이 작품은 영국 심장 재단, 리처드 밝은 VEGF 연구, 믿음과 MRC에 의해 지원 되었다.

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<li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+diabetic+nephropathy%3A+their+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology+and+Renovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 각 방법의 중요 한 단계 (uACR 및 플라즈마 크 측정), 전체적으로는 신장에의 침투성의 평가 포함 하 여 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석에 대 한 허용의 침투성 개별 glomeruli (사 LpA / V나), 구조 변경 (파, Trichrome 블루, 그리고 EM), 단백질 지 방화 (면), 그리고 사 유전자 발현 (RT-PCR 및 서쪽 blotting)의 검사. 이 메서드는 키 사 기능 신장 질병 마우스 모델에서의 전체 평가를.
GFB의 침투성을 평가할 때 효과적인 측정17,18로 기존의 uACR 또는 24 시간 알 부 민 배설 속도 사용 하 여 많은 연구 하셨습니다. 비록 이러한 기술을 허용 전체 GFB 침투성의 평가, 개별 사 침투성 평가 및 glomeruli 사이 유사에 대 한 허용 하지 않습니다. 이전 연구는 사 LpA의 측정 발견 / Vi GFB 침투성5,9에 변화의 더 민감한 측정 될. 사실,이 문서에서 설명 하는 대표적인 결과에서 14 주에 게시 VEGF-A 코의 유도, VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐 VEGF-A 코 쥐;에 비해 상당히 낮은 uACR 그러나,이 결과는 사 LpA에에서 반영 되지 않습니다 / V나 측정, VEGF A165b 크게 방지 하지 않았다 GFB 침투성 (그림 1 및 그림 2)5증가. 이 신장 침투성 및 개별 glomeruli의 침투성을 평가 하기 위해 여러 개의 분석 실험을 사용의 중요성을 보여줍니다. 또한, 사 LpA / V나 oncometric 분석 결과 제안 같은 신장에서 개별 glomeruli의 침투성 크게 다를 수 있습니다, 특히 질병 모델5,10, 19. 사 LpA를 측정 한 제한 / V나 그것만 실험 끝점;에서 수행할 수 있습니다 따라서, 일반 uACR 측정 실험 끝점의 표시를 제공 해야 합니다.
기능 형 평가, 이외에 현재 메서드는 또한 구조 및 ultrastructural 표현 형의 평가 권장 합니다. 이 행 해질 수 있다 파, trichrome, 같은 얼룩은 얼룩;의 선택을 사용 하 여 각 사 형태학의 다양 한 측면을 평가 하기 위해. 종종 마우스 모델의 경우는 사 병의 급성 모델에는 어떤 주요 구조적 이상이 있습니다 훈련된 신장 병리학이이 얼룩을 사용 하 여 감지 하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, EM 수행 평가 매개 GBM, 내 피 fenestrae 크기 및 수, 및 podocyte 특성의 정량적 측정을 허용 GFB의 열 대권 외 건의 된다. 이러한 측정 수행에 최소한의 교육 요구 및 셀-종류/구조는 질병 모델에 영향을 확인 하기 위해 조사를 수 있습니다. 예 대표 결과에 VEGF-A 코 마우스 발견 사 질병의 가벼운 모델로, 따라서, 아무 주요 구조적 이상이 파스 얼룩에 참석 했다. 그러나, podocyte 특정 VEGF-A 코 않았다 유도 GBM, podocytes, 및 내 피 세포에 대 한 변경 사항을 사 울트라 구조5를 조사 하면. 불행 하 게도, 현재의 방법에서 설명 하는 그들에 대 한 신장의 준비 또한 GFB19의 침투성에 중요 한 영향으로 알려져 내 피 glycocalyx의 감지를 사용 하지 않습니다. Glycocalyx 깊이 정확 하 게 측정 하기 위해서는 신장 해야 합니다 2.5%도 내 피 glycocalyx 라벨에 대 한 1 %Alcian 블루 perfuse-고정 Oltean 외19에 설명 된 대로.
기능과 구조 표현 형 평가 되어, 일단 다른 유전자 및 통로의 식/활성화 패턴은 glomeruli에서 특히 평가 다음 수 있습니다. 이전 초 구조 평가 관련 된, podocyte 또는 내 피-특정 유전자/경로 검사 해야 합니다 여부를 나타내는 형식/사 구조 셀에 대 한 몇 가지 정보를 줄 수 있습니다. 예를 들어 VEGF-A 코 쥐에서 대표적인 결과에서 내 피 fenestrae 수에 있는 감소 (그림 3D) 관찰 되었다; 따라서, VEGF A 통로에 관련 된 것으로 알려져 내 피 마커의 사 단백질 발현 조사 되었다; VEGFR-2 (그림 4B)5. glomeruli에 단백질의 표현 뿐만 아니라 그들의 지 방화 수 또한 구상 될 경우를 사용 하 여. 연구에서 장 외20, podocyte 특정 overexpression GLUT1의 공동 podocin와 증가 GLUT1 지역화 하는 경우 의해 podocytes에서 확인 됐다.
