Name: in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow
Uploaded: 2014-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow at JoVE.com

영상은 박사 마틴 Spitaler에 의해 관리 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 FILM 시설 내에있는 수직 라이카 SP5 공 초점 현미경을 실시 하였다. 시편 홀더와 헤드 피스는 사무엘 존스 박사 사이먼 슐츠의 조언과 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 화학 공학과와 공동으로 이루어졌다. 니콜라 Ruivo, 시스코 디아즈와 임페리얼 칼리지에서 CBS 직원은 마우스 사육에 자신의 지원과 조언을 쓸모 있었다. 마크 스콧 CRUK, KKLF, BBSRC 및 HFSP에 의해 CRUK와 크리스티나 소호되었습니다 Celso에 의해 HFSP 및 FILM, Olufolake Akinduro에 의해 투자된다.

동물의 사용과 관련된 모든 절차는 로컬 법에 따라 수행된다. 우리의 연구는 영국 홈 오피스뿐만 아니라, 임페리얼 칼리지 윤리적 검토 패널에 의해 승인되었습니다. 허용되는 절차는 프로젝트 라이센스 문서에 설명 된 모든 시간에 동물의 복지를 보장 지침을 준수하고 있습니다. 작업이 수행되는 나라의 동물 실험에 대한 법률을 준수해야합니다. 1 레이블과 HSPCs 사출 : <ol><li> 소호되었습니다 Celso 14 ~ 15에 의해 설명 된대로 수확 세포. </li><li> PBS에 10 6 세포 / ml의 농도로 세포를 준비한다. NOTE : 세포를 세는 혈구 또는 셀 소터에 의해 제공된 정보를 사용하여; 표지와 주입되는 셀의 수는 (20,000 - 조혈 모세포, 100,000 - 10,000 예컨대 얼룩 300,000의 HPC)를 세포 종류에 따라 다르며 이하 10 5 세포, PBS 100 ㎕에 재현 탁 작업하는 경우; 혈청 얼룩을 억제로는, 임의의 혈청없이 PBS에서 세포를 갖는 것이 중요하다. </li><li> 5 μM의 최종 농도에서 세포 현탁액에 않았고 용액으로부터 석출 셀 라벨을 실패하지 않는 염료를 보장하기 위해 현탁액을 즉시 와동 추가한다. </li><li> 5 분 동안 500 XG에서 회전 액체를 경사 분리 및 IV 주입 (- 150 μL ~ 100)에 적절한 볼륨의 펠렛을 재현 탁하여 세척 한 후 37 ° C에서 10 분 동안 품어 </li><li> 200 ㎕의 PBS에 재현 탁하고 세포를 인슐린 주사기에 수집한다. 참고 : 마우스로 전체 세포 현탁액을 관리 할 수​​ 있으므로 더 바늘 죽은 공간이 없으며 때문에 인슐린 주사기는 기존의 주사​​기를 통해 권장합니다. </li><li> 꼬리 정맥 주사를 통해 치명적으로 조사 된 마우스로 세포를 주입한다. 주 : TI를 통해 개발 골수 미세 환경 (조혈 및 기질 구성 요소를 모두)에 대한 조사 알려져있다 상당한 영향나. 그것은 일관된 사출 용 타이밍, 셀 주입 (최상 생착 대한 조사에서 4-24 시간) 및 이미징을 유지하는 것이 매우 중요하다. 여기 조사는 주입 전에 6 시간을 수행하고 영상은 주사 후 20 시간 수행됩니다. <ol><li> 꼬리 정맥이 vasodilated 나타날 때까지 따뜻한 챔버 (37 ° C)에 마우스를 놓습니다. </li><li> 제한 수단으로 마우스를 이동 조심스럽게 꼬리 정맥에 바늘을 밀어 넣습니다. </li><li> 정맥에 세포를 주입 - 주입에 아무 저항이 발생 될 수 없습니다. </li><li> 세포가 골수 스페이스로 이주 할 수 있도록하기 위해 마우스 O / N을 남기기. </li></ol></li></ol> 2 이미징을위한 마우스 준비 <ol><li> 미세 겸자 일쌍 한 미세 쌍이 위뿐만 아니라 멸균 환경에서 사용하기 전에 헤드 피스 및 저장소를 압​​력솥. </li><li> 가능한 한 신선한로 마취​​를 확인 (0.38 ML 케타민 + 0.25 ㎖의 Medetomidine + 4.47 ㎖의 물). 참고 : OT이소 플루 란 등의 주사를 포함하여 그녀의 승인 마취제은 너무 유효합니다. 1 시간마다 45 분 관리 50 μL - 설명 칵테일 (30)의 상단 업으로, 체중 10g 당 0.1 ㎖의 복강 내 투여한다. </li><li> 필요한 경우 메시지가 표시되면 다음 단계를 교정, 현미경 및 소프트웨어를 시작 두 광자 레이저에 전환합니다. 레이저에 전환하고 워밍업 및 이미징을위한 마우스를 준비하는 동안 안정화 할 수 있습니다. </li><li> 복강 내 주사를 통해 선택된 마취 용 준비 마취 혼합물 (단계 2.2)를 사용하여 마우스를 마취. 현재와​​ 프로토콜에 걸쳐 정기적으로 페달 반사를 통해 깊은 마취의 발병을 모니터링합니다. 참고 : 마우스가 절차를 통해주의 깊게 모니터링하고 마취가 경감 될 나타나는 경우해야 - (2.2에서 설명하는대로) (일반적으로 +45 60 분) 후 최고 최대 용량을 관리 할 수​​ 있습니다. 다양한 연령과 성별의 쥐 사이에 어떤 변화를 기대합니다. 