나는이 원고의 중요한 읽기 박사 제시카 도밍 게즈 RIEG 감사합니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (과학자 개발 그랜트 10SDG2610034), 신장의 미국 사회의 칼 W. Gottschalk 연구 그랜트, 당뇨병의 국립 연구소와 급성 신장 손상 연구를위한 소화기 및 신장 질환 오브라이언 센터 (에 의해 지원되었다 P30DK079337), 그리고 재향 군인 원 호국.

1. 솔루션 <ol><li> 0.85 % 염화나트륨 : 8.5 g의 NaCl / 1리터 DDH 2 O (8.5 g / L). </li><li> 0.5 몰 / L HEPES pH를 7.4 (DDH 2 0 0.5 L의 HEPES의 59.6 g을 용해하고 10 N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정). </li></ol> 2. FITC - 이눌린 주입 용액의 조제 <ol><li> 완전히 용해 될 때까지 90 ° C로 가열하여 0.85 % 염화나트륨 (보통 100 ㎎ / 2 ㎖ 0.85 % 염화나트륨)의 5 % 용액을 준비하고 용해 FITC - 이눌린 무게. </li><li> 용해 FITC - 이눌린 솔루션 노트 몸무게. </li><li> 투석 막 20cm 조각 (분자량 컷 - 오프 : 1,000)를 잘라 막에서 잔류 NaN의 3을 제거하고 그 후 몇 번 플러시 30 분 DDH 2 O에 넣어. </li><li> 투석 막에 FITC - 이눌린을 용해 채우고 폐쇄 제대로 밀봉하십시오. </li><li> 전체 투석 막 무게. </li><li> 1 L 0.85 % 염화나트륨 용액에 투석 막 넣고 RO 24 시간 동안 빛을 보호 천천히 저어OM 온도. </li><li> 다시 전체 투석 막 달아 (물이 삼투 막과 언 바운드 FITC로 이동하거나, FITC - 이눌린에게 &lt;1,000 분자량이 막 밖으로 이동합니다 바인딩 된 것이다 따라서 FITC - 이눌린의 농도가 크게 감소합니다) 새 농도를 계산 . </li><li> 새로운 FITC - 이눌린 농도 (C)는 다음 공식을 사용하여 계산됩니다 : C = N / V, 여기서 n = 초기 FITC - 이눌린 양, V = 새 볼륨 (투석 플러스 초기의 볼륨 전후 투석 튜브의 무게의 차이 FITC - 이눌린 솔루션). </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 여과 투석 FITC - 이눌린 솔루션을 소독 사용하기 전에. </li><li> FITC - 이눌린 4에 빛 (알루미늄 호일)으로부터 보호 유지 ° C. 투석과 FITC - 이눌린 소독은 최고 2 주까지 사용할 수 있습니다. FITC - 이눌린이 몇 분 동안 90 ° C에서 재 가열하여 용해 할 수있는 참여했다. </li></ol> 참고 : 사용하는 경우투석을 필요로하지 않습니다 FITC-sinistrin 16-18, 투석에 필요한 모든 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 3. 