이 작품은 건강의 뉴욕 국무부 (C026878)에 의해 지원되었다. MS는 뉴욕 줄기 세포 재단 - Druckenmiller 연구원이었다. 천 재단의 3 월부터 연구 기금 5 호 - FY11-571의 일부를 지원.

1. 피더 셀의 준비 아래에 설명 된 모든 시약은 (표 1 및 2 참조) 살균 방식으로 준비해야합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 고환 체세포 세포의 변화를 파생하고 다른 3 설명 된 피더로 JK1 세포주 (셀 Biolabs, 주식회사, 카탈로그 # CBA-315)를 사용하고 있습니다. 모든 동물 절차 기관 지침 및 규정에 따라 수행되어야한다고도합니다. <ol><li> JK1 세포는 문화에 유지 통로 39 성공적으로 피더를 사용할 수 있습니다. 필터 소독 피더 성장 매체 10 ML과 100mm 세포 배양 접시 (BD 팔콘, 카탈로그 # 353003)의 문화 JK1 세포를 (DMEM와 함께 보충 10% 태아 소 혈청 [FBS], 2 MM L-글루타민과 항생제). 문화가 95 %의 합류에 도달하면, 세포에게 1시 6분 -1:10 비율을 분할. </li><li> 합류 JK1 피더 셀 모노에서 매체를 제거합니다층. </li><li> 칼슘, 마그네슘없이 PBS로 한 번 셀 레이어를 씻으십시오. </li><li> 미리 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1X (0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 코닝 Cellgro, 카탈로그 # 25-051 - CI)를 추가하고 37 번 ° C 5-10 분에 품다. </li><li> 피더 성장 매체의 동일한 볼륨과 트립신을 비활성화. 세포를 수집하고 5 분 300 XG에 원심 분리기. 피더 성장 매체에 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 잘 덮어 실온에서 5 분 후 제거하기에 충분한 0.4 % 젤라틴 용액을 추가하여 사전 코트는 멀티도 세포 배양 접시. </li><li> 판 ~ 젤라틴 - 코팅 세포 배양 판에 mm 2 당 250 세포 (예를 들어 48도 또는 6 - 잘 형식). 16-24 시간에 37 ° C에서 문화를 품다. </li><li> 우물에서 문화 매체를 제거합니다. 주의 : 세포 성장을 비활성화로 DMEM에 희석 10 μg / ML에서 미토 마이신-C의 새로운 솔루션을 추가하려면 각도 (예를 들어 200 μl / 잘 48 잘 접시). 미토 마이신-C는 독성이 있습니다. 처리 및 관리와 함께 폐기하십시오. 에 품다37 ° C 4 시간에. </li><li> 세포에서 미토 마이신-C 솔루션을 제거합니다. 도금의 줄기 세포 이전에 DMEM으로 3 번 씻으십시오. </li><li> 피더 세포 우물에서 DMEM을 제거하고 충분한 줄기 세포 매체 (100 μl / 잘 48 잘 접시의, 표 3 참조)을 추가 passaging 동안 피더의 탈수를 방지하기 위해합니다. 피더를 포함하는 우물의 지정된 크기를 사용하여 섹션 3.1 또는 3.4에서 아래에 설명 된대로, 당일 SSCs를 추가합니다. </li></ol> 2. 마우스 Testis 조직의 분리는 기증자 배아 세포를 구하는 <ol><li> 수확 성인 마우스 살균 방식으로 고환 일시적으로 덮인 페트리 접시 (모든 액체없이 추가)에 고환을 저장합니다. dessication을 방지하고 세포 생존 능력을 유지하기 위해 음식은 얼음에 즉시 배치해야합니다. </li><li> ¾ 거리 thr - 무균 고급 집게 및 세포 배양 동네에서 고급 가위를 사용하여 완전히 testis (즉, 잘라 내기 ~ ½를 끊어 버렸네없이 혈관의 albuginea의 가로 절개를ough)과 접시의 코너에 정액을 운반하는 tubules의를 쥐어 짜 집게를 사용하여, 폐기 혈관 및 첨부 조직. 