부 크기를 약 2배, 배아 전이 및 달걀 껍질 제거를 위한 C-Elegance 배아의 짧은 접근 길이의 1배를 확인합니다.
끌어온 모세관을 입에 넣는 장치에 부착합니다. 핍펫 45 마이크로 리터의 달걀 소금 용액이 다중 웰 슬라이드의 우물에 들어있습니다. 5~10명의 성인 C-엘레강스를 우물에 놓습니다.
초기 C-엘레강스 배아를 얻으려면 C-Elegance의 몸의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 배치하고 바늘을 서로 미끄러지게하여 성인을 조각으로 잘라냅니다. Pippette 45 마이크로 리터의 저혈당 용액은 계란 소금 용액을 함유하고 있으며, 쉘튼의 성장 매체의 45 마이크로 리터를 다음 세 개의 우물에 잘 함유하고 있습니다. 1개의 세포 단계 및 초기 2개의 세포 단계 배아를 더 큰 크기의 개구로 입 핍펫에 의하여 hypochlorite 용액으로 옮기고 40 55 초 동안 기다립니다.
셸튼의 성장 매체와 함께 다음 세 개의 우물로 배아를 전송하여 배아를 씻어. 처음 두 개의 우물 각각에 1 ~ 2 초. 손으로 그린 모세관을 사용하여 작은 크기의 개구부를 사용하여 달걀 껍질 제거를 위해 배아를 조심스럽게 반복합니다.
그 후, 2세포 단계 배아 발파소를 분리하기 위해 손으로 그린 모세관을 지속적으로 배피한다. 달걀 껍질 제거 후, 파열을 방지하기 위해 배아를 위아래로 핍펫에 힘을 최소화. 커버슬립 홀더에 커버슬립을 배치하여 이미징 챔버를 준비하고 커버슬립의 가장자리를 테이프로 사용하여 염색합니다.
커버슬립 홀더를 뒤집어 소수성 펜으로 커버슬립에 원을 그립니다. 소수성 마커에 의해 그려진 원 내에서 쉘튼의 성장 매체를 추가하고, 원 내의 이미징 챔버에 격리 된 blastomere를 전송합니다. 이제, 더 큰 개구부와 손으로 그린 모세관을 사용하여 커버 슬립에 화학적으로 기능화 된 구슬의 작은 볼륨을 분배.
구슬이 분리된 blastomere에 부착될 때까지 손으로 그린 모세관으로 불어서 구슬의 위치를 제어합니다. 중간 의 증발을 피하기 위해 커버 슬립을 마운트하고 반전 된 현미경을 사용하여 라이브 이미징을 수행합니다. 이 연구에서는, GFP miosin-2및 M-cherihistone을 표현하는 형질 균주에 대한 밀리 리터 로다민 레드-X Succinimidyl 에스테르 당 0.005 마이크로 그램으로 처리 된 비드에서 형광 신호는 너무 약했다.
다른 한편으로는, 밀리 리터 로다민 레드-X Succinimidyl 에스테르 당 5 마이크로 그램으로 처리 된 구슬에서 형광 신호는 너무 강했다. 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 농도는 밀리 리터당 0.5 마이크로 그램으로 이 특정 형질 변형에 최적이었습니다. 라이브 이미징 중에 두 개의 중등골이 수직으로 정렬된 비행기가 확인되었습니다.
이 비행기의 플러스 또는 마이너스 90도 각도를 가진 비행기는 스핀들 평면입니다. 사이토카네시스 후 세포/비드 접촉 인터페이스에 대한 스핀들 방향의 각도는 두 딸 세포가 두 접촉 시야를 통과하는 선에서 비드에 부착되어 접촉 방향으로 사용되었다는 것을 보여준다. 하나는 배아와 계란 껍질이 입 핍펫에 의해 적용 된 특정 외부 힘에 반응하는 방법을 배울 필요가있다.
이론적으로, 모든 세포 반응은 연구될 수 있고, 예를 들어, 황산염 사양은 세포를 배양하고 더 긴 조건에 걸쳐 접착제 구슬과의 접촉에 의해 연구될 수 있다. 이 기술은 접촉 종속 세포 분열 방향 메커니즘을 이해하는 데 사용되었습니다. PTF 필터는 입 핍펫을 통해 하이포염소염 용액의 흡입을 방지하기 위해 사용되었다.