주입과 혈액 수집 <ol><li> 실험을하기 전에 생쥐의 체중 (BW)를보십시오. </li><li> isoflurane을 함께 간단히 마우스를 마취. </li><li> 6 생쥐의 높은 처리량을 그림 3에서 제공하는 프로토콜을 따르십시오. </li><li> (처음에 대한 바늘 G30 ½로 전환 한 후 바늘 G26 ½를 사용하여 100 μL 해밀턴 주사기에서 공기 방울을 제거 바늘에 G30 ½을 사용하여 retroorbital 신경총 24에 투석 FITC - 이눌린 2 G / μL BW를 주입 주사). </li><li> 일단 가위로 쥐의 꼬리 1mm를 잘라 35, 15, 10, 5, 3에서 7 혈액을 수집, 56 NA-헤파린 minicapillaries에서 주사 후 75 분. 차 물개를 가진 혈액 수집 한 후 밀봉 minicapillaries. </li><li> 빛으로부터 보호 샘플을 보관하십시오. </li><li> 밀봉 minicapillaries 내부 hemato을 넣어적중 모세와 5 분 원심 분리기. </li><li> 0.2 ML 튜브에 pipetting하여 다이아몬드 커터 및 전송 전체 플라즈마를 사용하여 minicapillaries 휴식. </li><li> 새로운 0.2 ML 튜브 (샘플 4에서 하룻밤 저장할 수 있습니다 ° C 형광 측정)에서 플라즈마의 2 μL, 18 μL 0.5 몰 / L HEPES (산도 7.4)를 사용하여 1:10 희석합니다. </li><li> 중복의 Nanodrop 분광 3300로 희석 샘플 2 μL를 측정한다. 악기에 대한 설명과 사용법은 여기에 5 설명합니다. </li></ol> 4. 표준의 준비 <ol><li> 헤파린 코팅 헤마토크릿 모세관에서 동일한 배경 변형 쥐에서 혈액을 수집, 스핀 다운, 0.5 몰 / L HEPES (산도 7.4)에 1:10 희석, 보통 80 μL 플라즈마 + 720 μL HEPES. </li><li> 다음과 같은 표준 희석을 묽은 마우스 플라즈마 FITC - 이눌린 주입 용액을 희석 : 1:10 10 ㎕의 희석 FITC - 이눌린 솔루션 + 90 ㎕의 희석 마우스 플라즈마 1:100 : 10 &amp; 무, L (1시 10분) 솔루션 + 90 ㎕의 희석 마우스 플라즈마 1:1,000 : 10 μL (1:100) 솔루션 + 90 ㎕의 희석 마우스 플라즈마 1:2,000 : 30 μL (1:1) 용액 + 30 ㎕의 희석 마우스 플라즈마 1:10,000 : 10 μL (1시 5분) 솔루션 + 40 ㎕의 희석 마우스 플라즈마 1:20,000 : 20 μL (1:1) 용액 + 20 ㎕의 희석 마우스 플라즈마 1:100,000 : 10 μL (1시 5분) 솔루션 + 40 ㎕의 희석 마우스 플라즈마 표준 농도는 투석에 따라 달라집니다 항상 FITC - 이눌린의 각 준비 다를 수 있습니다. 그것은 새로운 표준 곡선 매회 농도를 입력 할 필요가 있습니다. </li><li> 여기에서 15, 20에서 설명하고 대표 결과 섹션에서와 같이 2 단계 지수 감쇠 함수를 사용하여 해당 소프트웨어 (예 : GraphPad 프리즘)와 GFR을 계산하기 위해 데이터를 분석합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