사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교 사 질병 마우스 모델에서 신장 기능을 평가 하기 위해이 문서에서 설명 하는 메서드를 사용 하 여 수에서 완전히 평가 하 사 형 여러 측면입니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 이 메서드는 질병 고기 및 잠재적인 치료제의 평가에 모두 사 기능으로 미래의 수사에 쉽게 적용할 수 있습니다.
결론적으로,이 일반 및 적응 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에 대 한 전체 신장 작업을 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 이러한 murine 모델 포함 자발적인 모델을 자연스럽 게 고혈압 쥐 (SHR)1, streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐와 쥐2, 유도 및 db/db 타입 II 당뇨병 쥐3와 같은 유전자 조작된 모델 기본 podocyte 특정 초점 단편 사 경화 증 (FSGS) 모델4, podocyte 특정 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF-A) 노크 아웃 (VEGF-A 코) 모델5, 그리고 Alport 증후군6, 모델 인수 5/6 신7 과8의 일방적인 ureteral 방해 (UUO) 모델 등 모델. 이러한 모델에서 사 기능의 다양 한 측면을 평가, 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 종이의 목적은 완전히 평가 사 기능 신장 질환의 마우스 모델에서 수행 해야 하는 포괄적인 작업 최대 보여.
이 메서드를 사용 하 여 뒤에 근거는 그것 완전히 여러 측면에서 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 평가 사 침투성, 단백질, 물, 사 구조 이상, 그리고 식/mRNAs 및 단백질 정상 사 기능에 대 한 필수의 접합에 변화를 포함 한다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 이것은 이러한 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요한은 질병의 메커니즘에 대 한 중요 한 정보 이다.입니다.
문학, 그것은 사 질병 표현 형의 소변에서 알 부 민 증가 수준에 의해 결정 됩니다의 마우스 모델을 제시 하는 일반적인 발생. 그러나, 증거가 제안 사 기능을 결정 하는 하나의 방법을 하지 항상 효과; 총 신장 기능, 그리고 개별 glomeruli의 정보를 제공 합니다만 요 알 부 민 배설 속도 또는 오 줌 알 부 민 크 비율 (uACR)를 측정. 이전 연구 침투성 다른 glomeruli 같은 신장5,,910에서에서 변화할 수 있다 설명 했다. 또한, 개별 glomeruli의 침투성의 평가 평가 사 기능;의 더 민감한 방법 개별 사 물 침투성 측정 기술 (LpA / V나) uACR9측정 보다 사 기능에서 변화에 더 민감한 것으로 나타났습니다. 이 분석 결과 저항 proteinuria c57BL/6 배경11등을 마우스 모델에서 유용 합니다. 현재 방법 종이의 장점은 그것은 알 부 민을 총 신장 침투성 뿐만 아니라 개별 사 침투성 물 검사.
사 구조적 이상이의 검사는 종종 얼룩 등 정기 산 Schiff (PA), trichrome, 그리고 실버 얼룩의 배터리에 의해 평가 됩니다. 이러한 점수 매기기 방법을 통해 신장 질병의 수준을 평가 하는 훈련된 신장 병리학 자 가능 모든 좋은 방법, 사 매크로 구조에 변화에 항상 나타나지 않으면 비록 급성 신장 손상 모델12. 이 메서드는 실행 위에서 설명한 신장 조직학 기술, 뿐만 아니라 사 울트라 구조 또한 평가 되어야 합니다 전자 현미경 (EM)를 통해 제시 한다. 얼룩진된 glomerulus 상대적으로 일반 조명 현미경; 정상 볼 수 있습니다. 그러나, EM, 작은 변화, 사 지하실 멤브레인 (GBM) 폭에서과 평가 시 podocyte 발 과정 겸, 내 피 fenestrations, 그리고 하위-podocyte 공간 범위 분석 이다. 따라서, 사 울트라-구조와 마이크로 구조 사 역의 메커니즘을 확인 평가 생명 이다.
평가 사 구조 이상, 뿐만 아니라 사 질병의 메커니즘을 더 명료 하 mRNA와 단백질 표정 및 접합로 단백질 활성화 (예를 들어, 인 산화), 변화를 시험 한다. 사 병을 볼 때 또는, 예를 들어, 코/오버-expressing 유전자는 podocyte 전용 VEGF-A 코 마우스5, 같이 사 셀에 특히 중요 하다 단백질 mRNA의 변화만 내 검사는 사 세포, 그리고 전체 신장 하지입니다. 이 프로토콜 있는 glomeruli 마우스 신장 피 질에서 격리 되며 다음 단백질/RNA 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 질병 모델의 glomeruli 단백질/mRNA dysregulation의 특정 분석을 수 있습니다.
이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

