저자는 정맥 액세스 라인의 위치를​​ 포함하는 수술 절차를 완료 Drs에 실비아 B 캄포스 - Bilderback 조지 J 로즈에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 시몬과 Frömter 균주 모두로 구성된 뮌헨의 Wistar 식민지를 유지하기 위해 사라 E 유아에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 설포-로다 민 101 포닐 염화물 (텍사스 레드) 알부민 쥐 혈청의 활용 <ol><li> 최종 농도 50 ML 원뿔 관에 15 밀리그램 / ML, 100 mM의 중조 산도 9.0의 쥐에서 (RSA) 혈청 알부민 6.667 ML 100 MG를 녹인다. </li><li> 장소 얼음 / 물 비커의 용액으로 0에서 11 ° C. 사이에 멋진 </li><li> 15 초 동안 중간에 소용돌이, 텍사스 레드 포닐 염화물 (TRSC)의 10 mg을 유리 병에 고품질의 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 200 μl를 추가합니다. </li><li> 소용돌이 RSA 매체에 솔루션 용해 TRSC을 추가합니다. </li><li> 호일 랩 50 ML 원뿔 (형성 파라 필름이 단단히 밀봉을 보장하는 데 사용할 수 있습니다), 수평 W / 아이스 만과 장소 (거품 형성을 방지)을 천천히 솔루션을 선동하는 로커에 얼음 양동이에 장소는 반응이 0에서 계속할 수 4 ° C 1 시간 동안. </li><li> 0.9 % 생리 식염수 5 L를 확인하고 클립 하나) 투석 막을 수 있습니다 챔버 떨어져 컷 50 kDa의 분자량, B) 디 젖은플로트 - lyzer, 또는 c) 슬라이드 - lyzer 카세트 (접합 TRSC을 제거하기위한 모든 적절한)에서와 같이 투석 튜브. </li><li> 5 L 컨테이너 W / 0.9 % 생리 식염수에 투석 챔버와 장소에서 개최 반응 혼합물은, 교반 막대를 사용하여 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 하룻밤을 dialyze. </li><li> 사실상 색상 변화에 하룻밤 배양 결과 (이 일반적으로 최소 4 교류와 함께 ~ 48 시간 소요)까지 아침과 늦은 오후에 5 L 투석 솔루션을 변경합니다. 또한, 50 kDa의의 MWCO가 RSA, 66kDa의 분자량에 너무 가까이되고 함께, 그것은 명확한 솔루션을 생성하지 않을 수 있습니다,이 멤브레인의 기공 크기의 분포에 따라 달라집니다, 60 시간, 5 교환합니다 충분한 시간을보다. </li><li> 측정 볼륨 및 TR-RSA의 대략적인 농도를 제공하기 위해 부피 100 MG의 초기 무게를 분할, 일반적으로 농도 범위 10-13 MG / ML. 최종 염료 : 알부민 비율은 15.00 당 ~ 4:1 1 형광해야한다단백질 MW 0 달톤. 4에서 보관 ° C; 발생할 수있는 조각화가 발생하면 투자율 값을 변경하므로, TR-RSA 솔루션을 일시 정지하지 마십시오. </li></ol> 2. 이미지 / 현미경 설정 거꾸로 현미경 스테이지를 준비 <ol><li> 장소 ~ 오토 클레이브 테이프의 4-7 조각 (약 ¾ &quot;롱) 완벽 40mm의 coverslip을 바닥 (coverslip에 바닥 접시)와 50mm 접시 내부에 서로 위에 쌓아.이는 가장자리 중 하나에 가까이 위치해야하므로 테이프의 가장자리 신장의 곡률의 가장자리와 접촉을하지만, 목표 빛의 경로 (그림 1A와 1B) 차단하지 않습니다, 큰 쥐가 요리의 테이프와 가장자리 사이에 더 많은 공간이 필요합니다. </li><li> 50 밀리미터 접시 (그림 1A)와 함께 무대 옆에 위치 2 Repti - 칼로리 패드. 무대 위에 온난화 물 재킷 담요를 놓습니다. </li><li> 객관적인 포탑을 보장하여 이미지를 수집하는 배 공기 O가있을 때 효율성을 극대화R 20X (공기 또는 물 침지) 객관적이고 정량 이미지를 수집하기 위해 높은 전원 침수 목표. </li><li> 영상 중에 목표에 물을 추가하는 가장 효율적인 방법은 측면에 회전 및 목표의 상단에 도달 할 수 PE-200 튜브의 긴 조각 1 CC의 주사기를 사용하여 물을 추가하는 것입니다. </li><li> 소프트웨어에 대한 중립적 인 밀도 필터를 사용하여 ~ 15 % ~ 20 %로 10w 레이저 여기 강도를 설정합니다. 갈륨 비소 인화물 비 descanned 광 검출기는 빨간색으로 배출량을 수집하는 녹색 배기 가스 및 625를 수집하기 위해 750로 설정됩니다. 블루 배출 (예 : 핵 얼룩 훽스트 33342)를 750-800 사이의 설정으로 표준 nondescanned multialkaline 탐지기를 사용하여 수집하고 있습니다. </li><li> 보먼의 공간에 낮은 강도 배출의 적절한 컬렉션을 보장하기 위해 검출기의 낮은 한계가이 값을 제외하지 않는 정도로 설정되어 있는지 확인합니다. 시각적 인 경고 표지가 표시됩니다 경우 감도설정이 너무 낮으며이 값이 0의 강도 값을 부여하고있다. </li><li> 1 CC의 전체 볼륨을 가지고 0.9 % 멸균 식염수로 희석 형광 알부민 용액의 ~ 5-8 MG와 1 CC의 주사기를로드합니다. </li></ol> 3. Intravital 위해 뮌헨의 Wistar 쥐의 신장을 노출 2 광자 이미징 <ol><li> Pentabarbitol (50 MG / ML 솔루션 120 μl/100 G 체중), Inactin (130 밀리그램 / ML 솔루션 120 μ/100 G 체중) 또는 Isofluorane (5 % 유도 1.5을 사용하여 미리 마취 쥐의 시작 ) 2.5 % 유지 보수, 내주 정맥 액세스 회선 (중 경정맥이나 대퇴 정맥), 왼쪽 측면은 흉곽 아래의 바로 왼쪽 허벅지 위에서 면도. </li><li> 그래서 그 오른쪽에 평평 쥐를 놓고 그 왼쪽, 면도면이 위로 향하고, 그 자세 늘어 (그림 앞발이 서로 닿지 서로 뒤 발을 만지고, 웅크 리고하지로는, 테이블에 평평하게되어 있는지 확인 2A). </리&gt; <li> 아주 부드럽게 자연스럽게 복막 내 낳는 위치를 결정하고 빈틈을 사용하여 몸 (허벅지 흉곽부터) (그림 2A)에 평행 한 직선을 그릴 신장을 느끼고 만져. </li><li> 이빨 포셉 한 쌍의 피부를 선택하고, 조직을 분쇄하고 출혈을 방지하기 위해 hemostats의 쌍을 사용하여 그린 선을 따라 피부를 꼬집어. 외과 가위를 사용하여 절개를 따라 잘라. 절단하기 전에 바깥 쪽 피부와 근육 층을 분쇄 극적으로 절감하고 일반적으로 출혈을 제거합니다. </li><li> 얇은 바깥 쪽 근육 레이어에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 복막을 노출 할 내부 근육 층에 절개를 들어, 크기를 추정하기 위해 신장을 다시 만져. 