그것은 떠오입니다적절한 예방 조치를 확인하기 위해 해당 지역의 수의학 담당관 마취 프로토콜을 논의하기 위해 TANT은 마우스의 복지를 보장하기 위해 가져옵니다. </li><li> 마우스의 눈에 들어 에탄올을 얻을 않도록하면서, 조직에 70 % 에탄올로 두피의 상단 면봉. </li><li> 멸균 된 핀셋 및 가위를 사용하여, 신중하게 묘화 될 수있는 두 개관 영역을 노출하는 두피 중앙부를 제거 포셉 피부를 올려 귀 사이의 후두부에 작은 절개를. 피부를 잡고있는 동안, 피부 아래에 가위를 밀어 부드럽게 원하는 이미징 영역의 바깥 쪽을 따라 절단. </li><li> 습기를 유지하기 위해 멸균 PBS에 적신 멸균 면봉 노출 된 뼈를 닦습니다. </li><li> 이미징을위한 준비 마우스의 두개골 금속 헤드 부분을 연결합니다. <ol><li> 이 페이스트가 될 때까지 계량 보트 치과 용 시멘트를 적당량 혼합하고 빠르게 S에 부착된다 헤드 피스의 저면에 적용컬 소장. </li><li> 시멘트 설정하기 전에, 다음, 확인 이미징 영역에있는 모든 치과 시멘트 묻지 않도록하고, 마우스의 두개골에 투구 배치가 설정 될 때까지 기다립니다. </li><li> 두개골 촉촉한 유지 사이트 내 히드로 겔의 작은 금액을 적용합니다. </li></ol></li><li> 홀더에 헤드 피스를 부착하고 홈이 홀더의 홈에 맞춰 보장, 나사를 사용하여 제자리에 고정합니다. </li><li> 현미경으로 전송하기 전에 멸균 PBS로 멸균 면봉 두개골 깨끗한에서 하이드로 젤을 제거합니다. </li><li> 현미경 단계에 홀더를 삽입 마우스 아래에있는 난방 매트를 놓고 직장 온도계 프로브를 삽입하고 접착 테이프로 무대에 장소에 모든 것을 고정합니다. </li><li> 그들이 마취에서 동안 건조하지 않도록 마우스의 눈에 안과 연고의 작은 방울을 놓습니다. 참고 : 마취 상태에서 마우스 이미징 프로세스 중 언제라도 방치하지 마십시오. </li></ol>생체 이미징 : 고해상도 스택 및 시간 경과 취득 <ol><li> 눈 조각을 통해 두개골에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> , 정제, 멸균 물과 물 침지 렌즈를 사용하여 이미지 창을 채우기는 물방울 닿도록 내려 놓습니다. </li><li> 광원으로서 외부 램프를 사용하여, 현미경 접안 렌즈를 이용하여 두개골 위에 초점. </li><li> 중앙 봉합에 촬상 영역을 배치하고 시작 위치로서 코로나 봉합사를 찾는 헤드의 후방을 향해 이동한다. </li></ol></li><li> 여기 및 발광 표에 지정된 해당 형광체의 유효 여기 및 검출을 허용하도록 현미경을 설정한다. 참고 : 기존의 검류계 스캔 헤드가 LAS-AF 소프트웨어 플랫폼을 실행하는 라이카 SP5 똑바로 공 초점은 여기에 사용되는 반면, 프로 시저가 쉽게 다른 현미경 / 소프트웨어 플랫폼에 복제 할 수 있습니다. 여기에 사용되는 렌즈는 라이카 HCX IRAPO L 25X W / B를 0.95 NA이며다른 제조사의 유타 해당하는 렌즈는 적절한 배율과 높은 NA 사용할 수 있습니다 <ol><li> 512 X 512 픽셀로 모두 XY 이미지뿐만 아니라 400 Hz에서 3D Z-스택 및 설정 이미징 속도와 해상도를 캡처 모드로 소프트웨어를 놓습니다. 참고 : 설치 및 하드웨어는 여기에 620 μM의 시야 결과이 다른 플랫폼과 다를 수 있습니다. </li><li> 다중 채널 / 트랙뿐만 아니라 수집 방법은 적어도 스택 가능한 경우 또는 프레임들 사이의 설정을 변경하는 설정되도록, 포착 될 수 있도록하는 소프트웨어를 설정한다. 각 스택의 취득의 끝에 레이저 조명을 끄, 세 독립적 인 캡처 설정을 설정한다. 참고 : 세 개의 채널 채널 사이의 크로스 토크를 줄이기 위해이 절차를 위해 필요합니다. </li><li> 설정이 광자 SHG 뼈 신호 (840 nm의 여기, 400-440 nm의 발광)를위한 제 순차 스캔 설정; MP 레이저에 셔터를 열고 M을 보장25 % 및 레이저가 켜진다 - P 이득 및 오프셋이 올바르게 설치하고, 레이저 파워는 12.5이다. 유일한 검출기 등의 적절한 PMT를 선택하고 색상을 흰색으로 변경합니다. 참고 : 사용할 수있는 밝고 깊은 신호를 달성하기 위해 적절한 때 필터 NDD 감지기는 뼈 검출을 위해 사용되어야한다. </li><li> 반복 채널 설정 결합 된 형광도에 대한 GFP 채널에 사용되는 절차 (543 nm의 여기, 560 - 600 ㎚ 방출) 및 DID (633 nm의 여기, 650-720 nm의 방출) 초 설정에서 두 적절한 PMT가를 활용하여 스캔 할 수 있습니다. 자가 형광 녹색, DID 빨간색으로 채널의 색상을 변경합니다. 참고 : 자동 형광 채널이 두 채널 오버레이 아르 DID 양성 세포를 쉽게 감지 할 수 있습니다 녹색으로 사용 - autofluorescent 세포 인해 두 채널의 동안 것에으로 노란색 / 오렌지색으로 표시했다 세포는 그들이 단지에 표시하기 때문에 빨간색으로 표시 채널을했다. 