<table><tbody><tr><td>Metabolic Cages</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Substrate solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Sulphuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater stabilisation solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% precast protein gel</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Sample buffer</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot cell</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris running buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Blood Collection tubes</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Needle</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Glass Vial</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tissue Molds</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Surgical Disection Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability Rig</td><td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td><td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sieves</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Resin</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>e.g. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Cell Lysis Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membrane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF Substrate for Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Light Miscroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analysis Software</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Microscope</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 우리의 연구는 당뇨병 신 장병 및 podocyte 관련 VEGF A 녹아웃 쥐; 사 기능 평가에 초점을 맞춘합니다 따라서,이 프로토콜 설명 전체 신장 작업-최대 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하면 사 병의 이러한 마우스 모델을 평가 하기 위해 우리의 실험실에 사용 합니다. 사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교이 문서에 설명 된 메서드를 사용 하 여 여러 측면에서 완전히 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있습니다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 방법의 구조와 매우 구조 시험 뿐만 아니라 오 줌 알 부 민 크 비율 및 개별 사 물 침투성, 측정을 통해 사 여과 방 벽의 상세한 기능 평가 대 한 허용 정기 산 Schiff 얼룩이 및 전자 현미경을 사용 하 여. 또한, mRNA와 단백질 수준에 유전자 dysregulated의 분석을 사 기능의 기계적 분석을 수 있습니다. 이 프로토콜 사 질병의 모든 마우스 모델에 적용 될 수 있는 일반 하지만 적응할 수 있는 방법을 설명 합니다.

