Name: an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
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저자는 Sphingonet 컨소시엄이이 작업을 지원 하기 위한 Leduq 기초에 의해 투자를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 또한 "혈관 차별화 및 리 모델링" 공동 연구 센터에 의해 지원 되었다 (CRC / Transregio23, 프로젝트 C1)와 7. FP, COFUND, 괴테 국제 Postdoc 프로그램 이동-IN, No. 291776 자금. 우리 더 처리 및 유전형 캐슬 린 서머를 한 쥐와 그녀의 기술 지원에 대 한 인정합니다.

모든 동물은 절차 동안 통증이 나 불편을 최소화 하는 최대 관심을가지고 처리 합니다. 이 절차 우리 기관의 동물 보호 지침을 다음과 같이 하 고 지역 위원회 (Regierungspraesidium 다름슈타트, 승인 번호 FK/1044)에 의해 승인 되었습니다.
침투성 시험 쥐에서 vivo에서 에 대 한 작업 단계의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 각 단계의 자세한 내용은 아래 설명 되어 있습니다.
1입니다. 동물 처리
<ol><li>
준비 및 추적기 및 마 취약의 관리
	<ol>
<li>침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 10쥐의 유전형을 수행 합니다. 참고: 80% 알코올 살 균 계기 초래 하지 것입니다 있지만 준비 샘플의 오염을 최소화 됩니다.</li>
		<li>2mm 주식으로 메 마른 PBS에 모든 추적기를 희석 하 고-20 ° c.에 빛에서 보호 하는 aliquots를 저장</li>
		<li>(Tetramethyl Rhodamine) TMR 같은 추적기를 선택 하 고 (fluorescein isothiocyanate) 고유 여기/방출 스펙트럼과는 FITC는 리 형광 현미경 검사 법에 의해 모두 염료 간의 최소한의 간섭 결과로 고칠 수 (는 TMR을 사용 하 여 또는 FITC 각각 필터)와 fluorometry 침투성 분석 결과 대 한 플레이트 리더에 의해. 참고: TMR dextran 3 kD FITC dextran 3 kD는 연구에 사용 된 두 리 고칠 수 및 따라서 사용 될 수 있는 또한 알데하이드와 immunohistochemical 분석 후 고정 지역 차이 조사 하기 위하여.</li>
		<li>최대한 주의 기관 관리 지침에 따라 모든 동물을 처리 합니다. 추가 추적 프로그램 1:1 믹스10,13의 각 추적기의 100 µ L를 사용 하 여 결합 될 때 200 µ L까지 증가 될 수 있다 100 µ L 추적 솔루션으로 intraperitoneally 각 마우스를 주사. 혼자 autofluorescence 배경 빼기에 대 한 가짜 제어 역할을 추적기 대신 PBS를 가진 하나 이상의 동물을 주입.</li>
		<li>추적 프로그램 삽입 후 5 분 anesthetize i.p 주사 마 취 제 및 Xylazine를 가진 동물 (100 mg과 5-10 밀리 그램 0.9%에서 염 분 당 킬로그램 몸 무게 각각, 150 µ L 당 25 g 마우스 칵테일의). 참고: 수 의사 연 고는 적용 되지 눈에 절차 동안 동물 마 취과 관류/희생 사이 기간 이었다 짧은 (10 분) 관찰 되지 있던 모든 눈의 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈액 수집 및 심장 관류
	<ol>
<li>동물 마 취 관리 후 심장 관류 10 분에 대 한 준비. 동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다 수 있도록 발 트 위치 응답의 부재를 확인 합니다.</li>
		<li>그들의 뒤에는 동물을 80% 에탄올 복 부의 피부에 적용. 바로 흉 곽 아래에 작은 절 개 (2 cm)와 복 벽을 열어 작은 위를 사용 하 여. 횡 경 막에서 간 고 천천히 횡 격 막 흉 막 캐비티 15노출 극복 합니다.</li>
		<li>양측 흉 곽을 잘라 고 왼쪽된 심 실 노출 하려면 컷된 흉 골을 해결. 좌 심 실의 뒷부분에 연동 관류 시스템에 연결 된 21-게이지 나비 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>오른쪽 아 트리 움 펑크와 신속 하 게 (10 s) 혈 청 컬렉션 튜브에 혈액 1 mL 피 펫 팁 (최종 마감)를 사용 하 여 흉 강에 발표의 200-300 µ L를 수집 하 고 얼음에 저장. 참고:이 관류 절차는 비 생존.</li>