저자는 써모 피셔 과학으로 본 출판물의 비용을 충당하기 위해 자금을 받았다.

본 연구는 두 단계 지수 붕괴 8 혈액 샘플의 형광 단일 알약 주입 및 분석에 의한 의식 쥐 GFR의 결정을위한 방법을 설명합니다. 1 마우스 GFR 측정은 75 분 정도 소요. 특수 흐름 차트를 사용하여, 그것은 130 분의 6 생쥐의 GFR을 측정 할 수 있습니다. 그것은 하루 최대 4 시간이 흐름 차트 프로토콜을 반복하고 24 생쥐에서 GFR을 측정 가능합니다. 그것은 빠르고 조사관 꼬리 정맥 천자에 비해 수행하기위한 쉽게 작은 꼬리 싹둑보다는 꼬리 정맥 천자에서 혈액을 수집 할 수 있도록 우리는이 방법을 수정했습니다. 10 ㎕의 적혈구 모세 혈관 1:10 희석을 사용함으로써, &lt;100 μL에 필요한 혈액의 전체 양을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 형광 희석 시료의 1-2 μL에 형광 측정을 할 수 Nanodrop 분광 3300 fluorospectrometer를 사용하여 측정됩니다. 이 방법은 관심 investigato 줄 것이다라 실제 GFR 값입니다. 대조적으로, 마우스에있는 크레아티닌 측정은 &quot;크레아티닌 블라인드 범위&quot;를 특정하고 민감한 결정에 관한 문제 등 여러 가지 약점을 가지고 있습니다. 신장 기능의 50 %가 19 손실 될 때까지 혈청 크레아티닌이 정상 범위에 남아 있기 때문에 &quot;크레아티닌 블라인드 범위는&quot;GFR을위한 마커로 그 기능을 제한합니다. 유전자 X의 녹아웃 마우스를 가정하는 것은 야생형 마우스에 비해 상당히 낮은 GFR (40 %)이있을 것입니다 : 여러 연구자들은 신장 생리와 병태 생리를 연구하는 그들의 연구에서 유전자 변형 생쥐를 이용하기 때문에,이 같은 문제를 품는다 혈장 크레아티닌을 비교하여 간단한 검사는 이러한 차이를 감지하지 않을 것입니다. GFR 결정의 좋은 정확한 방법에 대한 필요성이 GFR의 차이가 작아 더 중요됩니다. 마우스 상업적 방해 자신의 혈장과 소변에서 비 크레아​​티닌 chromagens의 높은 농도가사용 가능한 크레아티닌 분석. 결과적으로, 플라즈마 알칼리성 picrate의 제피 반응 과대 크레아티닌 농도를 기반으로하는 분석은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 결정 6, 13와 비교. 또 다른 한계는 혈청 크레아티닌은 HPLC 결정에 비해 아래에 몇 가지 상업적으로 이용 가능한 분석의 검출 한계입니다. 그러나 효소 반응 조사를 사용하여 마우스 10, 22 플라즈마 크레아티닌를 확인할 수 있었다. 비슷한 범위에서 GFR이 유사한 단일 알약 주입 방법뿐만 아니라 소변 FITC - 이눌린 통관 14을 사용하여 의식 생쥐에서 발견되었다. 자신의 프로토콜과는 대조적으로, 꼬리 싹둑를 사용하여 우리의 프로토콜은 특별한주의가 꼬리 정맥 또는 복재 정맥 천자에 비해 혈관의 무결성을 유지하기 위해 필요하지 않습니다. FITC - 이눌린 기반 소변 / 혈장 클리어런스의 경우는 수술 두 삼투 마일을 이식 할 필요가있다nipumps. 두 펌프는 배경에서 명확하게 구별 충분히 높은 정상 상태 플라즈마 FITC - 이눌린 농도를 달성하기 위해 필요합니다. 이것은 또한 완전하고 초과 소변 수집을위한 신진 대사 케이지의 사용을 필요로합니다. 케이지 그렇지 않으면 세척없이 발생 FITC - 이눌린의 25-37%의 손실을 고려하여 세척해야합니다. 이 FITC - 이눌린 방법을 사용하는 함정이 제한됩니다. 조사자는 다음 사항에 유의해야합니다 (내가) FITC-솔루션의 주입에 사용되는 주사기에 기포가 없는지 보장, (ⅱ) 전체 구후 주사 주입 양이 계산 된 GFR을 결정하기 때문에 달성되어야하며 ( ⅲ) 쥐, 그래서 신장의 농도 능력의 결과로 매우 높은 FITC - 이눌린 농도해야합니다 소변과 혈액 샘플을 오염 75 분 GFR 실험을하는 동안 대부분 소변을 피할 것입니다. 일반 이점 오F이 FITC - 이눌린 방법은 다음과 같습니다 (나)는 (II)는 (III) 분석은 의식 생쥐에서 수행 할 수 있습니다, 같은 마우스에서 측정을 여러 번 반복 할 수있다, 비 방사능 기법이다 ( IV)가 더 소변 수집이 필요하지 않습니다, 그리고 (v) 높은 처리량 옵션을 활용할 수 있습니다. 단일 러스 주입 단점이 가능하고 특별한 소형 장치 (18)를 사용하여 transcutaneously 측정 할 수있는 더 나은 FITC 마커, FITC-sinistrin를 사용하여 극복 할 수 FITC - 이눌린의 투석에 대한 필요성을 포함합니다. GFR을 측정하더라도, 그것은이 방법으로 액체 또는 이온의 분수 배설물을 측정 할 수 없습니다. 함께 찍은,이 방법은 의식 생쥐에서 GFR 측정을위한 높은 처리량 방법의 가능성을 제공합니다. 따라서,이 기술은 쥐의 신장 기능을 결정에 관심이있는 다른 연구자에 대한 관심의 대상이 될 수 있습니다.