자동 형광 채널표시 목적은 GFP 채널과의 혼동을 피하기 위해, 사용자에 대해, 이것은 다른 컬러로 변경 될 수 있지만하고자하는 경우에만이 비교를 위해 사용되는 모든 최종 분석에 사용되지 않는다. </li><li> 마지막으로, 설치 GFP의 세 번째이자 마지막 스캔 (488 nm의 여기, 500-530 nm의 방출); 필수 후 약 15 %의 488 nm의 레이저 라인의 레이저 파워를 설정하거나 레이저 적절한 수준이 활성 검출기로서 적절한 PMT를 선택하고 녹색에 그 의사 색조를 변경, 사용되는 경우에 셔터가 개방되어 있는지 확인. </li><li> 선택된 채널의 미리보기 스캔을 시작하고 검출기 이득을 조정하고 최적의 노출을 상쇄하기 위해 &#39;라이브&#39;영상 모드를 활성화합니다. 연속 창에서 각 스캔에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 쉽게 다시 이러한 멀티 채널 스캔의 설정을 저장합니다. 참고 :이 사용자가 이후 세션의 설정을 다시로드 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> &#39;마크라고도 다중 위치 캡처, 활성화차 입증 된 소프트웨어에서 &#39;찾아 좌표 점을 다시 설정합니다. </li><li> 중앙 및 관상 봉합의 교점에서 시작하여 뼈 촬상 영역을 스캔, 모두 자기 형광을 이용하여 골수 영역의 깊이를 스캔 (의사 녹색 컬러) 및 DID (의사 컬러 적색) 복합체보기. 참고 : autofluorescent 세포는 두 채널 모두에 존재하고 표지 세포가 합성 이미지 빨간색 전용 세포로 나타납니다 않은 반면, 합성 이미지에 노란색 / 오렌지 나타납니다. </li><li> 셀이 감지되면 마크 &quot;의 왼쪽에 새로운 위치 아이콘을 추가&quot;찾기 &quot;창을 클릭하여 도구를 새로운 좌표 위치 (X, Y 및 Z)로이 마크 &#39;마크와 찾기&#39; . </li><li> 뷰의 현재의 필드가 검토 된 경우, 왼쪽 / 오른쪽 / 위 / 아래 어느 뷰의 하나의 필드의 무대에게 거리를 이동합니다. 서서히 번째의 좌측 전체 촬상 창 주변 작동 뷰의 각 필드에 대해이 과정을 반복전자 중앙 봉합, 마우스의 코쪽으로 이동. 중앙 봉합 분기점 광경되면 봉합사의 우측으로 이동하여 (코로나 봉합을 향해, 즉 &#39;) 반대 방향으로 좌측 스캔 절차를 반복한다. 사용하여이자의 새로운 세포의 좌표 마크 &#39;표시를하고 찾기&#39;도구를. </li><li> 촬상 화면의 주사가 완료되면, &#39;마크 및 찾기&#39;를 사용하는 점을 검토 툴 (원하는 지점을 선택하고 개별적으로 각 점을 검토). 각 위치에 대한 각 셀 주위에 Z-스택의 상단과 하단을 설정, (많은 소프트웨어 플랫폼은 빈 공간을 캡처 감소 각 위치에 대한 독립적 인 Z-스택을 수행 할 수 있습니다). 각 지점의 경우, 최대 초점을 아래로 3D Z-스택 캡처 상단과 하단 Z 위치를 설정하고의 개별 지점을 업데이트 &#39;마크와 찾기&#39;. 도 5μm에 Z-스택 간격을 설정하고 적절한 품질에 대한 각 순차 스캔 채널에 대한 평균 : 라인 오R 프레임 평균. NOTE : 평균 스캔 할 수 늘리기가 획득 시간을 증가시킨다. </li><li> 전체 스캔 절차를 시작하여 관심있는 각각의 점에 대한 높은 품질 기준을 획득 스택 (종종 오히려 &quot;캡처&quot;보다 &#39;시작&#39;이라 함). 참고 :이 검사는 미래 고속 이미징에 대한 기준 역할을 할 수 있습니다. </li><li> 일단, 고품질의 스캔으로 완성 캡처 저속 설정을 활성화. </li><li> 저속 설정에서 원하는 길이 (예를 들어, 5 시간)으로 5 분, 전체적인 실행 시간에 시간 간격을 설정한다. 전체 스캔 이러한 설정을 &#39;적용&#39;. 주 : 5 분의 시간 경과 간격을 허용하기 위해이 검사 시간을 줄이기 위해, 한 평균화에 사용되는 스캔의 수를 줄일 512 X 512 픽셀의 해상도를 제한 할 필요 위상 정정 (양방향으로 스캐닝을 변환 할 필요가있다 ) 모두 스캔 방향을 정렬 및 / 또는 600 Hz에서 이상 (600 개 이상으로 스캔 속도를 증가Hz에서)를 보여 소프트웨어 플랫폼에 대한 이미징 영역의 확대의 원인이됩니다. 이것은 순차 촬상 모드가 초기 고화질 화상 스택을 획득하기 위해 사용되는 동안, 동시 취득이 경과 촬상 중에 속도를 증가시키는 데 사용된다는 점에 유의하는 것이 중요하다 -이 추가 배치 채널간에 약간의 혼선이 발생할 수있다 정확하게 분리 참조 스택의 초기 캡처에 대한 중요성. </li><li> (입증 된 소프트웨어의 &#39;시작&#39;버튼을 클릭하여 이전) 이미징 시작. 참고 : 건조하고 활력 징후 및 난방 패드의 온도를 모니터링하지 않습니다 정기적으로 필요할 때 마우스를 과잉 섭취하지 않도록주의, 더 작은 용량을 투여하여 마취의 적절한 수준을 유지 목적을 보장하기 위해 물을 위로해야 전역. </li><li> 완료되면, 직장 프로브와 시간에서 와이어를 보장 홀더에서 렌즈를 인상 한 후 현미경 스테이지에서 홀더를 제거매트를 먹는 것은 손상되지 않습니다. </li><li> 무대 홀더에서 투구를 풀고 조심스럽게 마우스를 제거합니다. 자궁 전위를 사용하여 마우스를 추려 두개골 떨어져 끼워 금속 머리 조각을 제거합니다. 디스크에 데이터를 저장하고 나중에 분석을 위해 서버로 전송합니다. 참고 : 머리 조각이 이상적으로 몇 시간 동안 아세톤에 침지 마지막 잔여 시멘트 오프를 문질러 청소한다. </li></ol>