		<li>즉시 혈액 수집 관류 시스템 (10-12 rpm, 5 mL/min)에 전환 하 고 따뜻한 (RT) 1 x PBS로 3 분에 대 한 동물을 perfuse (Ca의 무료2 +Mg2 + 이온). 참고: PBS 포함 캘리포니아2 +/Mg2 + 이온 활용할 수 있습니다 더 나은 심장 활동에는 관류 동안. PBS 관류에 대 한 사용의 총 금액은 15 ~ 20 mL의 범위입니다.</li>
		<li>간, 색상을 지적 함으로써 관류 품질 평가 신장 관류 후 화이트/창백을 표시. 참고: 신장 또는 간 관류 반드시 나타내지 않습니다 뇌 관류로 동맥 (경 동맥/척추) 도달 뇌 대동맥에서 특히 심 방 찔린 중 3 단계에서 준비 하는 동안 파열 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 조직 처리
<ol><li>장기 수집 및 저장
	<ol>
<li>관류의 끝에, 자 궁 경부 전위 및 수확 뇌와 신장에 의해 동물의 죽음을 확인 합니다. 관류 품질은 좋은 동물 침투성 분석에서 제외 되므로 뇌 관류 (meninges의 혈관에서 보이는 혈액), 머리의 색깔에 의해 확인 합니다. 메스 (그림 1)를 사용 하 여 2 hemibrains로 두뇌를 구분 합니다.</li>
		<li>후 엽과 소 뇌의 무료 메스 한 hemibrain와 dissect 그리고 2 mL 튜브에는 hemicerebrum를 전송. 소 뇌 침투성 평가에 필요한 경우 추가 튜브에 헤 미-소 뇌를 저장 합니다.</li>
		<li>다른 2 mL 튜브에 단일 신장 전송. 드라이 아이스에 샘플을 즉시 저장 합니다.</li>
		<li>기본적으로 나머지 신장과 hemi-뇌 (소 뇌와 후 엽으로 구성 된)에 포함 조직-테크 최적의 절삭 온도 (O.C.T) 드라이 아이스에 화합물.</li>
		<li>결국, 원심 10, 000g, 4 ° c.에서 10 분에 혈 청 컬렉션 튜브에 얼음에 저장 된 혈액 샘플 1.5 mL 튜브에 혈 청 supernatants 전송 및 드라이 아이스 컨테이너에 넣어.</li>
		<li>추가 처리까지-80 ° C 냉장고를 드라이 아이스에 수집 된 모든 샘플을 전송 합니다. 참고: 그것은 녹고 동결로 후 균질 효율성 증가로 균질 단계를 진행 하기 전에 샘플을 동결 하는 것이 중요입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>균질 및 원심 분리
	<ol>
<li>Hemi-뇌와 신장 샘플 다운-80 ° C에서 냉동 얼음에 thaw와 장기를 포함 하는 튜브를 무게. 이러한 무게에서 조직 무게를 여러 빈 관 (약 20)의 평균 값을 뺍니다. 추가 300 µ L 및 감기 1의 200 µ L 신장과 hemi-뇌, 각각 포함 된 튜브에 X PBS. 참고: (헤 미-소 뇌, 100 mg 아래) 같은 조직의 낮은 금액에 대 한 개별 튜브의 무게는 것이 좋습니다.</li>
		<li>소계 (PTFE) 유 봉 약 15 스트로크를 수행 하 여 전기 오버 헤드 교 반기 (1, 000 rpm)에 연결 된과 원래 eppendorf 관에서 각 샘플을 균질 (1 스트로크 = 1 및 1 다운). 샘플 사이 PBS 가진 유 봉 헹 구 고 닦아 다음 예제를 진행 하기 전에 건조. 참고: 균질 동안 세제의 사용 했다 fluorometry 잠재적인 간섭으로 인해 피할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜에 세포내 추적 감지 또한 조직을 철저 하 게 균질 한 라운드의 동결 해 동 후는 더 효율적으로.</li>
		<li>빛과 15000 g, 20 분, 탁상 원심 분리기에 4 ° C의 끝에 모두 함께 원심 분리기에서 보호 하는 얼음에 무 균된 샘플을 저장 합니다. 즉각적인 fluorometry 또는 나중에 분석할 수-80 ° C에서 얼음에 새로운 1.5 mL 튜브 supernatants 전송.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 측정 및 정량화
	<ol>
<li>이전 단계의 끝에 동결 조직 상쾌한 및 혈 청 샘플은 호 일 빛에서 그들을 보호 하는-80 ˚C에 저장 된 얼음에 녹여.</li>
		<li>384 잘 검정 잉크 판으로 희석된 혈 청 (30 µ L 1 x PBS + 20 µ L 세럼) 또는 (있는 그대로) 조직 supernatants의 50 µ L 플라스틱. 이 조직 homogenate 배경 일반적으로 희석제로 사용 하는 PBS의 이상으로 혈 청 및 조직의 supernatants 적절 한 배경 빼기를 보장 하기 위한 가짜 동물에서 적어도 하나의 샘플을 포함 합니다. 참고: 3 가짜 동물의 평균 비록 가짜 autofluorescence 값 (데이터 표시 되지 않음)에 아주 작은 변화 관찰 되었다 autofluorescence에 대 한 사용할 수 있습니다. PBS, 또한 뇌 샘플 같은 낮은 형광 샘플에 대 한 신호 대 잡음 비 증가 수와 그것을 diluting 하 여 혈 청 사용의 금액을 줄일 수 있습니다. 최대 10 µ L 세럼 40 µ L PBS와 그것을 diluting 테스트를 했다. 아니 거품 우물에 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>384 잘 블랙 플레이트 플레이트 판독기에 삽입 하 고 형광 측정을 선택 하는 새로운 스크립트를 엽니다.</li>