이를 통해 자사의 무결성을 유지하고 증발을 방지 조직은 차가운 유지하기를 통해 얼음 판세요. </li><li> 얼음 판을 유지하면서 빠르게, 봄날의 가위 testis 당 최소 3 분으로 tubules를 이기다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 가느 다란 관 조각을 수집하고 알부민 차가운 PBS / 1퍼센트 소 혈청의 ~ 40 ML에 씻는다. </li><li> 마리의 정자 수야과의 잔해로부터 가느 다란 관 조각을 분리 할 수​​ 10 분 60 XG에 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 분리 버퍼의 testis 당 3 ML (DMEM, 0.05 % 트립신, 0.03 %의 Collagenase 유형 I, 80 U / DNAse I의 ML와 0.5 % 소 혈청 알부민에 펠렛을 resuspend, 표를 참조하십시오 해리 버퍼의보다 구체적인 내용은 2). </li><li> 을 최대화하기 위해 15 분에 37 ° C에서 150 rpm에서에 쉐이커 세트의 랙에 수평으로 원뿔 튜브를 삽입합니다gitation. </li><li> undissociated 덩어리에서 분리 한 세포를 10 분 60 XG에 스핀 다운. </li><li> 다음 단계까지 펠릿이 포함 된 청크를 저장합니다. 단계 2.8에서 표면에 뜨는 수집하고 해리 버퍼를 중화 할 수있는 3 ML DMEM/10 % 태아 소 혈청을 추가합니다. 일시적으로 얼음에 튜브를 삽입합니다. </li><li> 단계 2.9에서 저장 한 환약을 2.6-2.7 단계를 단계 2.8 이후에 남은 재 다이제스트 덩어리에 반복합니다. </li><li> 해리 버퍼를 무력화 DMEM/10 % FBS의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 단계 2.9에서 저장된 세포 현탁액과 단계 2.11에서 재결합 정지. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 고환의 쌍 당 16 ML의 볼륨에서 줄기 세포 매체에 Resuspend 펠릿 (표 3 참조). </li></ol> 3. 고환 세포 현탁액의 도금 <ol><li> 세포 현탁액의 플레이트 2 ML 당 잘에서 6 잘 플레이트 포함 피더 세포 37 &amp;에서 세포 배양 인큐베이터에서 미토 마이신-C, 장소와 mitotically-inactivated℃ 일, C 5 % CO 2. </li><li> 48 시간, 대기음 매체 후, 2 ML 신선한 매체를 추가하고 보육 돌아갑니다. </li><li> 48 시간 후, 각도에 0.5 ML 신선한 줄기 세포 매체를 추가하고 보육 돌아갑니다. </li><li> 48 시간 후, 이후 세포에게 일주일에 세 번 이후로 큰 신중한 식민지 (&gt; 50 세포) (7-21일 이내) 나타날 때까지 다음 먹이를. 매주 먹이 첫 번째와 두 번째 (예 : 월요일, 수요일)에 대한 매체의 ~ 50 %를 제거하고 신선한 매체의 볼륨에 의해 다시 50 %를 추가 할 수 있습니다. 셋째 수유를 들어 (예 : 금요일), 모든 매체를 대기음 2 ML 신선한 매체로 대체합니다. 이 접근 방식은 전체 매체 변화의 소지를 없애기는 문화 매체 9에 숨겨진 paracrine 신호의 농도의 변동을 최소화하는 근거에 기반을두고 있습니다. </li></ol> 4. 