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There is nothing to disclose.

무엇을 성취했다? 프로토콜은 마우스 두개골 골수 정제하여 FACS의 이주, 생체 표지, 이식 HSPCs을 모니터링 경과 다차원 이미징을 사용한다. 하나의 이식 세포의 확인이 달성되었고, 이러한 고정밀 시간 (시간)의 장기간에 걸쳐 모니터링 하였다. 호흡에 의한 움직임 아티팩트는 최소화하고 세포를 반복적으로 오랜 시간에 걸쳐 이미지를 다시하고있다. 향후 방향은 무엇입니까? 기술의 발전은 단축과 주 (마우스에 대해 복구 프로세스를 단순화하기 위해 주 이상 및 이소 플루 란과 같은 가스 마취제의 사용 과정을 통해, 여러 날 촬상 있도록 회복 실험 진전 수 : 회복 실험이 엄격하게 필요 무균 수술 조건으로 적절한 진통제의 투여). 데브생체 염료의 큰 컬러 팔레트뿐만 아니라, 또한, 멀티 - 표지 실험을 용이 골수 내의 세포 - 세포 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공하고, 미래에 더욱 복잡한 실험 허용 조혈 세포의 효율적인 유전자 표지의 elopment. 또한, 다수의 골수 구조 및 기질 성분의 동시 라벨링 HSPC 틈새에서 발생하는 이벤트의보다 완전한 화상을 제공 할 것이다. 시간 경과 영화 이미지 안정성은 현미경을 안정화뿐만 아니라, 상기 이미지 정렬 알고리즘을 사용하여 샘​​플과 postacquisition에서 온도 구배를 최소화함으로써 preacquisition을 향상시킬 수있다. 제한 사항 : 설명이 기술은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 주 사용 마취제의 투여 후 쥐의 생존은 예측 불가능하며 개별 응답에 따라 경험 합병증에 매우 쉽습니다마취. 마우스를 마취로부터 회복하고 마우스 이상적 시간 경과 영상의 재생 시간을 제한하는, 복구 할 경우주의 깊게 계획하는 것이 중요하다 위해 일반적으로 촬상 세션 이상 어렵게이다. 주 사용 마취제의 사용은 각 이미징 세션이 지속될 수있는 시간을 제한한다. 이 마취제의 작은 투여하여 마취 readministering을 연장하는 것이 가능하지만, 그것은 어려운이 정확하고 마우스를 과잉 투여하는 것은 생체 내 이미징의 조기 종료의 가장 흔한 원인 중 하나로 수행된다. 이소 플루 란의&gt; 2 시간 오랫동안 관리가 거의 성공 후 가스 마취 마우스 그러나 빠른 회복, 적은 독성이 더 긴 초기 이미징 세션 수 있습니다. 또 다른 기술의 한계로 인해 급속하게 이미지를 수집 할 필요성으로, 다점 경과 촬상 동안 얻을 수있다 화상의 해상도가 제한된다. 초점 드리프트 또는 필드 결합이, (디스크 점프) 위 ussed, 세포의 추적을 어렵게 만들 수 있습니다. 다른 방법과의 비교 : HSPCs는 일반적했던 친 유성 염료로 표시되어 있지만, [16]에서 검토로 DIR 및 DII 염료는, 대신 할 수있는 대체 및 다른 세포 염료만큼 충분히 밝은 사용할 수 있습니다. 세포의 체외로 라벨링이 조혈 모세포의 장기 기능에 영향을주지 밝혀졌다 않았지만, 그것은 세포 분열에 희석 DID 제한 (또는 다른 화학적 염색)를 갖는다. 조혈 모세포 이식 후 처음 일 동안 증식 때문에, 이러한 셀들에 대한 신호 대 잡음비가 급격히 저하된다. 유전자 조작 및 형광 단백질의 발현에 의해 세포의 내생 라벨링 형광 단백질 두개골 뼈를 통해 검출 신호를 생성하기에 충분히 높은 수준으로 발현되는만큼, 대안 방법이다. 대안 TECHN에는 여러 가지가 있습니다사용할 iques 자신 장점과 한계, 골수 공간 내 각 HSPCs의 촬상을 수행한다. 공 촛점 이미지는 외과 드릴 경골 뼈 에나멜 얇아 수술 노출을 따르면서 광섬유 기반 이미징 장치의 삽입은, 긴 뼈 [8]에서 골수 재구성의 촬상 허용 [12] HSPCs가 거주의 상세한 이미지를 생성 긴 뼈의 주연 영역. 그러나 이러한 방법은 훨씬 더 침습적 여기서 설명과 동일하므로 마우스 내의 동일 골수 영역에 초점을 촬상 세션을 반복하도록 허용하지 않는 한보다. 또한, 이들 기술은 주변 조직에 큰 손상을 피할 응답 주어진 관찰 세포에 영향을 미칠 수 있다는 것이 가능하다. HSPCs은 절제, 골절 된 대퇴골 [11] 위에 배치 된 커버를 통해 짧은 시간 동안 묘화되어, HSPCs에 조직이 거칠고 준비하지만 영향 클레아 아니다R 및 기술은 하나의 시점에 관찰을 얻기 위해 고유 사용 하였다. 고정 뼈 염색, 직렬 섹션으로 절단하고, 얻어진 화상이 혈관 캐스트가 사용되는 특히 우수한 3D 해상도를 제공하는, 3 차원 모델로 재구성되었다 [17], 최근에는 레이저 스캐닝 세포 계측법 (LASC) 정량적 얻기 위해 사용되었다 현장에서 HSPCs에 대한 조치는 [18] 면역 염색에 의해 강조하지만, 세포의 행동에 대한 시간 정보를 제공 할 수 없습니다. 이 새로운 기술에 설명 된 기술들은 4d에 셀을 모니터링하는 차원에서 양호한 해상도, 충분한 시간적 샘플링의 조합을 제공하고 따라서 골수와 상호 작용 HSPCs 장기간 모니터링을 달성하기 위해 적합한 방법을 제공하고, 상대적으로 비 침습 미시.