		<li>최적 이득을 설정 하 고 각각 TMR 또는 FITC dyee에 대 한 550/580 또는 490/520 여기/방출 (nm) 값을 사용 하 고 원시 형광 단위 (RFUs)를 측정 시작.</li>
		<li>플레이트 리더에서 원시 형광 단위 (RFUs)를 사용 하 여 해당 하는 가짜 값을 뺀 후 침투성 색인 (PI) 계산.<ol>
<li>
* 침투성 인덱스 (mL/g) = (조직 RFUs/g 조직 중량) / (혈 청 RFUs/mL 혈 청)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>예제 계산 뇌 침투성 색인 (PI)에 대 한 동물 GOF1의 (표 1).<ol>
<li>GOF1 RFUs-가짜 뇌 RFUs 뇌 = 154-22.5 131.5 =</li>
			<li>GOF1 혈 청 RFUs-가짜 혈 청 RFUs 38305-27 = = 38278</li>
			<li>뇌의 무게 (g) = 0.195</li>
			<li>혈 청 볼륨 (ml) = 0.02</li>
			<li>뇌의 침투성 인덱스 (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 참고: 침투성 인덱스 계산 항복 값을 절대 및 실험 및 조직 유형 사이 비교. 그러나 이들은 2 그룹 12사이 비교의 용이성에 대 한 비율으로 제시 될 수 있습니다. 이 두 그룹에 각 동물의 PI 1 아직 유지 간 동물 변형 제어 그룹에서 통해 컨트롤 그룹 평균 운전 제어 그룹의 평균 PI와 함께 나누어 얻을 수 있습니다. 이 변화는 1로 설정 하는 컨트롤 그룹을 기준으로 실험 그룹 (또는 그룹)에 대 한 값을 제공 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>추적의 면역 형광 시각화
	<ol>
<li>10 µ m는 cryostat에 섹션-20 ° C로 설정 하 고 실내 온도 슬라이드 섹션을 전송으로 조직-테크 화합물 (O.C.T) (2.1 단계)에 기본적으로 포함 된 신장/hemi-두뇌 블록을 잘라. 섹션은 일단 말리 면 (약 30 분), 전송 슬라이드-80 ° C 냉동 고 사용까지.</li>
		<li>얼룩이 지기의 날, 10 분 동안 37 ° C에서 슬라이드를 해 동 하 고 PBS에서 빠른 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaladehyde (PFA)와 섹션을 수정.</li>
		<li>Permeabilization/차단 버퍼 1 %BSA 및 0.5% 트라이 톤 X-100 pH 7.5 실 온에서 1 h 포함 된 살 균 PBS의에서 섹션을 품 어.</li>
		<li>CD31 1 차 항 체로 상 온에서 1.5 h에 대 한 슬라이드를 품 어 (0.5 mg/ml, 멕 13.3 복제), 트라이 톤 X-100 (pH 7.2) PBS에 3 5 분 세척 뒤 살 균 PBS, 0.5% BSA 0.25%를 포함 하는 버퍼에 1: 100에 희석.</li>
		<li>수행 이차 항 체 외피 종의 함께 실 온에서 1 h 대 위의 버퍼 붙일 항 체 희석된 1: 500 (2 mg/mL)를 표시 합니다. CD31에 대 한 염소 반대로 쥐 알 렉 사 568 또는 알 렉 사 488 1: 500의 희석에 사용할 수 있습니다. DAPI를 포함 (300 μ M) 이차 항 체는 핵에 대 한 얼룩 (1:1, 000 희석 주식에서) 혼합.</li>
		<li>아쿠아 polymount와 스테인드 섹션을 탑재 하 고 어둠 속에서 실 온에서 중 합에 대 한 그것을 떠나 하룻밤.</li>
		<li>스펙트럼 영상 confocal 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. NIS 요소 소프트웨어 (버전 4.3)에 의해 이미지를 분석 합니다. 몽타주 그림의 생성을 위해 포토샵과 같은 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells.">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li><li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose.">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li><li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier.">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