사구체에서 혈장 ultrafiltrate의 형성 속도는 신장 기능 (사구체 여과율, GFR) 평가의 기초가되었다. GFR을 결정하는 이상적인 마커는 자유롭게 여과 분비되거나 재 흡수 둘과 대사되지 않아야합니다. 이러한 동작은 이눌린에 대한 사실이 발견되었으며, 이눌린 통관 GFR 3의 결정을위한 황금 표준이되었습니다. 크레아티닌 클리어런스가 광범위 인간과 동물의 GFR의 척도로 사용되는 반면, 크레아티닌은 이상적인 GFR 마커의 요구 사항을 충족하지 않습니다. 약 10 - 인간의 크레아티닌 청소율의 40 %는 활성 세뇨관 분비 1, 11의 결과이며, 크레아티닌 신장 분비는 마우스와 쥐 4, 7, 9, 22에서 눈에 띄는입니다. 신기능 장애는 GFR 1, 2의 마커로 그 값을 제한 크레아티닌의 세뇨관 분비를 증가하는 것으로 알려져있다. 우리는 이전에 해당 유기 음이온 수송 이소를 보이고있다3 (OAT3)는 쥐 신장의 크레아티닌 분비 22에 기여한다. 하지만, 이눌린 통관은 일반적으로 방사성 표지 이눌린 (3 H, 14 C)의 사용을 필요로합니다. 이눌린의 방사능 측정은 마취와 의식 모​​두 생쥐에서 사용하지만, 다수의 안전 규정 및 방사성 동위 원소의 사용으로 인한 엄격한 처리 문제의 단점을 비호 할 수 있습니다. 그 라인을 따라, GFR의 결정에 대한 수술 통관 준비 시간이 소요뿐만 아니라 자연 단자입니다. 1999 년 로렌스 등. 12 마취 생쥐의 단일 네프론 GFR의 마커로 FITC - 이눌린을 소개했다. 5 년 후 치 등. 15 FITC - 이눌린을 사용하여 의식 마우스에서 전체 신장 GFR을 결정했다. 다른 프로토콜은 현재 의식 마취 생쥐에서 GFR을 측정하는 외생 적 마커로 FITC - 이눌린을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜은 형광 detecti를 사용하여 방사성 이눌린의 감도를 유지온 방사성 표지 마커 작업의 단점을 우회. FITC - 이눌린 분석은 Nanodrop 분광 3300 fluorospectrometer의 microvolume 기능을 활용하기 위해 다른 사람 7, 8, 우리 22, 23으로 바뀌 었습니다. 이 GFR 측정 당 &lt;100 ㎕의 혈액에 필요한 전체 샘플 볼륨을 줄일 수 있습니다. 방법이 문서에서 제공하는 높은 처리량 프로토콜로, 우리는 하루 최대 24 의식 생쥐에서 측정 GFR의 가능성을 보여줍니다. 이 기술은 쥐 GFR을 공부 다른 연구자에게 도움이 될 수 있고 우리는이 같은 크레아티닌과 혈액 요소 질소 등의 신장 기능 지표와 같은 덜 정확한 방법을 대체 할 수 있기를 바랍니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

사구체 여과율 (GFR)의 측정은 신장 기능 평가의 황금 표준입니다. 현재 연구자들은 내생 바이오 마커 크레아티닌 또는 외생 적 적용 방사성 표지 이눌린 (3 H, 14 C)의 수준을 측정하여 GFR을 결정합니다. 크레아티닌 ~ 50 총 신장 크레아티닌 배설 % 따라서 크레아티닌에 대한 근위 세뇨관 분비 계정을 신뢰할 수 GFR 마커 아니라고 상당한 단점이있다. 수행 된 실험에 따라 청소율이 정맥 하나의 알약 주입 또는 연속 주입 (정맥 또는 삼투 minipump)에 의해 결정될 수있다. 두 방법 모두 각각 혈장 또는 혈장과 소변의 컬렉션을 필요로합니다. 방사성 표지 이눌린의 다른 단점은 동위 원소의 사용, 동물의 시간이 소요되는 수술 준비 및 터미널 실험의 요구 사항을 포함한다. 여기에 우리의 하나의 알약 주입을 사용하는 방법을 설명형광 이소 티오 시아 네이트 - (FITC)로 표시 이눌린 및 희석 혈장의 1-2 μL에서의 형광 측정. 마우스 당 8 혈액 컬렉션으로, 두 구획 모델을 적용함으로써, 특수 작업 흐름 프로토콜을 사용하여 하루 24 생쥐에서 GFR을 측정 할 수 있습니다. 이 메서드는 비 구속하고 깨어 마우스에서 수집되는 모든 혈액 샘플로 간단 isoflurane을 마취가 필요합니다. 또 다른 장점은 몇 개월 치료 (즉,식이 변화, 약물 응용 프로그램과 쌍으로 실험을 수행)의 기간 동안 쥐를 따라 할 수 있다는 것입니다. 우리는 측정 GFR이 기술은 마우스 신장 기능을 공부 다른 연구자에게 유용하고 혈장 크레아티닌과 혈액 요소 질소 등의 신장 기능을 추정 덜 정확한 방법을 대체 할 수 있기를 바랍니다.