줄기 세포 틈새는 후각 망울, 근육 섬유, 모낭 돌출 또는 CNS 뇌실 영역 4-7로 수십 세를 인정하고 잘 많은 조직에서 특징졌습니다에도 불구하고, 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 및 골수 미세 환경 사이의 상호 작용 ( BM)은 여전히​​ 좋지 의한 직접 뼈를 통해 단일 ​​세포뿐만 아니라 조직 자체의 유체 극히 자연 관찰의 어려움으로 이해된다. 이는 다른 세포 유형 및 규제 신호의 복잡한 네트워크가 정지 사이의 정교한 균형을 조절하는 책임이 있는지, 절제 또는 조혈 모세포 또는 미세 자체의 간질 세포 중 특정 유전자를 과발현에 기초한 기능적 많은 연구를 통해 밝혀졌다 , 증식, 확장 및 조혈 모세포 1-2의 차별화. 조혈 모세포와 그 틈새 사이의 크로스 토크는 직접 관찰을 통해 깊이 이해 될 수있다. 이 ACH입니다뿐만 현미경의 관점에서 가능한 기술을 조합 한 고급 이미징 프로토콜 개발 ievable 덕분뿐만 아니라 시편 홀더 솔루션 및 수집 소프트웨어. 마우스의 두개골 뼈의 BM 실에서 이식 된 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 단일 셀 해상도 라이브 영상은 engrafting의 HSPCs 더 미성숙 세포 SDF-1, VCAM-1 양성 혈관 8-9의 근접 것을 지역화 것으로 나타났다 자신의 자손이 10보다 원위부 동안 GFP 양성 골아 세포 (조골 세포 제한 콜라겐 1α 프로모터는 GFP 발현을 구동하는 Col2.3-GFP 유전자 변형 마우스 라인)에서 20 미크론 - 15 내에서 발견된다. 유사 관찰 해부 및 뼈 골절 된 대퇴골 (11)로부터와 박형화 tibeal 뼈 (12)로부터 수득 하였다. 개관 골수 내 이미징 번째 HSPCs 직접적인 시각화를 달성하기 위해 최소 침습 접근 남아EIR 기본 미세. 모든 살아있는 검체 이미징 인해 샘플 불필요한 움직임 아티팩트를 회피 할 수만큼 샘플을 여전히 유지하는 고유의 필요성이 존재한다. 호흡 개관 골수 촬상시 회피해야 마우스 헤드의 진동 운동을시킨다. 그들은 정면 뼈를 방해하기 때문에 뇌 영상 및 전기 생리학에 대한 예를 들어 사용되는 기존의 정위 홀더, 두 개관 영상에 적합하지 않습니다. 라이브 영상과 전기 생리학 연구 13시 고통을 최소화 할 마우스 홀더부터는 두 성분 홀더와 고정하거나 보장 큰 아암에 연결된 촬상 윈도우를 생성하는 마우스의 머리에 고정 작은 조각으로, 개발 현미경 단계에 단단히 고정 무거운베이스 플레이트. 여전히 제자리에 헤드를 고정화하고 적절 m을 제거하면서 마우스 두개골에 머리 부재를 고정하는 자유를 허용 호흡호흡에 의한 ovements. 홀더 본체에 헤드 부분을 연결하는 A &#39;로크 및 키&#39;기구는 윈도우의 크기가되므로 수술을 간소화, 측위 정밀도가 향상뿐만 아니라 최소로 할 수 있도록하고, 스테이지에베이스 플레이트의 착용감 현미경에 대한 정확한 정렬 할 수 있습니다. 세포 운동성을 정확하게 모니터링하기 위해, 멀티 - 포인트 시간 경과 프로토콜은 시점 ​​간 5 분 간격으로 시간이 지남에 따라 세포의 추적을 할 수 있도록 설계되었다. 여기에, 표시 DID 조혈 모세포는 col2.3GFP의 osteoblasitc 기자 마우스 10, 14에 주입 약 20 시간 후 몇 군데 있습니다. 디자인 된 여러 시간에 걸쳐 동일한 부분을 신속 다점 경과 이미징을 수행하는데 필요한 촬상 설정을 상세하게 설명한다 마우스 홀더.