혈액-뇌 장벽 부전 기본 및 보조 뇌종양 이나 뇌졸중 등 신경 성 질환의 숫자와 연결 됩니다. BBB 붕괴는 종종 CNS 부 종 생명이 연결 됩니다. 트리거 오프닝 분자 메커니즘의 해명 또는 BBB의 폐쇄는 그러므로 신경 장애 그리고 일반적으로 치료 의미의 조사 연구자에 의해 있다. 그러나, 조사 하는 방법을 문학에서 보고 된 BBB 침투성에서 vivo에서 수시로 연관 된다 형광 이미지17</su...

Microvascular 내 피 세포 (ECs)는 ensheathed 기저 lamina에, 밀접 하 게 관련 된 pericytes (Pc), 및 지하실 막의 끝 발1 봉투 이다 (ACs)에서 지 원하는 이루어져 혈액-뇌 장벽 (BBB) ,2. 여러 셀 형식을 지원 하 고 규제 장벽 기능을 주로 ACs 및 Pc, 상호 작용 하는 ECs 그리고 또한 신경 및 microglia, 모두는 함께 형성 neurovascular 단위 (NVU). NVU는 BBB는 혈액을 매개로 독 소 및 두뇌에 들어가기에서 병원 체의 전송 제한 기능에 대 한 중요 합니다. 이 함수는 ECs 사이 p-당단백질 (P-gp) 그 경과 분자 endothelium 입력으로 다시 같은 전송기의 작용으로 인해 claudin-5, occludin, zonula occludens-1, 꽉-접합 분자의 결과 선박 루멘1,2,3. 그러나 BBB는 영양분 (포도 당, 철, 아미노산) 등 필수 분자의 수송에 대 한 특정 전송기 EC 플라즈마 막1,,23에 의해 수 있습니다. EC 레이어 luminal (혈액 연결)와 abluminal (뇌 연결 막) 대 한 구체적이 고 vectorial 전송 기능4,5 수 있도록 다양 한 전송기의 분포에 관하여 매우 편광은 . BBB 단단히 CNS 환경 규제에 대해 보호 하는 동안, CNS 약물 전달 기능 BBB와 파 킨 슨 등 질환에 대 한 주요 도전 이다. BBB 장애와 신경 질환에도 장벽 부전 손상 Alzheimer의 질병 (광고)에서 예를 들어 특정 전송 대상에 포함 될 수 있습니다 때문에 특히 두뇌 약물 전달 증가 추측 될 수 없다. 광고에서 LRP1, 분노, P-gp 등 여러 가지 아 밀 로이드 베타 전송기 dysregulated 것으로 알려져 있습니다 하 고 쓸데6,,78수 있습니다 따라서 이러한 전송기를 대상으로 합니다. BBB는 획, 광고, 수 막 염, 다 발성 경화 증 및 뇌 종양9,,1011등 여러 신경 질환에 손상 이다. 장벽 기능 복원 치료 전략의 중요 한 부분 이며 따라서 그 평가 중요 한.
이 작품에서는, 우리는 설명 된 객관적이 고 침투성 분석 결과 우리가 성공적으로 적용할 여러 마우스 라인 모두 실험과 유전자 변형 질환 모델10,12,13 설치류에 대 한 양적 프로토콜 ,14. 방법은 혈관 칸막이 추적기를 제거 뒤에 쥐의 관류 형광 추적기의 간단한 복 주사를 기반으로 합니다. 뇌 및 기타 장기 수집된 게시물 관류 및 침투성 객관적인 평가 절대 침투성 인덱스 플레이트 리더에서 조직 homogenates의 형광 측정에 따라 있습니다. 모든 원시 형광 값 조직 homogenates 또는 어떤 추적 프로그램에는 영향을 받지 않는 가짜 동물에서 혈 청을 사용 하 여 배경색을 수정할 수 있습니다. 충분 한 정규화 세럼 볼륨, 혈 청 형광, 및 조직, 따라서 저조한 침투성 인덱스를 완전 하 고 실험 및 조직 유형 사이 비교의 무게에 대 한 포함 되어 있습니다. 그룹 사이 비교의 용이성, 절대 침투성 인덱스 값 수 쉽게 변형 될 비율을 우리12이전 수행 했다. 동시에, 저장 된 hemi-두뇌와 신장 수 활용할 수 추적 프로그램 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법10. 고전적인 형광 현미경 검사 법 이기는 하지만 조직 단면도 및 반 정량 분석에 대 한 이미지의 주관적인 선택으로 인해 성가신 침투성에 지역 차이 얻기에 중요 한 될 수 있습니다. 자세한 단계는 프로토콜에서 제공 됩니다 그리고 적절 한 노트 추가 됩니다. 이 성공적으로 다른 작은 동물을 확장할 수 있는 쥐에서 vivo에서 침투성 시험을 수행 하기 위한 필요한 정보를 제공 합니다. 분석 결과 추적기의 많은 종류에 적용 될 수 있습니다 추적기와 독특한 형광 스펙트럼의 조합에 의해 침투성 평가 기반으로 책임과 크기에 대 한 허용.