제 1 통로에 대한 식민지 따기 <ol><li> passaged 할 우물 포함 식민지에서 미디어를 제거하고 신선한 줄기 세포 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 가 10 배 목표를 사용하여 식민지를 식별합니다. 현미경 약간 드 중심으로 잘의 가장자리에서 SSC의 식민지는 세포부터가 어렵거나 개별 셀 테두리를 판별하는 것은 불가능입니다 많은 11-12 μm의 직경 세포로 구성되어 균일 한 밝은 clumps로 나타납니다 (그림 1A) 융합 나타납니다. 비 SSC 식민지가 뚜렷한 경계 (그림 1A, 삽입)로, 어두운, 더 세분화, 이하 동질 나타날 수 있습니다. </li><li> 50 μl에 pipetteman 세트로, 200 μl 피펫 팁을 사용하여 먼저 우물에서 미디어를지고 끝 오줌에 배출. 그런 다음, 부드럽게 빠르게 팁 (그림 1B)로 흡입하여 식민지를 제거합니다 매체의 50 μl이 박탈되기 전에 끝으로 식민지를 자극. </li><li> 줄기 세포 매체 (그림 1C)의 100 μl로 inactivated 피더 세포를 포함하는 48 잘 접시의 잘 하나에 식민지를 포함하는 매체를 배출. </li><li> 단계를 반복합니다물론 당 500 μl를 초과하지 않고 같은 잘 ~ 8 식민지로 4.3과를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 통과 한 SSC의 식민지로 48 잘 접시의 추가 우물을 준비하는 4.3-4.5 단계를 반복합니다. </li><li> 웰스는 7-14일 또는 최대 500 세포 (그림 1D) 부상하는 큰 clumps 후 분할 할 준비가 될 것입니다. </li></ol> 5. 분쇄에 의한 SSCs의 후속 확장 및 Passaging <ol><li> 통로 한 곳에서 셀은 1시 6분 (매 7 일) 이후에 다음과 같이에 처음 3 구절에 대한 1시 2분의 분할 비율로하고 1시 4분 14 일 이후에 새로운 피더에 최대 subcultured해야합니다. 부드럽게 세포에서 매체를 세정하여 1 ML 피펫 팁을 준 합류 잘 나가지 식민지 (예를 들면 ~ 300,000 SSCs / 잘 6 잘 접시의) 씹다. 식민지는 분리 볼 수 있습니다. 액체의 흐름과 너무 많은 힘이 원치 않는 피더 세포가 너무 내려 와서하게됩니다. </li><li> 300 XG에서 원뿔 튜브와 원심 분리기에 triturated 세포를 수집5 분 거리에 있습니다. 참고 : 탐정이 원하는 경우 trypsinization 단계가 안전하게 여기에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 표면에 뜨는을 대기음 철저히 식민지를 방해하고를 아래로 pipetting하여 신선한 줄기 세포 매체에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 미토 마이신-C와 inactivated 신선하게 조리 된 피더 세포에 판 SSCs는 제 1 절에 설명되어 있습니다. </li><li> 세포에게 주당는 다음 세 번 먹이. 첫 번째와 두 번째 수유를 들어 (예 : 월요일, 수요일) 신선한 매체의 볼륨에 의해 50 %를 추가 할 수 있습니다. 셋째 수유를 들어 (예 : 금요일), 모든 매체를 대기음 2 ML 신선한 매체로 대체합니다. 접시는 7~10일에 합류 될 것입니다. 문화는 체세포의 세포 10 일부터 배아 세포를 구별 할 (예 : 손쥐 세균 세포 마커 GCNA를 사용하여) immunostaining에 따라 5-7 통로 후&gt; 98 %의 배아 세포 (즉, &lt;1 % 오염 체세포 세포)로 구성해야합니다. 참고 :이 방법은 기관에 의해 명시된 규정 및 요구 사항을 준수 개발웨일 코넬 의과 대학에서 알 동물 관리 및 사용위원회. </li></ol>