<table><tbody><tr><td>Ketamine (Narketan 100 mg/ml)</td><td>Vetoquinol</td><td>407575 0107 C</td><td>Other anesthetics may be used in place of this.</td></tr><tr><td>Medetomidine (Domitor 1 mg/ml)</td><td>Elanco</td><td>134800-2</td><td>Other analgesics may be used in place of this.</td></tr><tr><td>Vibrant DiD cell labeling solution</td><td>Roche Products Ltd.</td><td>V22887</td><td>Other colors are available and may be used if required.</td></tr><tr><td>Lacrilube ophtalmic ointment</td><td>Allergan</td><td>n/a</td><td>avaliable by prescription by the local vet</td></tr><tr><td>Kemdent &quot;Diamond Carve&quot; glass ionomer cement</td><td>Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td><td>SUN527</td><td>We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>multiple equivalent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>SS10M3109</td><td>1 ml, 31 G</td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>340031</td><td>Cone type (small)</td></tr><tr><td>Autoclaved forceps and scissors</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT577&lt;br/&gt; AGT5034</td><td>Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip)</td></tr><tr><td>Weigh boat and cement stirrer</td><td>VWR</td><td>611-1996/231-0370</td><td>5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td></tr><tr><td>Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Call for quote</td></tr><tr><td>25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506323</td><td>HCX IRAPO L lens</td></tr><tr><td>Custom designed mouse holder</td><td>Imperial College Engineering Workshop</td><td></td><td>See Figure 1 for details</td></tr><tr><td>Heating pad with rectal thermometer probe</td><td>BASi Instrumentation</td><td>FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td><td>Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td></tr></tbody></table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