<table><tbody><tr><td>Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldhehyde solution</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>prepare a 4% solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21-gauge butterfly needle</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>serum collection tube</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL eppendorf tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech precision wipes tissue wipers</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384-well black plate</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>slides superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE pestle</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>electric overhead stirrer</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltic perfusion system</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers

혈액-뇌 장벽 (BBB) 두뇌 microenvironment 독 소 및 순환에 있는 병원 체에서 보호 하 고 두뇌 항상성 유지 하는 특수 방 벽 이다. 방 벽의 주요 사이트는 그 장벽 기능 꽉 세포 접합 및 원형질 막에 경과 전송기에서 결과 뇌 모세 혈관의 내 피 세포. 이 함수는 pericytes와 함께 혈관 단위 (NVU)를 형성 하는 이다 통제 된다. Alzheimer의 질병 (광고), 등 여러 신경 질환 뇌종양 장애인된 BBB 기능으로 연결 됩니다. BBB 침투성의 평가 중요 한 신경 질환의 심각도 및 고용 치료 전략의 성공에 따라서.
우리는 현재 여기 간단한 아직 강력한 침투성 분석 결과 여러 가지 마우스에 성공적으로 적용 된 둘 다, 유전과 실험 모델. 방법은 매우 양적이 고 일반적으로 적용 되는 현미경에 의해 추적 형광 분석에 비해 객관적입니다. 이 방법에서는, 마우스는 쥐 마비 뒤 수성 불활성 형광 추적기의 믹스와 함께 intraperitoneally 주입 수 있습니다. 동물의 심장 관류 뇌, 신장 또는 다른 장기 수확 전에 수행 됩니다. 장기 무 균 및 centrifuged는 상쾌한에서 형광 측정에 의해 따라. 혈액 관류의 바로 전에 심장 펑크에서 그려진 혈관 칸막이를 정규화 목적을 위해 제공 합니다. 조직 형광은 양적를 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 추적 침투성 색인. 추가 확인, contralateral hemi 두뇌 immunohistochemistry 보존 추적 형광 시각화 용도로 활용할 수 있습니다.