야생 타입 (WT), (VEGF-A 코), 밖으로 유도할 수 있는 podocyte 전용 VEGF A 노크와 VEGF-A 코 X Neph-VEGF165b 쥐 대사 케이지를 사용 하 여 소변 수집 (VEGF-A 코 쥐-인간의 VEGF A165b isoform에 podocytes에서 표현 하는 구성 방식)입니다. 측정 오 줌 알 부 민 크 비율의 주 0, 4, 10, 14에서 VEGF-A 코의 doxycycline 유도 후, 시 VEGF-A 코 쥐 10 주 WT littermate 컨트롤에 비해 진보적인 단백뇨를 개발. 그림 2A, 및 그림 2B에 각 마우스 값의 기준선에 정규화 된 절대 값을 볼 수 있습니다. 그러나,에서 단백뇨 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 생쥐 (그림 2)에서 관찰 되지 않는 그 VEGF A165b은 단백뇨5의 모델에서 보호입니다.
사 LpAV나 개별 glomeruli WT, VEGF-A 코, VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 신장에서 sieved에서 측정 했다. 어떻게는 glomerulus는 고 수축의 예로 그림 3A에서8 %BSA perifused 표시 하면 관찰. 이 수축 사 LpA를 결정 하는 데 사용은 / V나 각 glomerulus (그림 3B)에 대 한. VEGF A 코 쥐 했다는 크게 증가 사 LpA / V나 14 주에 WT 제어 glomeruli에 비해 VEGF 코 유도 포스트. 비록 낮은 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐, 증가 사 LpA / V나 14 주5에서 VEGF A165b-식으로 하지 못했습니다.
싶어 서 신장 피 질 부분의 VEGF-A 코의 유도 후 14 주 얼룩 VEGF-A 코 또는 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 생쥐 (그림 4A)에서 어떤 사 구조 이상 공개 하지 않았다. 그러나, 그들을 통해 사 울트라 구조 분석, 시 VEGF-A 코 쥐 했다 증가 GBM 폭을 개발, 내 피 fenestrae의 수를 감소, SPS 범위 감소 및 평균 podocyte 슬릿 폭을 증가 (그림 4C-4 층 ). 평균 podocyte 피트 폭 및 슬릿 변하지 않게 남아 있었다 (그림 3B 및 3 세대)의 수를 처리합니다. -표현의 VEGF-A 코 쥐에서 VEGF A165b는 GBM을 변화를 방해 하 고 슬릿 폭 (그림 4C 와 4 층). 그러나, A VEGF165b이 했다 변경 된 fenestrae 수와 SPS 범위 (그림 4D 및 4E)5에 영향을 주지 않습니다.
RT-PCR 체질된 glomeruli에서 추출한 RNA에 수행 이라고 밝혔다 인간의 VEGF A165b mRNA만 (그림 5A) VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에. VEGF A165b ( -식에 의해 방지 되었다 VEGF-A 코 생쥐에서 감소 VEGFR-2의 사 단백질 표정 발견 체질된 glomeruli 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 통해 단백질의 수준을 평가 하 고에서 단백질을 추출 하는 경우 그림 5B 와 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> 그림 1입니다. 사 침투성 (LpA) 장비의 도식 설정. (A)는 glomerulus 적발 (B) 흡입을 사용 하 여 홀더 내 micropipette에 안정성에 대 한 마운트에 고정 됩니다. (C) 사각형 microslide입니다. (D) 4 X 비디오 카메라와 현미경의 목적. (E) 37 ° c 1 %BSA 솔루션 따뜻하게 ((F)) 8 %BSA 솔루션 37 ° c 예 열 (G) 원격 탭 베어링 두 포함 하는 perifusate 라인 빠른 perifusate 교류를 허용 합니다. (H) 다음은 glomerulus 목욕 microslide로 perifusate의 경로입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> 그림 2입니다. 요 알 부 민 크 비율입니다. (A) uACR 값 0, 4, 10, 및 14 주 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐에서 VEGF-A 코의 유도 후에. (B) 같은 uACR 값을 기준 값 (주 0) 각 개별 마우스의 정규화. uACR 주 10와 14 WT littermate 컨트롤에 비해 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 방해 했다 VEGF-A 코 쥐에 크게 증가 (* p < 0.05; 양방향 ANOVA, 쌍; 사이의 비교에 대 한 보정 n = 4-12 시간 포인트; 당 쥐 오차 막대: [SEM] 의미의 표준 오류). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> 그림 3입니다. 사 물 침투성의 측정입니다. (A) 는 glomerulus 흡입; 통해 micropipette에 잡힌 perifusate 1 %BSA (Ai)에서 8 %BSA (좋아), 전환 그리고 사 수 축을 관찰. (B) 측정 전후에 8 %BSA 스위치를 사용 하 결정 사 LpA / V나. (C) 마우스 VEGF-A 코 개발 한 증가 사 LpA / V나 14 주에 포스트 VEGF-A WT 컨트롤에 비해 코의 유도. 이것은 크게 막을 수 없습니다 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 있는 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 4-9 마우스, 15-30 glomeruli; 오차 막대: sem의). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> 그림 4입니다. 사 구조 분석입니다. (A) 파 신장 피 얼룩 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐 (Ai-iii)에서 glomeruli에 어떤 구조적 이상이 표시 하지 않았다. EM은 VEGF-A 코 glomeruli (Aiv-vi)에 매우 구조적 이상이 나타났다. (B) 평균 FPW 그룹 사이 변화 하지 않았다. (C)는 GBM 증가 VEGF-A 코 glomeruli는 VEGF A165b. fenestrae 수 VEGF-A 코 glomeruli, VEGF A165b. (E)는 SPS 보도 의해 불변에 남아 있었다 감소 되었다 (D) 에 의해 방지 되었다 이었다 VEGF-A 코 glomeruli, 또한 VEGF A165b. 슬릿 폭 평균 VEGF-A 코 glomeruli에 증가 되었다 (F) 불변에 남아 있었다에서 감소는 VEGF A165b. (G) 슬릿 수에 의해 방지 되었다 아니었다 변경 3 개 그룹 사이 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3 마우스, 9 glomeruli; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> 그림 5. 마커의 mRNA와 단백질 표정. (A) RT-PCR 인간의 VEGF A165b mRNA 표현 했다 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에서 체질된 glomeruli 분명만 보였다. (B) 서 부 럽 표시는 VEGFR-2 단백질 표정 VEGF-A 코 glomeruli 아래로 통제 되는 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b glomeruli에서 방지 되었다 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3-6 쥐; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K 조회수.  University of Exeter. 이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