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MS는 JK1 세포를 배포 할 셀 Biolabs 주식회사에 라이센스를 통해 웨일 코넬 의과 대학에서 로열티를 받게됩니다.

성인 testis-파생 피더 세포를 사용하여 성인 SSCs를 파생를위한이 방법은 강력한이며, 일반적인 유전 적 배경 (예 : FVB, C57Bl6 및 혼합 129SV/C57Bl/6)과 다른 돌연변이 변종이 2,3,7,14을 고용했을 때 성공했습니다. 7 사실, 문화 시스템에 의해 생성 된 microenvironment는 생체에 성인 SSCs를 (- - / 동물 plzf의 경우 등) 유지에 유전 장벽의 일부를 극복하기에 충분합니다...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 코닝 </td><td> 10-013 </td><td> 해리 버퍼에 대한 희석제 </td></tr><tr><td> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Mediatech </td><td> 25-051 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 줄기 세포 기반 매체 (StemPro-34) </td><td> 생명 기술 </td><td> 10639-011 </td><td> Shinohara 외에 따라 보완이 필요합니다. (2003) * </td></tr><tr><td> 셀 중간 보충을 막기 </td><td> 여러 </td><td> 표 3을 참조하십시오 </td><td> Shinohara 외에 따라 보완이 필요합니다. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 세포 </td><td> 셀 Biolabs 주식회사 </td><td> CBA-315 </td><td> 당 Seandel 외 성인용 고환 stromal 세포로 대체 할 수 있습니다. (2007) </td></tr><tr><td> 미토 마이신-C (주의) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M4287 </td><td> 독성, 취급. </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G1890 </td><td> 물에 0.4 % 솔루션 </td></tr><tr><td> EVOS XL 디지털 역 현미경 </td><td> 고급 현미경 그룹 </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 특정 시약 및 장비. * 표 3을 참조 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 코닝 </td><td> 10-013 </td><td> 해리 버퍼에 대한 희석제 </td></tr><tr><td> 트립신 (1:250) </td><td> 생명 기술 </td><td> 27250-018 </td><td> 해리 버퍼 : 0.05 최종 % 중량 / 권 </td></tr><tr><td> collagenase는 235 U / ML을 I를 입력합니다 </td><td> 워싱턴 </td><td> CLS1 235 </td><td> 해리 버퍼 : 최종 0.03 % 중량 / 권 </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigm- 올드리치 </td><td> DN25 </td><td> 해리 버퍼 : 최종 80 U / ML </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> ICP 바이오 </td><td> 입 벌려 - 100g </td><td> 해리 버퍼 : 0.5 최종 % 중량 / 권 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 해리 버퍼 </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> 생명 기술 </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 영양소 보충 </td><td> 생명 기술 </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 요금 ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 가상 비타민 솔루션 </td><td> 생명 기술 </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 이 MM </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> ICP 바이오 </td><td> 벌려! </td><td> 0.50 % </td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic 솔루션 </td><td> Mediatech </td><td> 30-004 - CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) 포도당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G8769 </td><td> 6 MG / ML </td></tr><tr><td> β-에스트라 디올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E2758 </td><td> 30 NG / ML </td></tr><tr><td> progesterone </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 NG / ML </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 변하기 쉬운 </td><td> N / A </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 소 홀로 트랜스페린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T1283 </td><td> 100 μg / ML </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 쌍둥이 바이오 제품 </td><td> 700 112P </td><td> 25 μg / ML </td></tr><tr><td> 인간 GDNF </td><td> 생활 Technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> 인간 bFGF </td><td> 생명 기술 </td><td> PHG0023 </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> 마우스 EGF </td><td> 생명 