정지 및 증식, 자기 갱신과 차별화 된 자손의 생산 사이의 미묘한 균형을 통해 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는 모든 성숙한 혈액 세포 계통의 매출을 유지한다. 특정 HSC 운명에 이르는 복잡한 신호의 조정은 조혈 모세포 아직도 제대로 이해하는 복잡한 골수 미세 환경, [1-2] 사이의 상호 작용에 의존한다. 우리는 다단계 촛점 및 생체 영상 기술의 이광자 안정된 동물 포지셔닝 새롭게 개발 시험편 홀더를 조합함으로써, 높은 해상도 3D HSPCs 함유 스택 및 그 주변 틈새를 수득하고 시간이 지남에 따라이를 모니터링 할 수있다 방법을 설명 멀티 포인트 시간 경과 영상을 통해. 고화질 영상은 검출 생체 표지 조혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)가 골수 내에 거주 할 수 있습니다. 또한, 멀티 포인트 시간 경과 3D 이미징, 오빠른 취득 설정 btained, HSPC 운동과 HSPCs 간질 세포 사이의 상호 작용에 대한 정확한 정보를 제공합니다. GFP 긍정적 인 조골 세포 관련 HSPCs의 추적이 방법의 예시적인 응용 프로그램으로 표시됩니다. 이 기술은 두 개관 마우스 골수 공간 내에서 관심있는 적절히 표지 된 기질 또는 조혈 세포를 추적하는 데 이용 될 수있다.