비디오: Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

마우스의 급성 신장 손상 및 사후 상해 섬유증의 허혈 - 재관류 모델

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

연구

의학

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

신장 허혈 재관류 상해 : 상해의 마우스 모델 및 재생

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

마우스 신장 이식 : 동종 이식 거부의 모델

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

의식 설치류에서 신장 기능의 경피 평가

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

생물학

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface glomeruli provide a unique opportunity to investigate physiological and pathophysiological processes using intravital 2-photon microscopy. Quantification of glomerular capillary blood flow and vasoconstriction and dilatation in response to drugs, permeability, and inflammation are just some of the processes that can be studied. In addition, transgenic rats, i.e., podocytes labeled with fluorescent dyes and other molecular biomarker approaches, provide increased resolution to directly monitor and quantify protein-protein interactions and the effects of specific molecular alterations.
In mice, which lack surface glomeruli after four weeks of age, unilateral ureteral obstruction (UUO) for several weeks has been used to induce surface glomeruli. As this induction model does not allow for baseline studies, we quantified the effects of UUO on glomerular processes in the UUO model in Munich Wistar Fr&#246;mter (MWF) rats, which have surface glomeruli under physiologic conditions. The UUO model for five weeks or more induced significant alterations to gross renal morphology, the peritubular and glomerular microvasculature, as well as the structure and function of tubular epithelia. Glomerular and peritubular red blood cell (RBC) flow decreased significantly (p &#60; 0.01), probably due to the significant increase in the adherence of white blood cells (WBCs) within glomerular and peritubular capillaries. The glomerular sieving coefficient of albumin increased from 0.015 &#177; 0.002 in untreated MWFs to 0.045 &#177; 0.05 in 5-week-old UUO MWF rats. Twelve weeks of UUO resulted in further increases in surface glomerular density and glomerular sieving coefficient (GSC) for albumin. Fluorescent albumin filtered across the glomeruli was not reabsorbed by the proximal tubules. These data suggest that using UUO to induce surface glomeruli limits the ability to study and interpret normal glomerular processes and disease alterations.

Here, we present a protocol using 2-photon microscopy in Munich Wistar Fromter rats with surface glomeruli to quantifythe effects of prolonged ureteral obstruction on glomerular dynamics and function.

2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement therapies such as hemodialysis continues to increase. Autogenous arteriovenous fistula (AVF) placement remains a primary vascular access option for ESRD patients. Unfortunately, approximately half of the hemodialysis patients experience dialysis access-related hand dysfunction (ARHD), ranging from subtle paresthesia to digital gangrene. Notably, the underlying biologic drivers responsible for ARHD are poorly understood, and no adequate animal model exists to elucidate the mechanisms and/or develop novel therapeutics for the prevention/treatment of ARHD. Herein, we describe a new mouse model in which an AVF is created between the left common iliac artery and vein, thereby facilitating the assessment of limb pathophysiology. The microsurgery includes vessel isolation, longitudinal venotomy, creation of arteriovenous anastomosis, and venous reconstruction. Sham surgeries include all the critical steps except for AVF creation. Iliac AVF placement results in clinically relevant alterations in central hemodynamics, peripheral ischemia, and impairments in hindlimb neuromotor performance. This novel preclinical AVF model provides a useful platform that recapitulates common neuromotor perturbations reported by hemodialysis patients, allowing researchers to investigate the mechanisms of ARHD pathophysiology and test potential therapeutics.

This protocol details the surgical steps of murine common iliac arteriovenous fistula creation. We developed this model to study hemodialysis access-related limb pathophysiology.

혈액 투석 접근 관련 손 기능 장애의 쥐 모델

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Fluorescent Labeling of Glomeruli in Cleared Mouse Kidneys for Microscopy(현미경 검사를 위한 Cleared Mouse Kidneys의 사구체 형광 라벨링)

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

저자 스포트라이트: Aiding Research in Kidney Biology by labeling glomeruli in cleared tissues 

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.

마우스 사구체를 표지하고 분석하기 위한 효율적이고 빠른 방법

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...