기술 </td><td> PHG0313 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> putrescine </td><td> 연구 유기물 </td><td> 0778P </td><td> 60 μM </td></tr><tr><td> 나트륨 Selenite </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S5261 </td><td> 30 NM </td></tr><tr><td> pyruvic 산성 </td><td> 알파 Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 μg / ML </td></tr><tr><td> DL-젖산 </td><td> JT 베이커 </td><td> 0196-04 </td><td> 1 μg / ML </td></tr><tr><td> β-메르 캅토 에탄올 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21985-023 </td><td> 50 μM </td></tr><tr><td> 아스 코르 비 산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A4544 </td><td> 100 μM </td></tr><tr> &lt;TD&gt; D-비오틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> B4639 </td><td> 10 μg / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 3. 셀 매체를 줄기 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 참고 : 매체를 사용하기 전에 아래의 보충을 추가합니다. 필터 4 ° C.에 소독 및 보관 매체는 최소 2 주 동안 안정적이다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** 우리는 어떤 명백한 해로운 영향없이 다른 제조업체, 제제 및 / 또는 이러한 시약의 로트 번호를 고용했습니다. 일반적으로 세포 배양 등급 시약을 고용해야합니다. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Spermatogonial 줄기와 testis의 전구 세포는 (SSCs) 성인 포유류의 줄기 세포의 고전적인 예를 나타냅니다과 동물의 거의 평생 불임을 보존 할 수 있습니다. 생체에 자기 갱신과 차별화에 적용되는 정확한 메커니즘은 연구에 도전하고 있지만, 다양한 시스템은 전문 문화 미디어 및 1-3 피더 세포의 조합을 사용하여 체외에서 손쥐 SSCs를 전파하는 이전에 개발되었습니다. SSCs의 생물에 체외 forays의 대부분은 성인 세포 라인에게 4 취득의 어려움으로 인해 neonates에서 세포 라인을 도출했습니다. 그러나, testis는 대부분의 마우스 변종에 세 ~ 5 주가 지나야까지 성숙을 계속하고 있습니다. 초 후 산후 시대에는 극적인 변화가 testis의 아키텍처와 체세포와 많은 줄기 세포 관련의 표현 수준의 변경 등의 spermatogenic 세포, 모두의 생물학에서 발생유전자. 따라서 neonatally - 파생 SSC 라인이 완전히 성인 testis가 정상 상태에 도달 한 후 계속 성인 SSCs의 생물학을 요점을 되풀이하지 않을 수 있습니다. 여러 가지 요인이 역사적으로 성인 SSC 라인의 생산을 방해하고 있습니다. 첫째, 기능 줄기 세포의 비율은 고유 또는 외부 요인으로 인해 5,6하거나, 성인기 동안 감소 할 수 있습니다. 또한, 다른 성인의 줄기 세포와 마찬가지로, 그것은 immunoselection 또는 다른 정렬 전략 7의 조합을 사용하지 않고 전체 성인 고환 세포에서 충분히 SSCs을 풍요롭게하기 어려운되었습니다. 일반적으로 고용 전략은 다른 세포 유형 8 줄기 세포의 높은 비율로 인해 공여 세포의 원천으로 cryptorchid 마우스의 사용을 포함합니다. 초기 문화의 체세포 세포의 제거는 SSC의 생존에 필수적인 줄기 세포 틈새와의 상호 작용을 방해하는 가설을 바탕으로, 우리는 이전에 성인 리터를 추출하는 방법을 개발immunoselection 또는 cryptorchid 기증자를 필요로하지만, 오히려 문화에 SSCs의 일련 농축을 채용하지 않는 아이 네스는 SESC 2,3로 이하라고. 아래에서 설명하는 방법은 고환 stromal 세포 라인 (JK1) 3으로 구성 피더에 대한 세포의 도금에 이어 성인 기증자 정액을 운반하는 tubules를 dissociating하여 성인 SSC 라인을 파생하는 간단한 절차를 수반. 시리얼을 통해 비 배아 세포를 오염, 강하게 자기편, passaging 것은 SSCs의 수반하는 농축과 문화의 고갈됩니다. 이러한 방식으로 생산 문화는 장기적으로 자기 갱신 능력에 따라 SSCs를 포함하는 차별화의 다른 단계에서 spermatogonia의 혼합물을 포함합니다. SESC 방법의 요점은 그것이 근본적으로 다른 microenvironment의 체외에서 장기간 자기 갱신에 생체의 자기 갱신의 어려운 전환을 할 SSCs 수 있다는 것입니다, 오염 무료, 장기 SSC 라인을 생산체세포의 세포, 그리고이를 SSCs의 후속 실험 조작을 할 수 있습니다.

통로 제로 야생 타입의 외관, 7 일 후에 성인 SSC의 식민지는 그림 1에 표시됩니다. 입체 식민지가 상단에 성장 SSCs의 여러 레이어와 피더에 의해 증착 모이통 또는 부하 세포 외 기질에 부착 된 평면 세포의 층으로 구성되어 있습니다. 건강한 SSCs는 밝은 refractile하고 균일 11-12 μm의 직경 있지만, 셀 테두리는 구분하기가 어렵 있으며, 콜로니의 크기가 아니라 내에서 서로 다른 생쥐에서 ...

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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 - 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.

장기 성인 마우스 SSC 라인의 유도를위한 문화 Spermatogonial 줄기 및 전구 세포의 일련 농축 (SSCs)

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

13.7K 조회수.  Weill Cornell Medical College. 성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 - 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

연구

생물학

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...