우리는 최근에 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) 마우스 건강 조건10제어 마우스 보다 더 높은 두뇌 혈관 침투성을가지고 나타났습니다. 뇌졸중 유발 쥐에서 그것은 또한 쇼 프 쥐 했다 더 큰 경색 크기와 제어 littermates 보다 큰 침투성. 이러한 결과 BBB에 침투성에 중앙 2의 중요 한 역할을 보여 줍니다. 따라서 프로토콜 GOF 마우스를 활용 하 고 비보에</...

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An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

24.4K 조회수.  Goethe University Hospital. 여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

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Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

연구

암 연구학

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

의학

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

신경과학

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

면역학 및 감염병학

<meta charset="utf8"></head><body>마우스의 혈액-뇌 장벽 파괴에 대한 형광 염료 기반 시각화

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the endothelial barrier dysfunction is related to many salivary gland secretory disorders. The present protocol describes an in vivo paracellular permeability detection method to evaluate the function of endothelial tight junctions (TJs) in mouse submandibular glands (SMG). First, fluorescence-labeled dextrans with different molecular weights (4 kDa, 40 kDa, or 70 kDa) were injected into the angular veins of mice. Afterward, the unilateral SMG was dissected and fixed in the customized holder under a two-photon laser-scanning microscope, and then images were captured for blood vessels, acini, and ducts. Utilizing this method, the real-time dynamic leakage of the different-sized tracers from blood vessels into the basal sides of the acini and even across the acinar epithelia into the ducts was monitored to evaluate the alteration of the endothelial barrier function under physiological or pathophysiological conditions.

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In the present protocol, the endothelial barrier function of the submandibular gland (SMG) was evaluated by injecting different molecular weighted fluorescent tracers into the angular veins of test animal models in vivo under a two-photon laser-scanning microscope.

생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

생물학

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of plasma inflammatory markers and bacterial translocation to the spleen and lymph nodes, the gold standard directly quantifies the ability of selected molecules to traverse the gut mucosal layer toward systemic circulation. This article uses a non-invasive, cost-effective, and low-burden technique to quantify and follow in real time the intestinal permeability in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran (FITC-dextran). Prior to oral supplementation with FITC-dextran, the mice are fasted. They are then gavaged with FITC-dextran diluted in phosphate-buffered saline (PBS). One hour after the gavage, the mice are subjected to general anesthesia using isoflurane, and the in vivo fluorescence is visualized in an imaging chamber. This technique aims to assess residual fluorescence in the abdominal cavity and the hepatic uptake, which is suggestive of portal migration of the fluorescent probe. Blood and stool samples are collected 4 h after oral gavage, and the mice are sacrificed. Plasma and fecal samples diluted in PBS are then plated, and the fluorescence is recorded. The concentration of FITC-dextran is then calculated using a standard curve. In previous research, in vivo imaging has shown that fluorescence rapidly spreads to the liver in mice with a weaker gut barrier induced by a low-fiber diet, while in mice supplemented with fiber to strengthen the gut barrier, the fluorescent signal is retained mostly in the gastrointestinal tract. In addition, in this study, control mice had elevated plasma fluorescence and reduced fluorescence in the stool, while inversely, inulin-supplemented mice had higher levels of fluorescence signals in the gut and low levels in the plasma. In summary, this protocol provides qualitative and quantitative measurements of intestinal permeability as a marker for gut health.

In the present study, fluorescein-isothiocyanate-labeled (FITC) dextran is administered to mice via oral gavage to evaluate intestinal permeability both in vivo and in plasma and fecal samples. As gut barrier function is affected in many disease processes, this direct and quantitative assay can be used in diverse research areas.

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

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FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가