신장보다 작은 절개 라인이 끼지; 절개를 보장하는 것은 바로 신장 이상이다. 그것은이 절개가 너무 작하고 필요한 경우 그것을 더 크게 만들 것이 좋습니다. 이 너무 큰 한 경우 봉합이 필요합니다.이 마지막 절개 중요하다, 너무 멀리 어떤 방향에하면 무대에서의 안정성에 영향을 미칠 유도 호흡 (최상의 시나리오)에서 하나의 모션 아티팩트를하거나 신장 작은 꽃자루에 악영향 감소 신장 관류 (최악의 경우) 늘릴 것입니다 것입니다. </li><li> 손 패션을 통해 손에 신장의 아래쪽 극을 향해 노력하고, 신장 (그림 2B 참조) 그립 집게를 사용하여 주변의 지방을 찾습니다. </li><li> 신장의 하부 극에 도달하면 매우 부드럽게 외면하는 신장 아래로 압박하면서, 조심스럽게 절개를 통해 신장을 당깁니다. 절개가 너무 작은 경우, 근육 층을 분쇄하고 넓혀 절단, 신장을 외면하는 절차를 반복합니다. </li></ol> 4. 이미징을위한 스테이지에서 뮌헨의 Wistar 쥐를 배치 <ol><li> 신장에 coverslip을 접시의 가장자리쪽으로 신장을 놓고 약간 쥐의 등쪽 (뒷면)으로 회전 신장의 복부 측면 그래서s는 coverslip을 바닥 접시 (그림 1A)와 접촉을 만들기. 접시에 따뜻하게, 멸균 09. % 생리 식염수를 추가합니다. </li><li> 10 배 또는 20 배 목표를보고 동작을 확인합니다. 움직임이 감지되면 가슴이 멀리 coverslip을 바닥 접시에서 그래서 약간에 쥐 롤, 신장 등의 신 경 (그림 1B)를 스트레칭없이 접시의 가장자리에 가까이 있는지 확인합니다. </li></ol> 5. 알부민의 신장 침투성을 정량화하는 이미지 획득 <ol><li> 사구체 투과성 (Glomeruluar 체질 계수, GSC) 계산하는 고분자의 것은 이전에 형광 분자의 주입에 개별 사구체 참조 배경 이미지를 촬영해야합니다. 귀하의 현미경 마킹 위치 할 수있는 전동 무대가 장착되어있는 경우, 찾아 낮은 전원 공급 목표를 사용하여 센터 개인 사구체 각각의 위치를​​ 표시합니다. 듀얼 패스 형광 / 로다 민 epifluorescence에 FIL하나 방출 필터 (위상 대비 또는 조명의 다른 비 형광 소스가 작동하지 않습니다) 작동하지만 터이 절차에 이상적입니다. 사구체는 듀얼 패스 필터를 통해 볼 때 고유의 노란색 - 오렌지 autoflourescence을 가진 근위 세뇨관으로 둘러싸인 빈 원형​​ 구조로 표시됩니다. </li><li> 귀하의 현미경 자동화 단계가없는 경우, 저전력 목적으로 래스터 패턴 신장 스캔 및 개별 사구체의 위치의 기초지도를 만든다; 같은 신장 캡슐 위에있는 큰 표면 혈관 등의 자연 명소에 의존 또는 지방 패치. </li><li> 높은 전력 침수 목표로 포탑을 전환하고 모세관 루프와 보먼의 공간을 명확하게 볼 수 있습니다 확인하고 각 사구체의 3D 데이터 세트를 가지고. 사색 팔레트 (B / W 이외)를 사용하여 이러한 구조를 시각화하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 표면의 혈관에있는 집중 천천히 t에 주입그는 형광 알부민 결정해야 시간이 전신 배포 할 수 있도록 제공됩니다. 낮은 GSC와 분자의 경우는 플라즈마 강도 값을 최대화하는 것이 아니라 현미경 사진 탐지기를 포화 수준에 도달하지 필수적입니다. 이 필터링 분자의 검출을 증가시킵니다. 주 : (1 프레임 / 초 ~에서 전체 프레임을 취득) 화면에 나타나는 형광 알부민이 시간에 도입되는 시간 사이에 5-7 초 경과는 일반적으로있다. </li><li> 약 10 분은 잠재적 작은 분자량 조각이 알부민 GSC를 계산에 사용되는 1 ㎛ 간격으로 3 차원 볼륨을 취득하기 전에 취소 할 수 있도록 허용합니다. 일반적으로, 뮌헨의 Wistar 쥐의 시몬의 긴장이 훨씬 적은 표면 사구체를 가지고 시각화 할 수있는 모든 이미징 및 정량되도록. 우리는 ~ 10 정량화 수를 제한 할 수 있도록 Frömter 변형이 훨씬 더 큰 번호가 있습니다. </li><li> 연구의 끝에서 쥐가 anesthet의 과다 복용을 통해 안락사됩니다IC는 연구에 사용됩니다. 이중 pneumothoracotamy는 안락사를 보장하기 위해 수행됩니다. </li></ol> 6. 3D 볼륨에서 형광 알부민 GSC를 계산 <ol><li> Metamorph 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 배경 설정 모두 각각의 사구체에 대한 3D 데이터 세트를로드하고 형광 알부민 주입 후 촬영 설정합니다. </li><li> 정의 된 여백과 보먼의 캡슐의 가장자리 사이에 충분한 공간 빈 공간 표면 모세관 루프를 찾습니다 형광 알부민을 포함하는 볼륨. </li><li> 배경 볼륨에서 알부민 함유 이미지의 시각적 단서를 포함해야 동일한 초점 비행기를 찾습니다. 관심 모세관 루프 내에서 영역을 선택하고 평균 강도 수치를 기록합니다. 다음 보먼의 공간 내에서 영역을 선택하고 평균 강도 판독 값을 기록합니다. 이러한 배경 값으로 사용됩니다. </li><li> 정량, 알부민 C에서 보먼의 공간에 유사한 지역을 선택이미지를 ontaining. 보먼의 공간 내에서의 평균 강도에 대한 평균 값을 적어도 두 개의 다른 지역에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 밝은 플라즈마 강도 모세관 루프를 선택하고 주변 지역을 그립니다. 임계 값 기능을 사용하여 다음 RBC의 순환하는 어두운 줄무늬를 피하고, 순환 혈장 내에서 밝은 값을 강조 표시합니다. 선택한 플라즈마 공간의 평균 강도 값을 기록합니다. 혈액 내 요소는 원인이 플라즈마 형광 수준을 과소 평가하는 역할을하기 때문에 그것은 우선적으로 플라즈마의 밝은 영역을 선택하는 것이 중요합니다. </li><li> Microsoft Excel 스프레드 시트 어디 GSC를 계산하는 값을 입력하여 : </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에서 강조하는 단계는 우리가들은 다음과 같은 함정을 피할 수 있기 때문에 일관되고 정확한 투자율 값을 생성 할 것 느끼는 것을 나타냅니다 : <ol><li> 산란 : 긴 파장의 광자가 산란 적은 경향이 있기 때문에 적색 발광 형광체의 사용은 빛을보다 효율적으로 수집을 할 수 있습니다. 하나 녹색 또는 청색 발광 형광체를 사용하기 때문에 모세관 루프와 보먼의 공간 3에서 강도 값의 ?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