GFR은 다음과 같은 공식을 사용하여 계산됩니다 : GFR = N / (A/K1 + B/K2), 여기서 N = 주입 양 (N = C • V, 여기서 C = FITC - 이눌린 농도, V = 주입 부피) A = Span1는 제거의 y 절편 제거를위한 상수 K1 = 붕괴 B = Span2, y 절편 분포 배포 K2 = 붕괴 상수 주 : A, K1, B와 K2는 GraphPad 프리즘, 두 단계 지수 붕괴를 분석 할 수있는 모든 소프트웨어에 의해 제공 약어이다를 사용할 수 있지만, 다른 과학 소프트웨어는 다른 약어를 사용할 수 있습니다. 플라즈마 FITC - 이눌린 농도를 기반으로 2 단계 지수 감쇠 곡선 맞춤을 채용하여, 그림 1에 표시된 것과 유사한 곡선을 얻을 수 있어야합니다. 위와 같이 식 (에 의해 GFR을 계산하고, 여기에 설명 &lt;)&gt; 20 한모금은 제 1 형 당뇨병 (그림 2)와 생쥐에서 발견 신장 기능 15 사구체 hyperfiltration 8, 23의 손상을 감지 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> 그림 1. 의식 생쥐에서 GFR을 측정하기 위해, 단일 복용량 정맥 주사 후 FITC - 이눌린의 플라즈마 동역학이 사용됩니다. GFR 계산을 위해, 두 구획 모델이 사용됩니다. 두 구획 모델에서 초기 급속한 붕괴 단계는 세포 외액에 혈관 구획에서 FITC - 이눌린 재배포를 나타냅니다. FITC - 이눌린 농도 느린 붕괴와 이후 단계는, 주로 혈장에서 조직의 허가를 반영합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> 그림 2. DetectioN 야생 형 생쥐의 당뇨병 hyperfiltration의. 당뇨병은 (STZ, 5 일 연속 50 ㎎ / ㎏) 스트렙토 조 토신으로 복강 내 응용 프로그램에 의해 유도 된 I를 입력합니다. GFR은 전 (기초)와 오주 당뇨 유도 후 결정되었다. tubuloglomerular 피드백으로 인해, 근위 재 흡수의 주요 증가가 초기 당뇨병 hyperfiltration 21 야생형 생쥐에서 재현 연구 결과가 발생합니다 (N = 10, p &lt;0.01 대 기초 같은 마우스). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> 그림 3. 6 마우스 세트 GFR 측정. 하나의 알약 주입 방법으로 전체 신장 사구체 여과율을 측정하기위한 흐름도는 8 혈액 샘플은 10, 15, 35, 56 및 75 분 후, 7, 3, 5에서 수집해야합니다 FITC - 이눌린 주입. 숫자는 시점을 나타냅니다. 괄호 안의 숫자는 표본 수를 나타냅니다. 빨간색 세로 줄의 왼쪽 시점 주입을 나타냅니다시간 포인트 (0에서 11, 22, 33, 44, 55 분). 각각의 마우스는 다른 색으로 표시됩니다. 연속 혈액 컬렉션을 얻으려면 화살표를 따르십시오. 회색 상자 옆에 마우스를 주입하기 전에 isoflurane을 마취에 대한 준비를해야 할 때 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면 다른 마우스에서 2 혈액 컬렉션 사이의 최소 시간은 1 분입니다.

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A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

사구체 여과율 (GFR)의 측정은 신장 기능 평가를위한 황금 표준입니다. 여기서 우리는 두 단계 지수 붕괴 모델 플라즈마 GFR의 계산에 하나의 알약 주입, 형광 이소 티오 시아 네이트의 결정 (FITC) 이눌린을 사용하여 의식 쥐 GFR의 결정을 허용하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.1K 조회수.  University of California, San Diego. 사구체 여과율 (GFR)의 측정은 신장 기능 평가를위한 황금 표준입니다. 여기서 우리는 두 단계 지수 붕괴 모델 플라즈마 GFR의 계산에 하나의 알약 주입, 형광 이소 티오 시아 네이트의 결정 (FITC) 이눌린을 사용하여 의식 쥐 GFR의 결정을 허용하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

비디오: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

연구

생물학

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

생리학 실험실 데모 : 쥐의 사구체 여과 속도

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...