만든 사용자 정의는 두 개관 영상 창을 포함하여 고정밀 마우스 홀더는 치명적으로 조사받는 마우스 (그림 1A)에 주입 FACS 정제, 표시 HSPCs의 장기 이미징을 할 수 있습니다. 일반적으로 15 사이의 주사 후 - 천 (20) 레이블 세포, 8-15 세포는 두개골 다음 일의 골수 이미징 영역 내에서 일반적으로 인식 할 수 있습니다. 확인 된 HSPCs (그림 1C 및 동영상)의 4D 시간 경과 영화 다음 120 μm의 두께 (그림 1B) - 여기에는 약 90의 골수 영역을 HSPC이 함유 단일 셀 해상도 3D 스택을 취득하는 방법에 표시됩니다. 치과 용 시멘트가 최적으로 제조되지 않은 경우 차선의 결과는, 예를 들면 물과는 홀더의 상부로부터 얹어 될 수 있더라도, 비 밀봉 영역으로부터 누출 수 얻어지는, 시간의 기간이되는 렌즈를 침지되지 않는다 물에 검은 색 F 리드<html> rames. 이미지의 일부 드리프트 갑작스런 점프 선도 그러나 그것은 마우스 프로그레시브 박리로 이어지는 차선 시멘트 밀착성 의해 지기도하고, 설정된 촬상의 섭동에 의해 수 인해 마우스 홀더의 재료의 열팽창에 불가피 시간 경과 이미징 동안 초점. 이전에 몇 군데 위치를 다시 방문 할 때 멀티 포인트 시간 경과 이미징 동안 드리프트는 무대의 움직임에 부정확 발생할 수 있습니다. 시간 경과 영화 드리프트와 더듬 유물 이미지 등록 알고리즘을 사용하여 보정 할 수 있습니다. 표 1 여기 및 방출 설정. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> 컬러 채널 </td><td style="width:213px;"> 여기 </td><td style="width:208px;"> 방출 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm의 </td><td style="width:208px;"> 500-530 nm의 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> 자기 형광 </td><td style="width:213px;"> 543 nm의 </td><td style="width:208px;"> 560-610 nm의 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DID </td><td style="width:213px;"> 633 nm의 </td><td style="width:208px;"> 640-700 nm의 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm의 (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 nm의 </td></tr></tbody></table><img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> 마우스 두 개관에서 HSPCs의 생체 4D 영상에서 그림 1. 실험의 (A) 개요 (B - C).. 얻어진 결과의 예 (B) 3D 스택에서 2D 조각 (총 깊이 114 μm의 경우), 콜라겐 뼈 (흰색)에서 신호를 포함하는 표시 DID 세포 (적색) , autofluorescent CELLS (노란색)와 조골 세포 (녹색). 스케일 바 :. 골아 세포 (녹색)에 근접하여 마이그레이션 레이블 않았다 HSC (빨간색)를 보여주는 4D 시간 경과 영화에서 100 μm의 (C) 2D 조각. 점선은 셀의 변위를 강조한다. 스케일 바 : 50 μm의 (B) 및 100 μm의 (C). 참고 :. 비디오 문서에 보이는 (C)의 시간 경과 수집에서 얻은 동영상 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

in-vivo-4-dimensional-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.8K 조회수.  Imperial College London.  조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다. 

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

연구

발생학

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular niches modulating critical hematopoietic stem cell (HSC) functions1,2. Indeed, a more detailed picture of the hematopoietic microenvironment is now emerging, in which the endosteal and the endothelial niches form functional units for the regulation of normal HSC and their progeny3,4,5. New studies have revealed the importance of perivascular cells, adipocytes and neuronal cells in maintaining and regulating HSC function6,7,8. Furthermore, there is evidence that cells from different lineages, i.e. myeloid and lymphoid cells, home and reside in specific niches within the BM microenvironment. However, a complete mapping of the BM microenvironment and its occupants is still in progress.
Transgenic mouse strains expressing lineage specific fluorescent markers or mice genetically engineered to lack selected molecules in specific cells of the BM niche are now available. Knock-out and lineage tracking models, in combination with transplantation approaches, provide the opportunity to refine the knowledge on the role of specific &#34;niche&#34; cells for defined hematopoietic populations, such as HSC, B-cells, T-cells, myeloid cells and erythroid cells. This strategy can be further potentiated by merging the use of two-photon microscopy of the calvarium. By providing in vivo high resolution imaging and 3-D rendering of the BM calvarium, we can now determine precisely the location where specific hematopoietic subsets home in the BM and evaluate the kinetics of their expansion over time. Here, Lys-GFP transgenic mice (marking myeloid cells)9 and RBPJ knock-out mice (lacking canonical Notch signaling)10 are used in combination with IVFM to determine the engraftment of myeloid cells to a Notch defective BM microenvironment.

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital fluorescence microscopy (IVFM) of the calvarium is applied in combination with genetic animal models to study the homing and engraftment of hematopoietic cells into bone marrow (BM) niches.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

면역학 및 감염병학

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

생물학

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

<meta charset="utf8"></head><body>살아있는 쥐의 골수 연구를 위한 대퇴 내 주사

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

요약

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조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

마우스 골수 단핵구를 추적

대한 대퇴골 창 회의소 모델

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능