같은 혈청 알부민, 긴 침투성 족으로 구성된 장벽, 혈관 내피 세포, 그리고 한마음으로 작업 기저막의 변화에​​ 의한 것으로 생각되어 같은 대형 필수 고분자의 소변 손실을 포함하는 신장 질환. intravital 2 광자 현미경을 사용하여 우리 연구소의 데이터는 근위 세뇨관 세포 (PTC)는 1,2 불리는 세포의 초기 집합에서 발생하는 필터링 알부민 검색과 이전에 생리 학적 조건에서 생각했던 것보다 더 투과성 사구체 여과 장벽 (GFB)를, 밝혀 3. 이전 기술은 신장 여과를 연구하는 데 사용 유체 콘텐츠 및 분석 4 샘플링이 초기 관 세그먼트의 루멘의 micropuncture을 포함 여과 장벽의 특성을 설정. 해당 밀접하게, 이러한 연구는 거의 존재하지 않는 것으로 내강 액에 알부민 농도를 결정일반적으로 소변에서 검출되는 것과. 그러나,이 기술에 의해 정의 된 크기의 덱스 트란 폴리머의 특성은 혈청 알부민과 비슷한 크기의 사람들을 밝혀 관 루멘과 소변에서 높은 수준을했다; 증가 투자율 5 제안. 여기에 직접 시각화하고 생체 내에서 사구체 형광 알부민 투과성을 계량하는 데 사용되는 기술에 대한 자세한 개요입니다. 이 방법은 보먼의 공간 (소변 여과의 초기 챔버)로 여과 장벽을 통해 여과 된 알부민을 검출 할 수 있고, 또한 근위 세뇨관과 이후 알부민 transcytosis 6 시각화하여 알부민 재 흡수의 정량화 할 수 있습니다. 방광 도중에 이상 관 세그먼트에 따라 형광 알부민의 부재는 이전 근위 세뇨관 세그먼트에있는 검색 경로의 효율성을 강조 표시합니다. 또한,이 기술을 적용 할 때 투자율을 결정하기의 알부민 거의 동일 투자율 값으로 유사한 크기를 갖는 덱스 트란은 2보고되었다. 이러한 관찰은 직접 근위 세뇨관 세포 재생에 포함 된 변경에 많은 단백뇨 신장 질환의 초점을 확장 할 필요성을 지원합니다.

그림 3은 뮌헨의 Wistar Frömter 쥐와 형광 알부민 투과성을 결정하기 위해 수행하는 단계의 표면 사구체에서 촬영 한 이미지의 예를 보여줍니다. 0.0111의 알부민 GSC 값은 뮌헨의 Wistar 쥐 때 공급 조건 3이 변형에서 볼 수있는 범위 내에서이 개별 사구체 가을을위한 것. 이 이미지에서 볼 수있는 안정성은 신중한 계획과 그림 1과 2에 묘사 된 명령어의 실행 때문이다. ?...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

2 광자 현미경 높은 해상도 intavital을 활용하는 기술을 직접 시각화 및 표면 사구체에서 gloemrular 여과를 정량화한다. 이 방법은 정상과 질병 상태 모두에서 거대 분자의 투과 특성을 직접 측정 할 수 있습니다.

뮌헨의 Wistar 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 형광 고분자의 사구체 투과율을 정량화

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K 조회수.  Indiana University School of Medicine. 2 광자 현미경 높은 해상도 intavital을 활용하는 기술을 직접 시각화 및 표면 사구체에서 gloemrular 여과를 정량화한다. 이 방법은 정상과 질병 상태 모두에서 거대 분자의 투과 특성을 직접 측정 할 수 있습니다.

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

연구

의학

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

가속도계를 사용하여 일상 생활에서 상지 성능을 정량화하는 방법

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

Vivo에서 Menière의 질병 귀 그리고 정상 청력 귀에 자기 공명 화상 진 찰을 사용 하 여 인간의 두개골 신경의 형태학 분석

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

플루오레세인 이소티오차네이트-폴리수크로오스 70을 가진 마우스에서 사구체 투과성의 고감도 측정

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

전체 마운트 면역형광 염색, 컨포칼 이미징 및 마우스 내 동방방 및 방실 결절의 3D 재구성

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

마우스의 부정맥을 감지하기 위한 장기 심전도 기록 분석

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...